Summary
CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.
Introduction
Il a été connu depuis de nombreuses années que les suppressions ou des copies supplémentaires de segments chromosomiques causent une déficience intellectuelle, une dysmorphie et des malformations congentical, et dans certains cas provoquer des syndromes génétiques 1. Cependant, la seule technologie disponible jusqu'au milieu des années 2000 pour la détection du génome entier de ces changements était G-bandes analyse des chromosomes, qui a une résolution de l'ordre 5-10Mb, selon la région et la nature du déséquilibre, et qui ne peut pas détecter chromosomes anormaux où la matière a été remplacé par une région d'un chromosome différent avec le même motif de bandes. Techniques cytogénétiques auxiliaires tels que l'hybridation fluorescente in situ et multiplex sonde amplification spécifique de ligature en ont été disponibles pour l'interrogation des loci spécifiques, en cas de suspicion déséquilibre syndromique spécifique, mais ce ne est que l'introduction d'hybridation génomique comparative (CGH array) en s diagnostic clinique de routineervice 2-5 que la détection du génome entier du nombre de copies variantes (CNV) est devenu possible à une résolution considérablement augmenté (généralement autour de 120kb). Travaux de service clinique parallèlement à des études de recherche ont montré que CNV pour certaines régions sont très répandues dans la population normale 6-7, tandis que d'autres CNV, auparavant indétectable, sont associés à neurodisabilities comme l'autisme et l'épilepsie 8-11.
Le protocole décrit dans ce document est utilisé dans notre laboratoire de diagnostic clinique UK National Health Service (NHS); nous utilisons de nouvelles stratégies d'hybridation, les tests par lots et de la robotique de minimiser les coûts de ce service financé par l'Etat.
Avant le protocole détaillé ci-dessous, l'ADN de haute qualité doit être extraite de la matière de départ appropriée, habituellement du sang, des cellules cultivées ou des échantillons de tissus. Spectrophotométrie peut être utilisé pour mesurer la concentration (devrait être> 50 ng / ul) et vérifier 260: 280 rapports d'absorbance (b devraite 1,8 à 2,0). L'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour vérifier que l'ADN soit de haut poids moléculaire sans dégradation significative.
Ce protocole est conçu pour les laboratoires de débit plus élevés qui sont étiquetage 96 échantillons par exécution à l'aide automatisés robotique de manipulation de liquides. Cependant, il peut être adapté pour les laboratoires de débit inférieurs sans automatisation.
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Protocol
1. L'étiquetage Réaction
- Avant d'utiliser, dUTP pré-aliquote cyanine 3 et 5 nucléotides marqués, non marqués et des amorces aléatoires aux concentrations recommandées par le fabricant et magasin en plaques à 96 puits à -20 C prêt à l'emploi. Pour les fins de ce protocole, aliquote 10,5 pi de la dUTP marqué de appropriée et 10,5 ul nucléotides non marqués et des amorces aléatoires à chaque puits.
- Décongeler la plaque prête à l'emploi de 96 puits de nucléotides et des amorces à 4 ° C pendant environ 1 heure, à l'abri de la lumière.
- Une fois décongelé, équilibrer cette plaque à température ambiante pendant au moins 30 min, à l'abri de la lumière.
- Equilibrer échantillons d'ADN à 60 ° C pendant au moins 15 min.
- L'utilisation d'un robot de manipulation liquide, distribuer de l'eau sans nucléase à chaque puits d'une plaque de 96 puits.
NOTE: Le volume d'eau dépendra de la concentration de chaque échantillon d'ADN d'entrée et doit être suffisante pour donner une concentration finale de 50 ng / ul. - Utilisation d'un liquide hanmani- robot, pipette 1 ug d'ADN dans un puits de la plaque à 96 puits (voir 1.5) pour porter le volume total à 20 ul.
NOTE: quantités d'ADN inférieures peuvent être utilisés même si la qualité des données qui en résulte peut être compromise (pour les échantillons précieux, les quantités d'ADN d'entrée vers le bas à 400 ng peuvent être utilisés). - En utilisant un robot de manipulation de liquide, transférer 20 pi de nucleotides et des amorces équilibrée dans chaque puits de la plaque de l'ADN dilué.
