Summary
Array CGH for påvisning av genomiske kopi antall varianter har erstattet G-bundet karyotype-analyse. Dette notatet beskriver teknologi og dens anvendelse i en diagnostisk tjeneste laboratorium.
Introduction
Det har vært kjent i mange år at slettinger eller ekstra kopier av kromosomsegmenter forårsaker utviklingshemming, dysmorfisme og congentical misdannelser, og i noen tilfeller forårsake genetiske syndromer en. Imidlertid er den eneste teknologien som er tilgjengelig frem til midten av 2000-tallet for genom-wide påvisning av disse endringene var G-banded kromosomanalyse, som har en oppløsning på rundt 5-10MB, avhengig av regionen og arten av ubalanse, og som ikke kan detektere abnormale kromosomer, hvor materialet er blitt erstattet med en region av et annet kromosom med samme båndmønster. Hjelpe cytogenetiske teknikker som fluorescens in situ hybridisering og multiplex ligation-spesifikk probe forsterkning har vært tilgjengelig for avhør av bestemte loci, ved mistanke om spesifikk syndrom ubalanse, men det var ikke før innføringen av matrisen komparativ genomisk hybridisering (matrise CGH) til rutinemessig klinisk diagnostisk service 2-5 som genom-wide deteksjon av kopitall varianter (CNVs) ble mulig på en kraftig økt oppløsning (typisk rundt 120KB). Klinisk service arbeid sammen med forskningsstudier har vist at CNVs for enkelte regioner er utbredt i normalbefolkningen 6-7, mens andre CNVs, tidligere umulig å oppdage, er assosiert med neurodisabilities som autisme og epilepsi 8-11.
Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen er brukt i vår UK National Health Service (NHS) klinisk diagnostisk laboratorium; vi bruker nye hybridisering strategier, batch testing og robotikk å minimere kostnadene i denne statlig finansiert tjeneste.
Før protokollen beskrevet nedenfor, bør høy kvalitet DNA bli ekstrahert fra hensiktsmessig utgangsmateriale, vanligvis blod, dyrkede celler eller vevsprøver. Spektrofotometri kan brukes til å måle konsentrasjonen (bør være> 50 ng / ul), og kontroller 260: 280 absorbans-forhold (b børe 1,8-2,0). Gelelektroforese kan brukes til å kontrollere at DNA er av høy molekylvekt uten signifikant nedbrytning.
Denne protokollen er laget for høyere gjennomstrømning laboratorier som er merking 96 prøver per kjøring bruker automatiserte væskehåndtering robotikk. Det kan imidlertid være innrettet for lavere gjennomstrømning laboratorier uten automatisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Merking Reaction
- Før bruk, pre-delmengde cyanine 3 og 5-merkede dUTPs, umerkede nukleotider og tilfeldige primere på produsentens anbefalte konsentrasjoner i 96-brønners plater og butikk ved -20 C klar til bruk. Ved anvendelsen av denne protokollen, delmengde 10,5 mL av hensiktsmessig merket dUTP og 10,5 mL umerkede nukleotider og tilfeldige primere til hver brønn.
- Tine klar til bruk 96-brønns plate av nukleotider og primere ved 4 ° C i ca 1 time, beskyttet mot lys.
- Tint, likevekt denne plate ved romtemperatur i minst 30 minutter, beskyttet mot lys.
- Ekvilibrer DNA-prøver ved 60 ° C i minst 15 min.
- Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot, dispensere nuclease-fritt vann til hver brønn av en 96-brønns plate.
MERK: Volumet av vann vil avhenge av konsentrasjonen av hver inngangs DNA-prøve, og bør være tilstrekkelig til å resultere i en sluttkonsentrasjon på 50 ng / ul. - Ved hjelp av en flytende Hanringsrobot, pipette 1 ug av DNA inn i en brønn av 96-brønns plate (se 1.5) for å bringe det totale volum til 20 mikroliter.
