Summary
Array CGH för detektion av genomiska kopietal varianter har ersatt G-banded karyotyp analys. Detta dokument beskriver tekniken och dess tillämpning i en diagnostisk tjänst laboratorium.
Introduction
Det har varit känt i många år att strykningar eller extra kopior av kromosomsegment orsakar utvecklingsstörning, dysmorphism och congentical missbildningar, och i vissa fall orsaka genetiska syndrom en. Men den enda teknik som finns tillgänglig fram till mitten av 2000-talet för genomet hela detektion av dessa förändringar var G-banded kromosomanalys, som har en upplösning på omkring 5-10Mb, beroende på region och typ av obalans, och som inte kan upptäcka onormala kromosomer där materialet har ersatts av en region från en annan kromosom med samma bandmönster. Underordnade cytogenetiska tekniker såsom fluorescens in situ hybridisering och multiplex ligation specifik sond förstärkning har varit tillgängliga för förhör av specifika loci, vid misstanke specifika syndrom obalans, men det var inte förrän införandet av arrayen jämförande genomisk hybridisering (array CGH) in i rutinmässig klinisk diagnostisk sERVICE 2-5 som genomet hela detektering av antal kopior varianter (CNVs) blev möjligt på en kraftigt ökad upplösning (vanligtvis runt 120 KB). Klinisk servicearbete vid sidan forskningsstudier har visat att CNVs för vissa regioner är utbredd i normalbefolkningen 6-7, medan andra CNVs, tidigare påvisas, är förknippade med neurodisabilities som autism och epilepsi 8-11.
Det protokoll som beskrivs i detta dokument används i vår brittiska National Health Service (NHS) klinisk diagnoslaboratorium; Vi använder nya hybridiseringsförfaranden strategier, partiprovning och robotar för att minimera kostnaderna i detta statligt finansierad service.
Före det protokoll som beskrivs nedan, bör högkvalitativt DNA extraheras från det lämpliga utgångsmaterialet, vanligen blod, odlade celler eller vävnadsprover. Spektrofotometri kan användas för att mäta koncentrationen (bör vara> 50 ng / ul) och kontrollera 260: 280 absorbansenheter förhållanden (skulle be 1,8-2,0). Gelelektrofores kan användas för att kontrollera att DNA är av hög molekylvikt utan betydande nedbrytning.
Detta protokoll är utformad för högre genomströmning laboratorier som märkning 96 prover per körning med hjälp av automatiserade robotvätskehanterings. Det kan emellertid vara anpassade för lägre genomströmning labb utan automation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Märkning Reaktion
- Före användning, pre-alikvot cyanin 3 och 5-märkta dUTPs, omärkta nukleotider och slumpmässiga primers vid tillverkaren rekommenderade koncentrationer i 96-brunnar och förvara vid -20 C klar för användning. Vid tillämpningen av detta protokoll, portion 10.5 pl av lämplig märkt dUTP och 10.5 l omärkta nukleotider och slumpmässiga primers till varje brunn.
- Tina färdig att använda 96-brunnars platta av nukleotider och primrar vid 4 ° C under ca 1 h, skyddat från ljus.
- När tinats, jämvikt här plattan vid RT i minst 30 minuter, skyddas från ljus.
- Jämvikta DNA-prover vid 60 ° C i minst 15 minuter.
- Med användning av en vätskehanteringsrobot, dispensera nukleasfritt vatten till varje brunn i en 96-brunnsplatta.
OBS: Den volym vatten som kommer att bero på koncentrationen av varje ingångs DNA-prov och bör vara tillräcklig för att resultera i en slutlig koncentration av 50 ng / ul. - Med hjälp av en vätska Handling robot, pipett 1 ug av DNA i en brunn på 96-brunnars platta (se 1,5) för att bringa den totala volymen till 20 | il.