- Sceller la plaque 96 puits avec des bouchons de bande (un joint étanche est essentiel).
- Dénaturer l'ADN à 99 ° C pendant 10 min dans une machine PCR avec un couvercle chauffé et puis enclenchez refroidir sur glace pendant 5 min à des amorces de recuit.
- L'utilisation d'un robot de manipulation de liquide, ajouter 10 pi de l'ADN Klenow Exo enzyme polymérase ADN à chaque pipette et mélanger soigneusement.
NOTE: Le volume total devrait être de 50 pi. - Sceller la plaque à 96 puits et incuber à 37 ° C pendant 16 heures.
REMARQUE: Une incubation plus courte de 4 heures est suffisante cependant un O / N danscubation peut être plus pratique. - En utilisant un robot de manipulation de liquide, ajouter 5 ul de tampon d'arrêt à chaque puits.
REMARQUE: Un résumé des réactifs utilisés pour la réaction de marquage est indiqué dans le Tableau 1.
2. Suppression non constituées en nucléotides
- Retirer nucléotides non constituées en société en utilisant la silice-membrane à base de colonnes de spin et un robot de spin de traitement de la colonne dédiée (les colonnes de spin peuvent également être traitées manuellement). Suivez les instructions du fabricant.
- Transférer le contenu de chaque puits dans un tube de 2 ml; pré-label-ci avec ID et de.
REMARQUE: Cette étape peut être réalisée manuellement ou de préférence en utilisant un robot de manipulation de liquide. - Si l'on utilise un robot de traitement de colonne de centrifugation, puis charger le robot avec 2 ml des tubes, des colonnes de centrifugation de purification de l'ADN et des tampons associés.
- Ajouter 250 ul de haute teneur en sel, tampon de liaison (tampon PB) l'ADN à la réaction de marquage pour lier l'ADN marqué à la silicemembrane.
- Éliminer les impuretés en lavant la membrane deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (tampon PE).
- Ajouter 15 pi de tampon d'élution faible de sel (tampon EB) à la membrane pour récupérer l'ADN purifié, marqué dans un volume de ~ 12 ul.
- Transférer le contenu de chaque puits dans un tube de 2 ml; pré-label-ci avec ID et de.
3. Mélanger Paires Hyb
- Combiner les paires appropriées de la cyanine 3 et 5 de l'ADN marqué, COT-1 ADN, un mélange de blocage fourni par le fabricant et un tampon d'hybridation fourni par le fabricant en utilisant un robot de manipulation de liquide.
NOTE: Ces paires Hyb peut être un échantillon et une référence, ou un échantillon vs échantillon si CNV partagé ne sont pas un problème (par exemple, nous jumelons régulièrement des échantillons de phénotype correspondent pas, comme une dysplasie des patients rénale vs un patient de craniosténose, car ils sont très peu probable pour transporter le même cliniquement significative CNV). Si l'on utilise un ADN de référence, une source d'ADN du commerce est recommandée, et il doit être traité le long de l'échantillon.- Utilisation d'une manipulation de liquides robot, ajouter COT-1 ADN (3333 ng / ul), le fabricant fournies blocage mélange et un tampon d'hybridation à chaque puits d'une plaque à 96 puits de sorte que chaque puits contient 1,1 ul COT-1 ADN, 4,95 ul de mélange de blocage et 24,75 ul du tampon d'hybridation.
- Ajouter 9,35 ul de l'ADN approprié cyanine 3-marqué dans chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage.
- Ajouter 9,35 ul de l'ADN approprié cyanine 5 marqué à chaque puits. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage.
- Sceller la plaque à 96 puits et vortex pendant 1 min. Faites tourner la plaque à 96 puits pour recueillir le contenu au fond de chaque puits.
4. Hybridation
- Préchauffer un four à hybridation à 65 ° C et préchauffer une diapositive de support et une chambre d'hybridation pour chaque diapositive de tableau.
- Dénaturer l'ADN marqué à une pré-incubation avant l'hybridation étant à appliquer sur les tableaux. Effectuer une hybridation dans un four rotatif pendant 24 heures.
