Summary
ゲノムコピー数変異の検出のためのアレイCGHは、Gバンド核型分析に取って代わった。本論文では、技術や診断サービスの研究室への応用について説明します。
Introduction
これは、欠失または染色体セグメントの余分なコピーが知的障害、異形症とcongentical奇形を引き起こすことを長年にわたって知られており、いくつかのケースでは、遺伝的症候群1を引き起こしてきた。しかし、これらの変化のゲノムワイド検出のため2000年代半ばまで、利用可能な唯一の技術は、不均衡の地域や性質に応じて、5-10Mb周りの解像度を持つG-バンド染色体分析、で、そのことはできません材料が同じバンドパターンと異なる染色体から地域によって置き換えられている異常な染色体を検出する。そのようなin situハイブリダイゼーションと多重ライゲーション特異的プローブ増幅における蛍光として補助的な細胞遺伝学的技術が疑われる特定の症候不均衡例では、特定の遺伝子座の尋問のために利用されてきたが、それは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）の導入までではなかった日常の臨床診断の中にコピー数変異体（のCNV）のゲノムワイド検出が（通常は120キロバイト程度）を大幅に増加した解像度で可能になったervice 2-5。一部の地域では正常な集団6-7で普及しているための調査研究と並んで臨床サービス作業は、他のCNVながら、以前に検出できない、そのような自閉症やてんかん8-11などneurodisabilitiesと関連している、のCNVことが示されている。
この論文に記載されているプロトコルは、当社の英国国民保健サービス（NHS）の臨床診断検査室で使用されている。我々はこの状態が資金提供サービスでコストを最小限に抑える新たなハイブリダイゼーション戦略、バッチテストやロボットを使用しています。
以下に詳述するプロトコールに先立って、高品質のDNAを、適当な出発物質、一般的に、血液、培養細胞又は組織サンプルから抽出されるべきである。 280吸光度比（bにすべき：分光光度計は濃度を測定するために使用することができ、260をチェックし（> 50 ngの/μlのあるべき）E 1.8から2.0）。ゲル電気泳動は、DNAが有意な劣化なしに高分子量であることを確認するために使用することができる。
このプロトコルは、自動液体処理ロボットを使用して実行ごとに96個のサンプルを標識しているより高いスループット実験室用に設計されています。しかし、自動化することなく、低いスループット·ラボに適合させることができる。
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Protocol
1.標識反応
- 96ウェルプレートおよび使用の準備-20℃で保存し、製造業者が推奨する濃度において、プレアリコートシアニン3及び5標識dUTPs、非標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを使用する前に。このプロトコルは、各ウェルにdUTPを10.5μlの未標識ヌクレオチドおよびランダムプライマーを標識し、適切のアリコート10.5μlのの目的のために。
- 光から保護し、約1時間、4℃でヌクレオチドおよびプライマーのすぐに使用できる96ウェルプレートを解凍する。
- 解凍後は、光から保護し、少なくとも30分間室温でこのプレートを平衡化する。
- 少なくとも15分間、60℃でDNAサンプルを平衡化する。
- 液体ハンドリングロボットを用いて、96ウェルプレートの各ウェルにヌクレアーゼフリー水を分配する。
注記：水の体積は、各入力DNA試料の濃度に依存し、そして/μlの最終濃度50ngをもたらすのに十分であるべきである。 - 液体漢の使い方dlingロボット、96ウェルプレートのウェルにピペット1μgのDNAは、（1.5を参照）20μlに全量を。
注記：結果データの品質が損なわれる可能性があるが、DNAの小さい量を使用することができる（貴重なサンプルのために、400ngのまでインプットDNA量を使用することができる）。 - 液体ハンドリングロボットを用いて、希釈したDNAのプレートの各ウェルに平衡化ヌクレオチドおよびプライマーの20μlのを転送する。
- （気密シールは非常に重要です）ストリップキャップで96ウェルプレートをシール。
- 加熱された蓋をPCR機で10分間、99℃でDNAを変性させ、その後アニールするプライマーを氷上で5分間クールスナップ。
- 液体処理ロボットを用いて、徹底的にそれぞれのDNAとピペットミックスにクレノウエキソDNAポリメラーゼ酵素の10μlを添加する。
注：総容積は50μlである必要があります。 - 96ウェルプレートを密封し、16時間37℃でインキュベートする。
注：4時間の短いインキュベーションしかし十分ですO / Nでcubationはより便利にすることができます。 - 液体ハンドリングロボットを用いて、各ウェルに停止緩衝液の5μlを添加する。
NOTE：ラベリング反応に使用される試薬の概要を表1に示す。
取り込まれなかったヌクレオチドの2の除去
- シリカメンブレンベースのスピンカラムと専用のスピンカラム処理ロボットを使用して、取り込まれていないヌクレオチドを除去（スピンカラムは、手動で処理されてもよい）。製造元の指示に従ってください。
- 2ミリリットルチューブに、各ウェルの内容を転送。よくIDをこれらを事前にラベルを付けます。