OBS: Mindre mängder DNA kan användas även om kvaliteten på resulterande data kan äventyras (för ädel prover, ingång DNA mängder ner till 400 ng kan användas). - Med hjälp av en vätska hanteringsrobot, överför 20 | il av den jämviktade nukleotider och primrar i varje brunn i plattan av utspädda DNA.
- Täta 96-brunnar med bandkåpor (tätt är avgörande).
- Denaturera DNA vid 99 ° C under 10 min i en PCR maskin med en uppvärmd lock och sedan snäppa kyler på is under 5 min till härdnings primrar.
- Med hjälp av en flytande robothantering, tillsätt 10 pl Klenow Exo DNA-polymeras enzym till varje DNA och pipett blanda väl.
OBS: Den totala volymen bör vara 50 l. - Täta 96-brunnar och inkubera vid 37 ° C under 16 h.
OBS: En kortare inkubation av 4 tim räcker dock en O / Ncubation kan vara mer praktiskt. - Med användning av en vätskehanteringsrobot, tillsätt 5 | il stoppbuffert till varje brunn.
ANMÄRKNING: En sammanfattning av de reagens som används för märkningsreaktionen visas i tabell 1.
2. Borttagning av Unincorporated Nucleotides
- Avlägsna ej registrerade nukleotider som använder kiseldioxid-membranbaserad spin kolonner och en dedikerad spin kolonn bearbetningsrobot (spin kolonner kan också bearbetas manuellt). Följ tillverkarens instruktioner.
- Överför innehållet i varje brunn till en 2 ml rör; pre-label dessa med såväl ID.
Anmärkning: Detta steg kan utföras manuellt eller företrädesvis med användning av en flytande robothantering. - Om du använder en spinnkolonn bearbetningsrobot, sedan ladda roboten med 2 ml rör, DNA renings spin kolumner och tillhörande buffertar.
- Lägg 250 l höga salt, DNA-bindande buffert (buffert PB) märkning reaktionen att binda den märkta DNA till kiseldioxidmembran.
- Avlägsna föroreningar genom tvättning av membranet två gånger med 500 ul tvättbuffert (buffert PE).
- Lägg 15 pl låg salt elueringsbuffert (buffert EB) till membranet för att återvinna den renade, märkta DNA i en volym av ~ 12 | il.
- Överför innehållet i varje brunn till en 2 ml rör; pre-label dessa med såväl ID.
3. Kombinera Hyb Pairs
- Kombinera lämpliga par av cyanin 3 och 5-märkt DNA, COT-1 DNA, en tillverkare matade blockerande mix och en tillverkare matade hybridiseringsbuffert med hjälp av en vätska hanteringsrobot.
OBS: Dessa HYB par kan vara ett prov och en referens, eller prov vs provet om delad CNVs är inte en fråga (t.ex. vi rutinmässigt ihop fenotyp-inkompatibla prover, till exempel en njurdysplasi patienten vs en kraniossynostos patienten, eftersom de är mycket osannolikt att bära samma kliniskt signifikant CNV). Om du använder en DNA, är en kommersiell DNA tillförsel rekommenderas, och det bör behandlas parallellt provet.- Med hjälp av en flytande hanterings robot, tillsätt COT-1 DNA (3333 ng / ul), tillverkaren matade blockeringsblandning och hybridiseringsbuffert till varje brunn i en 96-brunnsplatta så att varje brunn innehåller 1,1 pl COT-1 DNA, 4,95 | il blockerande blandning och 24,75 il hybridiseringsbuffert.
- Lägg 9,35 pl av den lämpliga cyanin 3-märkt DNA till varje brunn. Pre-vått varje spets för att förbättra pipettering noggrannhet.
- Lägg 9,35 pl av den lämpliga cyanin 5-märkt DNA till varje brunn. Pre-vått varje spets för att förbättra pipettering noggrannhet.
- Täta 96-brunnar och skaka i 1 min. Snurra 96-brunnars platta för att samla innehållet i botten av varje brunn.