- Incuber la plaque à 96 puits à 70 ° C pendant 30 minutes, puis laisser à 37 ° C pendant au moins 5 min.
- Travailler sur une plate-forme chauffée à 42 ° C, charger la sauvegarde chaque diapositive dans une chambre d'hybridation avant de l'utiliser. Assurez-vous que la partie transparente de la lame de joint se aligne avec la partie «fenêtré» de la chambre d'hybridation.
- Pipet 42 ul du mélange d'hybridation préparé précédemment (voir section 3) sur la position appropriée sur le réseau sauvegarde diapositive. Pré-humide chaque pointe pour améliorer la précision du pipetage. Pipet lentement sur le centre de chaque position, assurant que le liquide ne touche pas la limite de l'anneau en caoutchouc.
- Une fois toutes les positions sur la lame de support sont remplis, abaissez délicatement la lame de tableau sur elle et assembler la chambre d'hybridation. Assurez-vous que le côté du tableau avec écrit sur elle est confrontée à la diapositive de support. Veillez à serrer l'hybridation vis de chambre entièrement.
- Inspectez la chambre d'hybridation assemblé. ENSure qu'il n'y ait pas de fuite de mélange d'hybridation à l'extérieur des limites de la bague en caoutchouc et chaque bulle d'air est d'environ 4 mm de hauteur lorsque la chambre d'hybridation est reposé sur son extrémité verticalement. Tournez la chambre d'hybridation et vérifier qu'il n'y a pas de bulles d'air qui sont coincés en position et ne bouge pas. Se il ya toutes ces choses, donner la chambre forte d'un robinet sur le banc. Vérifiez que toutes les bulles d'air se déplacent.
- Placer la chambre d'hybridation dans le four rotatif à 65 ° C pendant 24 heures. Assurez-vous que le rotor four est équilibrée; utiliser d'autres chambres vides si nécessaire.
5. Lavage et diapositives Numérisation
- Laver tableaux pour éliminer l'ADN marqué excès et puis analyser pour mesurer la fluorescence de chaque sonde.
- Prenez chambres d'hybridation sortie du four et à démonter. Les diapositives de tableaux et joints seront collées; plonger ceux-ci dans une tampon de lavage et utiliser une paire de pinces en plastique, plat tranchant pour les forcer à part.
- DiSCard la diapositive de joint et placer la lame de tableau dans un rack immergée dans un tampon 1.
- Laver la glissière de tableau dans ~ 700 ml de tampon de lavage fraîche 1 pendant 5 min, en remuant vigoureusement (utiliser une puce et d'un agitateur magnétique).
- Transférer la lame de tableau à ~ 700 ml tampon de lavage 2 et laver pendant 90 secondes, en remuant vigoureusement. Soulevez doucement les diapositives de tableaux sur tampon de lavage 2, ils devraient émerger sec.
- Charger la lame de matrice dans un porte-lame du dispositif de balayage, en utilisant un protecteur de lame. Chargez la diapositive dans le scanner de réseau et de numérisation en suivant les instructions du fabricant du tableau.
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Representative Results
Chaque sonde sur un réseau hybride est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert (voir Figure 1). Le ratio de rouge à un signal vert fluorescent pour chaque sonde est quantifiée par le scanner et le logiciel associé graphiquement en ratios de log2 selon leur position génomique, et identifie les régions relevant de limites prédéfinies extérieur. Les traces de tableau résultant permettent interprétation de régions identifiées comme génomiquement déséquilibrée. Par exemple, la trace d'un enfant avec le syndrome de Williams, un syndrome de microdélétion récurrent à médiation par des répétitions de copie faibles dans la région proximale du chromosome 7, est illustrée sur la figure 2. Ce déséquilibre a été identifié par le logiciel et indiquée par une ligne rouge.
Sonde rapports de log fluorescentes doivent grouper étroitement autour de 0, comme représenté sur la figure 2, ce qui indique un rapport vert / rouge de 1: 1 pour les régions normales du génome. Traces de tableaux épars peuvent Resul t en appel inexacte des régions anormales, ou l'échec d'identifier déséquilibre génomique (voir Figure 3). Cette diffusion peut être causée par un certain nombre de facteurs, y compris la mauvaise qualité de l'ADN, ou la présence de niveaux élevés d'ozone dans l'atmosphère. Surveillance des niveaux d'ozone est recommandé, et où les niveaux d'ozone élevés sont problématiques, armoires d'exclusion d'ozone dédiés sont disponibles; utilisation de ces armoires entraîne généralement nettement amélioré la qualité de l'ensemble.