注：このステップでは、液体ハンドリングロボットを用いて手動で、または好適に行うことができる。 - スピンカラム処理ロボットを使用している場合は、2ミリリットルチューブ、DNA精製スピンカラムおよび関連するバッファを備えたロボットをロードします。
- シリカに標識されたDNAを結合するために標識反応を250μlの高塩、DNA結合緩衝液（バッファPB）を追加膜。
- 500μlの洗浄バッファー（PEをバッファリング）で2回膜を洗浄することにより不純物を除去する。
- 〜12μLの容量において、精製、標識DNAを回収するために、膜に15μlの低塩の溶出緩衝液を（EBをバッファリング）を追加します。
- 2ミリリットルチューブに、各ウェルの内容を転送。よくIDをこれらを事前にラベルを付けます。
3. Hybをペアの組み合わせ
- シアニン3と5標識DNAの適切なペアを組み合わせて、COT-1 DNA、メーカー提供の阻止ミックスと液体処理ロボットを使用して、製造業者が提供するハイブリダイゼーション緩衝液。
注：共有のCNVが問題でない場合、彼らは非常にあるように、これらのHYBペアは、 例えば、私たちは日常的にそのような頭蓋骨癒合症の患者VS腎形成不全患者などの表現型不一致のサンプルを、ペア（サンプルおよび参照、またはサンプル対サンプルであってもよい）同じ臨床的に有意なCNVを運ぶ可能性は低い。参照DNAを使用している場合は、市販のDNA供給が推奨され、それがサンプルと一緒に処理されるべきである。- 液体処理ROを使用して、ボット、COT-1 DNA（3333 ngの/μl）を追加し、製造業者が提供する各ウェルに1.1μlのCOT-1 DNA、4.95μlの遮断ミックス24.75を含むように96ウェルプレートの各ウェルに混合し、ハイブリダイゼーションをブロッキング緩衝液μlのハイブリダイゼーション緩衝液。
- 各ウェルに適切なシアニン3標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。
- 各ウェルに適切なシアニン5標識DNAの9.35を添加する。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。
- 1分間、96ウェルプレートボルテックスをシール。各ウェルの底に内容物を収集するために96ウェルプレートをスピン。
4.ハイブリダイゼーション
- 65℃のハイブリダイゼーションオーブンを予熱し、1バッキングスライドと各アレイスライドの1つのハイブリダイゼーションチャンバーをprewarm。
- アレイに適用される前に、プレハイブリダイゼーションインキュベーションで標識されたDNAを変性さ。 24時間、回転オーブンでハイブリダイゼーションを実行します。
- 30分間、70℃で96ウェルプレートをインキュベートした後、少なくとも5分間37℃で残す。
- 42℃で加熱されたプラットフォーム上での作業、使用する前に、ハイブリダイゼーションチャンバ内に各バックアップのスライドをロードします。ガスケットスライドの透明部分は、ハイブリダイゼーションチャンバーの「窓」の部分と整列していることを確認してください。
- ピペットで先に調製したハイブリダイゼーション混合物の42μlをスライドバッキングアレイ上の適切な位置に（セクション3を参照）。分注精度を向上させるプリウェット各チップ。ピペットでゆっくり確認しながら各位置の中心、上に液体がゴムリングの境界に触れていません。
- バッキングスライド上のすべての位置が満たされると、慎重に上のアレイスライドを下げ、ハイブリダイゼーションチャンバーを組み立てる。それへの書き込みを持つ配列の側はバッキングスライドに直面していることを確認してください。完全にハイブリダイゼーションチャンバーのネジを締めてください。
- 組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを点検。 Eハイブリダイゼーションチャンバーが垂直方向の端部に載置されたときにゴムリングの境界外のハイブリダイゼーション混合物の漏れ、各気泡がないことをnsureは、高さが約4 mmである。ハイブリダイゼーションチャンバーを回転させた位置で立ち往生し、動いていないに気泡がないことを確認してください。これらのいずれかがある場合は、室のベンチに鋭いタップを与える。すべての気泡が移動していることを確認してください。
- 24時間、65℃で回転オーブンにハイブリダイゼーションチャンバーを配置します。オーブンロータがバランスしていることを確認します。必要に応じて他の空室を使用しています。
5.洗浄およびスキャンスライド
- 過剰標識DNAを除去した後、各プローブの蛍光を測定するためにスキャンするために、配列を洗ってください。
- オーブン逆アセンブルの外にハイブリダイゼーションチャンバーを取る。アレイおよびガスケットスライドが一緒に立ち往生するでしょう。洗浄バッファー1でこれらを沈めると離れて、それらをてこのようにプラスチック、フラットエッジのピンセットを使用しています。
- ディガスケットスライドをSCARD、バッファ1に沈めラックに配列スライドを配置します。
- 激しく撹拌し、5分間、新鮮な洗浄バッファー1の〜700ミリリットルの配列のスライドを洗う（ノミと磁気攪拌機を使用します）。
- 〜700ミリリットルの洗浄バッファー2への配列のスライドを移し、激しく撹拌し、90秒間洗浄します。静かに洗浄バッファー2から配列スライドを持ち上げ、彼らはドライ出現する必要があります。