4. Hybridisering
- Värm en hybridiseringsugn till 65oC och Prewarm en uppbackning slide och en hybridisering kammare för varje array slide.
- Denaturera det märkta DNA i en pre-hybridisering inkubation innan de tillämpas på de arrayer. Utför hybridisering i en roterande ugn under 24 timmar.
- Inkubera 96-brunnars platta vid 70 ° C under 30 min och sedan lämna vid 37 ° C under minst 5 minuter.
- Att arbeta på en uppvärmd plattform vid 42 ° C, ladda varje uppbackning glida in en hybridisering kammare före användning. Se till att den genomskinliga delen av packningen slide i linje med "fönster" del av hybridisering kammaren.
- Pipettera 42 ìl av hybridisering mix förberett tidigare (se avsnitt 3) på lämpligt läge på matrisen uppbackning slide. Pre-vått varje spets för att förbättra pipettering noggrannhet. Pipettera långsamt på mitten av varje position, och se till att vätskan inte vidrör gummiringen gränsen.
- När alla positioner på uppbackning slide är fyllda, försiktigt sänka array slide på den och montera hybridiseringskammaren. Se till att den sida av matrisen med att skriva på den är vänd underlags sliden. Var noga med att dra åt hybridiseringskammaren skruven helt.
- Inspektera den monterade hybridisering kammaren. ENsure att inget läckage av hybridisering mix utanför gummiringen gränser och varje luftbubbla är ~ 4 mm i höjd när hybridisering kammaren vilade på sin högkant. Rotera hybridisering kammaren och kontrollera att det inte finns några luftbubblor som fastnat i position och inte röra. Om det finns något av detta, ge kammaren en skarp kran på bänken. Kontrollera att alla luftbubblor flyttar.
- Placera hybridisering kammaren in i den roterande ugnen vid 65 ° C under 24 h. Se till att ugnen rotorn är balanserad; använda andra tomma kamrarna vid behov.
5. Tvättning och skannar diabilder
- Tvätta arrayer för att avlägsna överskott märkt DNA och sedan scanna mäta fluorescens av varje sond.
- Ta hybridiseringsförfaranden kammare ur ugnen och ta isär. De array och packnings diabilder kommer att fastna ihop; dränka dessa i tvättbuffert 1 och använda ett par plast, platta kanter pincett för att bända isär dem.
- Discard packningen bilden och placera array glida in ett rack nedsänkt i buffert 1.
- Tvätta arrayen sliden i ~ 700 ml färsk tvättbuffert 1 under 5 min, under kraftig omrörning (använd en loppor och en magnetisk omrörare).
- Överför arrayen bild till ~ 700 ml tvättbuffert 2 och tvätta i 90 sek, rör om kraftigt. Lyft försiktigt array glider ur tvättbuffert 2, bör de dyker torrt.
- Ladda arrayen glida in en bild innehavare av skannern, med hjälp av en glidskydd. Ladda sliden i arrayen scannern och scanna efter arrayen tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varje sond på en hybridiserad array visualiseras som en blandning av röda och gröna fluorokromer (se figur 1). Förhållandet mellan rött till grönt fluorescerande signal för varje sond kvantifieras av skannern och den tillhörande programvaran tomter dessa som log2 nyckeltal enligt deras iska läge, och identifierar områden som faller utanför förinställda gränser. De resultearray spår tillåter tolkning av regioner som identifierats som genomiskt obalanserad. Till exempel, spår från ett barn med Williams syndrom, en återkommande microdeletion syndrom medierad av låga kopierings upprepningar i den proximala regionen av kromosom 7, illustreras i figur 2. Denna obalans identifieras av programvaran och indikeras av en röd linje.