NOTE: Mindre mengder av DNA kan bli anvendt selv om kvaliteten av resulterende data kan bli kompromittert (for dyreprøver, inngangs DNA-mengder ned til 400 ng kan benyttes). - Ved hjelp av en væskehåndteringsrobot, overføre 20 ul av den ekvilibrerte nukleotider og primere i hver brønn av platen i fortynnet DNA.
- Tett 96-brønns plate med strippe caps (en tett forsegling er avgjørende).
- Denaturere DNA ved 99 ° C i 10 minutter i en PCR-maskin med et oppvarmet lokk og deretter smekke avkjøles på is i 5 min til annealing primere.
- Ved hjelp av en væskehåndtering robot, tilsett 10 mL av Klenow Exo DNA polymerase enzym til hver DNA og pipette bland godt.
MERK: Det totale volumet bør være 50 pl. - Forsegl 96-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
MERK: En kortere inkubasjon av 4 timer er nok imidlertid en O / Ncubation kan være mer praktisk. - Ved hjelp av en flytende håndtering robot, tilsett 5 mL av stopp buffer til hver brønn.
MERK: En oppsummering av de reagenser som benyttes for merking av reaksjonen er vist i tabell 1.
2. Fjerning av unincorporated Nukleotider
- Fjern uinkorporerte nukleotider som bruker silika-membranbaserte spin søyler og en dedikert spin kolonne behandling robot (spinnkolonner kan også behandles manuelt). Følg produsentens instruksjoner.
- Overføre innholdet av hver brønn til en 2 ml rør; pre-label disse med vel ID-er.
MERK: Dette trinn kan utføres manuelt eller fortrinnsvis ved hjelp av en væskehåndteringsrobot. - Hvis du bruker en spin kolonne behandling robot, deretter laste roboten med 2 ml rør, DNA rensing spin kolonner og tilhørende buffere.
- Tilsett 250 ul høye salt, DNA-bindingsbuffer (PB) buffer til merkingsreaksjonen for å binde det merkede DNA til silikamembran.
- Fjerne urenheter ved å vaske membranen to ganger med 500 ul vaskebuffer (buffer PE).
- Tilsett 15 ul elueringsbuffer med lavt saltinnhold (buffer EB) til membranen for å gjenvinne det rensede, merkede DNA i et volum på ~ 12 pl.
- Overføre innholdet av hver brønn til en 2 ml rør; pre-label disse med vel ID-er.
3. Kombiner Hyb Pairs
- Kombiner de riktige par av cyanine 3 og 5-merkede DNA, COT-1 DNA, en produsent forsynt blokkerer mix og en produsent-levert hybridiseringsbuffer bruker en væske håndtering robot.
MERK: Disse HYB parene kan være en prøve og en referanse, eller prøve vs prøve hvis delt CNVs er ikke et problem (f.eks, vi rutinemessig pare fenotype-umake prøver, for eksempel en nyre dysplasi pasient vs en craniosynostosis pasient, som de er svært usannsynlig å bære samme klinisk signifikant CNV). Ved bruk av en referanse-DNA, blir et DNA kommersiell forsyning anbefalt, og det skal bli behandlet sammen med prøven.- Ved hjelp av en flytende håndtering robot, tilsett COT-1 DNA (3333 ng / mL), produsenten-blokkerende blanding tilføres og hybridiseringsbuffer til hver brønn av en 96-brønns plate, slik at hver brønn inneholder 1,1 pl COT-1 DNA, 4,95 ul blokkerings blanding og 24.75 mL hybridisering buffer.
- Legg 9,35 ul av den passende cyanin 3-merket DNA til hver brønn. Pre-vått hver spiss for å forbedre pipettering nøyaktighet.
- Legg 9,35 ul av den passende 5 cyanin-merket DNA til hver brønn. Pre-vått hver spiss for å forbedre pipettering nøyaktighet.
- Tett 96-brønns plate og virvle i 1 min. Spinn 96-brønners plate for å samle innholdet i bunnen av hver brønn.
4. Hybridisering
- Forvarm en hybridisering ovnen til 65oC og prewarm ett backing lysbilde og en hybridisering kammer for hver matrise lysbilde.