- スライドプロテクタを使用して、スキャナのスライドホルダーに配列スライドをロードします。アレイスキャナーにスライドをロードし、アレイの製造元の指示に従ってスキャンします。
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Representative Results
ハイブリダイズしたアレイ上の各プローブは、赤と緑の蛍光色素の混合物として可視化される（ 図1参照）。各プローブのための緑色蛍光信号に赤の比率は、スキャナによって定量化され、関連するソフトウェアは、それらのゲノム位置に応じてLOG2比としてこれらをプロットし、プリセットの境界の外に落下する領域を特定します。結果の配列トレースは、ゲノムのアンバランスとして同定された領域の解釈を可能にする。例えば、ウィリアムズ症候群、染色体7の近位領域内の低コピー反復配列によって媒介される定期的な微小欠失症候群の子供からのトレースは、 図2に示されている。この不均衡は、ソフトウェアによって識別され、赤線で示した。
ゲノムの正常な領域に対して1：1の緑/赤の割合を示す、 図2に示すように、蛍光対数比は、0の周りに密接にクラスタ化する必要があり、プローブ。散在配列トレースはresulあり不正確な異常部位の通話、またはゲノム不均衡を同定するための失敗トン（ 図3参照）。このような散乱が悪いDNAの品質、または大気中のオゾンレベルの上昇の存在を含む、多くの要因によって引き起こされ得る。オゾンレベルの監視が推奨され、どこに上昇オゾンレベルが問題となる、専用のオゾン除外キャビネットが利用可能です。これらのキャビネットを使用することは一般的に著しく改善されたアレイの品質をもたらす。
配列以下のハイブリダイゼーションの図1.画像。白いボックスはバランスのとれたゲノム領域を示す赤のプローブと緑のプローブは、黄色プローブ（を背景に、（これらのプローブによって表される地域の不均衡を示す）を可視化することができる拡大された領域を、示しています）。
図2（A）の例は、43の連続したプローブのための-0.8の平均比で示し、1.7MB欠失を有するサンプルでは染色体7のためのトレース。この場合の欠失領域は異形の機能、心臓の欠陥と知的障害の紹介指標と整合ウィリアムズ症候群と関連している。（B）USCSゲノムブラウザに表示された上記の欠失領域、削除された内の遺伝子を示す地域。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。貧しいハイブリダイゼーションと、サンプル中の7番染色体のための散乱アレイ·トレースの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬 | 容量（μL） |
| 小冊子＆反応バッファー | 20 |
| DNA（1μgの）+水 | 20 |
| クレノウエキソヌクレアーゼDNAポリメラーゼ | 10 |
ラベリング反応に使用される試薬表1.。
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Discussion
アレイCGHは、三倍体としてバランスのとれた再構成または倍数性異常を検出しません。さらに、低レベルのモザイク不均衡が検出されないことがある。しかし、アレイCGHは、多くの細胞遺伝学研究室で置き換えたG-バンド染色体分析よりCNVを検出するためのより高い解像度を有する。したがって、ゲノムワイドなCNV検出のための現在のゴールドスタンダードです。これは、将来的には、次世代配列決定技術に置き換えることができるが、現在、それらのコストおよび技術的な複雑さは、これはまだ臨床使用に適していないことを意味するCNVの検出のために読み取る短い使用に関連する。
ここに記載されているプロトコルは、当社の臨床サービス実験室での日常的な使用である。 96サンプルずつの2ランは、液体処理ロボットや専用のシリカ膜スピンカラム処理ロボットを用いて毎週処理されます。自動化が非常に一貫性を改善し、品質を維持することをお勧めします。血液から抽出したDNA、唾液、出生前のサンプル（ 例えば、絨毛膜絨毛または羊水）または組織サンプルは、日常場合、このプロトコルで使用することができる。
オゾンは、シアニン色素を分解することが知られているので、オゾン監視および保護が推奨される。オゾン濃度の季節変動も一般的である。継続的に私たちの研究室を監視し、記録オゾンレベル。壁掛け式のオゾン除去ユニットはオゾンレベルを低減するために使用されるプロトコルの特に敏感な部分（ すなわち、洗浄及び走査アレイ）はオゾンフリーフードで実施される。可能であれば、オゾンレベルは5 PPB以下に維持されている。
ほとんどの試薬は、効果的な品質管理を外部委託するためにメーカーからキットとして購入されている。これは効果的な戦略であることが証明された。しかし、これは品質管理が必要とされていないことを意味するものではありません。実際、品質メトリクスを十分に行い、異常を監視されます。LOG2比（DLRS）の誘導体標準偏差をBする必要があります> 30であるべきである0.2 ELOW、シアニン3および5の信号強度がノイズ比が500より大きく、シアニン3および5の信号であるべきである。これらのメトリックは、スキャンソフトウェアによる走査プロトコルの一部として生成され、長期モニタリングのために記録されている。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
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