Figure 1. Image d'un tableau après l'hybridation. La boîte blanche montre une zone agrandie, où sondes rouges et verts sondes peuvent être visualisées (indiquant déséquilibre pour les régions représentées par ces sondes), sur un fond de sondes jaune (indiquant régions génomiques équilibrés ).
Figure 2. (A) Exemple de trace chromosome 7 dans un échantillon avec une deletion 1.7Mb, représentée par un rapport moyen de -0,8 à 43 sondes consécutives. La région supprimé dans ce cas est associée avec le syndrome de Williams-Beuren, compatible avec l'indication renvoi de dysmorphies, une malformation cardiaque et de déficience intellectuelle. (B) La région supprimé ci-dessus affichée dans le navigateur de génome de USCS, montrant les gènes au sein de la supprimé région. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3.Exemple d'une trace de la matrice dispersée pour le chromosome 7 dans un échantillon avec une mauvaise hybridation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Réactif | Volume (pi) |
| Amorces et tampon de réaction | 20 |
| ADN (1 pg) + eau | 20 |
| Klenow ADN polymérase Exonuclease | 10 |
Tableau 1. Résumé des réactifs utilisés pour la réaction de marquage.
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Discussion
CGH array ne détectera pas remaniements équilibrés ou des anomalies de ploïdie tels que la triploïdie. En outre, les déséquilibres mosaïque de bas niveau ne peuvent pas être détectés. Cependant, CGH array a une résolution plus élevée pour la détection CNV que l'analyse des chromosomes bandes G laquelle il a remplacé dans de nombreux laboratoires de cytogénétique. Ce est donc la norme de référence actuelle pour la détection du génome entier CNV. Elle peut être remplacée par des technologies de séquençage de prochaine génération dans le futur mais pour l'instant, leur coût et les complexités techniques associées à l'utilisation à court lit pour la détection CNV signifie que ce ne est pas encore un bon choix pour une utilisation clinique.
Le protocole décrit ici est l'utilisation de routine dans notre laboratoire de service clinique. Deux séries de 96 échantillons chacun sont traités chaque semaine en utilisant un robot de manipulation liquide et un robot de traitement de colonne de centrifugation de membrane de silice dédié. Automatisation est fortement recommandé d'améliorer la cohérence et maintenir la qualité. ADN extrait de sang, De la salive, des échantillons prénataux (par exemple, villosités choriales ou de liquide amniotique) ou des échantillons de tissus peuvent être, et régulièrement est, utilisé avec ce protocole.
L'ozone est connu pour dégrader les colorants cyanine et donc la surveillance et la protection de l'ozone est recommandé. La variation saisonnière des niveaux d'ozone est également fréquente. Nos moniteurs de laboratoire et les niveaux records d'ozone en continu. Une unité d'élimination d'ozone mural est utilisé pour réduire les niveaux d'ozone et de pièces particulièrement sensibles du protocole (ce est à dire, de lavage et de balayage tableaux) sont effectuées dans les hottes sans ozone. Si possible, les niveaux d'ozone sont maintenues en dessous de 5 ppb.
La plupart des réactifs sont achetés sous forme de kits de fabricants d'externaliser efficacement le contrôle de la qualité; cela se est avéré être une stratégie efficace. Toutefois, cela ne signifie pas que le contrôle de la qualité ne est pas exigée. En effet, des mesures de qualité sont soigneusement surveillés pour toute anomalie: écart type dérivé des ratios de log2 (de DLRS) devrait être de below 0,2, cyanine 3 et 5 signaux intensités doit être supérieure à 500 et cyanine 3 et 5 du rapport signal sur bruit doit être> 30. Ces paramètres sont générés dans le cadre du protocole de balayage par le logiciel de balayage et sont enregistrées pour la surveillance à long terme.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
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