- Denatureres den merkede DNA i en pre-hybridisering inkubasjon før de blir påføring på matriser. Utføre hybridiseringen i en roterende ovn i 24 timer.
- Inkuber i 96-brønners plate ved 70 ° C i 30 minutter og deretter la ved 37 ° C i minst 5 min.
- Arbeider på en oppvarmet plattform ved 42 ° C, legger hver sikkerhetskopiering lysbilde i en hybridisering kammer før bruk. Sørg for at den gjennomsiktige delen av pakningen lysbilde på linje med "windowed" delen av hybridisering kammeret.
- Pipette 42 mL av hybridisering mix forberedt tidligere (se kapittel 3) på den aktuelle posisjonen på tabellen backing lysbilde. Pre-vått hver spiss for å forbedre pipettering nøyaktighet. Pipette sakte på midten av hver posisjon, noe som gjør at væsken ikke berører gummiringen grensen.
- Når alle posisjoner på backing lysbildet er fylt opp, senk array lysbilde på den og montere den hybridisering kammeret. Pass på at den siden av rekken med å skrive på den vender backing lysbilde. Sørg for å stramme hybridisering kammer skruen fullt.
- Inspisere den sammensatte hybridisering kammeret. EONTROLLER at det ikke er noen lekkasje av hybridisering blanding utenfor gummiringen grenser, og hver luftboble er ~ 4 mm i høyde når hybridisering kammeret hviler på høykant vertikalt. Rotere hybridisering kammer og sjekk at det ikke er luftbobler som sitter fast i posisjon og ikke flytte. Hvis det er noen av disse, gi kammeret et lett slag på benken. Sjekk at alle luftbobler er i bevegelse.
- Plasser hybridisering kammeret i den roterende ovn ved 65 ° C i 24 timer. Pass på at ovnen rotoren er balansert; bruke andre tomme kamre om nødvendig.
5. Vask og skanner lysbilder
- Vask arrays for å fjerne overflødig merket DNA og deretter skanne å måle fluorescens av hver sonde.
- Ta hybridisering kamre ut av ovnen og demontere. Matrisen og paknings lysbilder vil bli sittende fast sammen; dukke disse i vaskebuffer en og bruke et par av plast, flat kanter tang å lirke dem fra hverandre.
- Discard pakningen lysbildet og plasser rekke lysbilde i et rack nedsenket i buffer 1.
- Vask matrisen lysbilde i ~ 700 ml av frisk vaskebuffer 1 i 5 minutter, under kraftig omrøring (bruke en loppe og en magnetrører).
- Overfør array lysbilde til ~ 700 ml vaskebuffer to og vaske for 90 sek, under kraftig omrøring. Løft forsiktig tabell glir ut av vaskebuffer to, bør de dukke opp tørr.
- Laste array lysbilde i en lysbildeholderen av skanneren, ved hjelp av et lysbilde beskytter. Laste lysbilde i radarantenne og skanne følgende array produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hver probe på en hybridiserte rekke visualiseres som en blanding av røde og grønne fluorokromer (se figur 1). Forholdet mellom rød til grønn fluorescerende signal for hver sonde er kvantifisert ved skanneren og tilhørende programvare plotter disse som log2 forhold i henhold til deres genomiske posisjon, og identifiserer områder som faller utenfor forhåndsinnstilte grenser. Den resulterende matrisen spor tillate tolkning av regioner identifisert som genomisk ubalansert. For eksempel, det spor fra et barn med Williams syndrom, en tilbakevendende microdeletion syndrom mediert av lave kopi gjentar i proksimale regionen av kromosom 7, er illustrert i figur 2. Denne ubalansen ble identifisert av programvaren og angitt med en rød linje.