Probe fluorescerande loggförhållanden bör nära frodas runt 0, såsom visas i fig 2, vilket indikerar en grön / röd-förhållande av 1: 1 för normala regioner av genomet. Spridda array spår kan Resul ti felaktig kallelse onormala regioner, eller underlåtenhet att identifiera genomisk obalans (se figur 3). Sådan scatter kan orsakas av ett antal faktorer, bland annat dålig DNA-kvalitet, eller förekomsten av förhöjda nivåer av ozon i atmosfären. Övervakning av ozonnivåerna rekommenderas, och där förhöjda ozonhalter är problematiska, dedikerad ozonuteslutningsskåp finns; Användningen av dessa skåp leder i allmänhet markant förbättrad array kvalitet.
Figur 1. Bild av en matris efter hybridisering. Den vita rutan visar en förstorad område, där röda sonder och gröna prober kan visualiseras (indikerar obalans för de regioner som representeras av dessa sonder), mot en bakgrund av gula sonder (indikerar balanserade iska regioner ).
Figur 2. (A) Exempel spår för kromosom 7 i ett prov med en 1,7Mb deletion, som visas med ett medelförhållande av -0,8 för 43 på varandra följande prober. Den raderade regionen i det här fallet är associerad med Williams-Beuren syndrom, i överensstämmelse med den remiss indikation på avvikelser i utseendet, hjärtfel och utvecklingsstörning. (B) Den raderade regionen ovan visas i USCs genomet webbläsare, visar gener inom den borttagna region. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3.Exempel på en spridd samling spår för kromosom 7 i ett prov med dålig hybridisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym (^ il) |
| Primers & reaktionsbuffert | 20 |
| DNA (1 | ig) + vatten | 20 |
| Klenow Exonukleas-DNA-polymeras | 10 |
Tabell 1. Sammanfattning av de reagens som används för märkningsreaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Array CGH kommer inte upptäcka balanserade rearrangemang eller ploidi störningar såsom triploidy. Vidare kan mosaik obalanser låg nivå inte upptäckas. Dock har array CGH en högre upplösning för CNV detektion än G-banded kromosomanalys som det har ersatt i många cytogenetik laboratorier. Det är därför den nuvarande standarden för genomet hela CNV upptäckt. Den kan ersättas av nästa generations sekvenseringsteknologier i framtiden, men för närvarande, deras kostnader och de tekniska svårigheterna i samband med användning av kort läser för CNV detektion menar att detta inte är ännu en bra passform för klinisk användning.
Protokollet beskrivs här är i rutinmässig användning i vår kliniska servicelaboratorium. Två körningar av 96 prover vardera bearbetas varje vecka med hjälp av en vätska hanteringsrobot och en dedikerad kiselmembran centrifugeringskolonn bearbetningsroboten. Automation rekommenderas att förbättra konsekvens och upprätthålla kvaliteten. DNA extraherat från blod, Saliv, prenatal prover (t.ex. korionvilli eller fostervatten) eller vävnadsprover kan vara, och rutinmässigt, som används med detta protokoll.
Ozon är känt för att försämra cyaninfärgämnen och därför ozon övervakning och skydd rekommenderas. Säsongs variation i ozonnivåerna är också vanligt. Våra laboratorie monitorer och register ozonhalterna kontinuerligt. En väggmonterad ozonborttagningsenheten används för att minska ozonnivåer och särskilt känsliga delar av protokollet (dvs, tvätt och skanning arrayer) utförs i ozonfria kåpor. Om möjligt är ozonhalterna hålls under 5 ppb.
De flesta reagens köpas som byggsatser från tillverkarna för att effektivt outsourca kvalitetskontroll; detta har visat sig vara en effektiv strategi. Men detta betyder inte att kvalitetskontroll inte krävs. Faktum är kvalitetsmått övervakas noggrant för eventuella avvikelser: derivat standardavvikelse log2 nyckeltal (DLRS) bör vara below 0.2, bör cyanin 3 och 5-signalintensiteter vara större än 500 och cyanin 3 och 5-signal till brusförhållanden bör vara> 30. Dessa mått genereras som en del av scanning protokollet genom skanningsprogrammet och redovisas för långtidsövervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