Probe fluorescerende loggforhold bør cluster tett rundt 0, som vist i figur 2, noe som indikerer en grønn / rød-forhold på 1: 1 for normale regioner av genomet. Spredte array-spor kan Resul t i unøyaktig kall av unormale regioner, eller unnlatelse av å identifisere genomisk ubalanse (se figur 3). En slik spredning kan være forårsaket av en rekke faktorer, inkludert DNA dårlig kvalitet, eller tilstedeværelse av forhøyede nivåer av ozon i atmosfæren. Overvåking av ozonnivåer anbefales, og hvor forhøyede ozonnivåer er problematisk, dedikert ozoneksklusjons skap er tilgjengelig; bruk av disse kabinettene vanligvis resulterer i merkbart forbedret rekke kvalitet.
Figur 1. Bilde av en matrise etter hybridisering. Den hvite boksen viser et forstørret område, hvor røde prober og grønne prober kan visualiseres (som indikerer ubalanse for regionene representert ved disse sondene), mot en bakgrunn av gule sonder (indikerer balanserte genomiske regioner ).
Figur 2 (A) Eksempel spor for kromosom 7 i en prøve med en 1,7 MB delesjon, vist ved et gjennomsnittlig forhold på -0,8 til 43 på hverandre følgende prober. Den slettede region i dette tilfellet er assosiert med Williams-Beuren syndrom, i samsvar med henvisning indikasjon på dysmorphic funksjoner, en hjertefeil og utviklingshemming. (B) Den slettet region ovenfor vises i USCS genomet leseren, viser gener innenfor slettet region. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.Eksempel på et spredt spekter spor for kromosom 7 i en prøve med dårlig hybridisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Volum (mL) |
| Primere og reaksjon buffer | 20 |
| DNA (1 ug) + vann | 20 |
| Klenow Eksonuklease DNA polymerase | 10 |
Tabell 1. Sammendrag av de reagenser som brukes for merkingsreaksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Array CGH vil ikke oppdage balanserte rearrangements eller ploidinummer abnormaliteter som triploidy. Videre kan lavt nivå mosaikk ubalanser ikke påvises. Imidlertid har matrise CGH en høyere oppløsning for CNV deteksjon enn G-banded kromosom analyse som det har erstattet i mange cytogenetikk laboratorier. Det er derfor dagens gullstandard for genome-wide CNV deteksjon. Det kan erstattes av neste generasjons sekvense teknologier i fremtiden, men for tiden, deres kostnader og tekniske kompleksiteten forbundet med å bruke kort leser for CNV deteksjon mener at dette er ennå ikke en god plass for klinisk bruk.
Den protokoll som er beskrevet her er i vanlig bruk i vårt laboratorium klinisk tjeneste. To kjøringer av 96 prøver hver behandles hver uke ved hjelp av en flytende håndtering robot og en dedikert silika membran spin kolonne behandling robot. Automatisering er sterkt anbefalt å bedre konsistens og opprettholde kvalitet. DNA ble ekstrahert fra blod, Spytt, prenatal prøver (f.eks chorion villi eller fostervann) eller vevsprøver kan være, og rutinemessig er, brukes med denne protokollen.
Ozon er kjent for å nedbrytes cyaninfargestoffer og derfor ozon overvåking og anbefales. Sesongvariasjon i ozonnivåer er også vanlig. Våre laboratorie overvåker og registrerer ozonnivåer kontinuerlig. En veggmontert ozon fjerning enhet brukes til å redusere ozonnivåer og særlig sensitive deler av protokollen (dvs. vask og skanning arrays) utføres i ozonfrie hetter. Hvis det er mulig, er ozonnivåer holdes under 5 ppb.
De fleste reagenser er kjøpt som byggesett fra produsenter til å effektivt outsource kvalitetskontroll; Dette har vist seg å være en effektiv strategi. Men dette betyr ikke at kvalitetskontrollen ikke er nødvendig. Faktisk er kvalitet beregninger overvåkes nøye for eventuelle uregelmessigheter: derivat standardavvik på log2 forhold (dlrs) skal være Below 0,2, bør cyanin 3 og 5-signalintensiteten være større enn 500 og cyanin 3 og 5-signal til støyforhold bør være> 30. Disse beregningene er generert som en del av skanning protokollen ved skannerprogramvaren og registreres for langsiktig overvåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
