Summary
حلت محل مجموعة [ك] للكشف عن الجينومية المتغيرات في عدد النسخ تحليل النمط النووي G النطاقات. وتصف هذه الورقة التكنولوجيا وتطبيقاتها في مختبر خدمة التشخيص.
Introduction
وقد كان من المعروف لسنوات عديدة أن الحذف أو نسخ إضافية من شرائح الكروموسومات تسبب الإعاقة الفكرية، وخلل البنية؛ شوهة والتشوهات congentical، وفي بعض الحالات تسبب متلازمات وراثية 1. ومع ذلك، فإن التكنولوجيا الوحيدة المتاحة حتى منتصف 2000s للكشف على نطاق الجينوم من هذه التغييرات G-النطاقات تحليل كروموسوم، التي لديها قرار حول 5-10Mb، اعتمادا على المنطقة وطبيعة الخلل، والتي لا يمكن كشف الكروموسومات غير طبيعية حيث تم استبدال المواد من قبل المنطقة من كروموسوم مختلفة مع نمط النطاقات نفسه. كانت التقنيات الوراثية الخلوية الإضافية مثل مضان التهجين في الموقع ومتعدد ربط محددة التحقيق التضخيم في متاحة للاستجواب مواضع محددة، في حالات يشتبه الخلل المتلازمة محدد، لكنه لم يكن حتى إدخال مجموعة التهجين الجينومي المقارن (مجموعة [ك]) في الصورة الروتينية التشخيص السريريأصبح ervice 2-5 أن الكشف على نطاق الجينوم من عدد نسخ المتغيرات (التنوعات في عدد النسخ) ممكن في قرار زيادة كبيرة (عادة حوالي 120kb). وقد أظهرت أعمال الخدمة السريرية إلى جانب الدراسات البحثية أن التنوعات في عدد النسخ لبعض المناطق على نطاق واسع بين السكان العادي 6-7، في حين الآخرين التنوعات في عدد النسخ، غير قابلة للكشف في وقت سابق ترتبط مع neurodisabilities مثل التوحد والصرع 8-11.
يتم استخدام بروتوكول صفها في هذه الورقة في المملكة المتحدة لدينا الخدمة الصحية الوطنية (NHS) مختبر التشخيص السريري. نستخدم استراتيجيات التهجين جديدة، واختبار دفعة والروبوتات لتقليل التكلفة في هذه الخدمة التي تمولها الدولة.
قبل بروتوكول المفصلة أدناه، ينبغي استخراج DNA ذات جودة عالية من المواد الانطلاق المناسبة، عادة الدم، الخلايا المستزرعة أو عينات الأنسجة. الطيفي يمكن استخدامها لقياس تركيز (يجب أن يكون> 50 نانوغرام / UL) وتحقق 260: 280 نسب الامتصاصية (يجب بالبريد 1،8-2،0). الكهربائي للهلام يمكن استخدامها للتحقق من أن الحمض النووي هو من ارتفاع الوزن الجزيئي دون تدهور كبير.
تم تصميم هذا البروتوكول للمختبرات الإنتاجية المرتفعة التي وصفها 96 عينة في التشغيل باستخدام الآلي الروبوتات معالجة السائل. ومع ذلك، فإنه يمكن تكييفها لأقل معامل الإنتاجية دون الأتمتة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. وضع البطاقات التعريفية رد الفعل
- قبل استخدامها، dUTPs قبل قسامة cyanine 3 و 5 المسمى، النيوكليوتيدات غير المسماة والاشعال عشوائية في تركيزات الموصى بها الشركة المصنعة في لوحات وتخزين 96-جيدا في -20 C جاهزة للاستخدام. لأغراض هذا البروتوكول، وقسامة 10.5 ميكرولتر من dUTP المسمى الاقتضاء و 10.5 ميكرولتر النيوكليوتيدات غير المسماة والاشعال عشوائية لكل بئر.
- ذوبان الجليد لوحة الجاهزة للاستخدام 96-جيدا من النيوكليوتيدات والاشعال في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، محمية من الضوء.
- إذابة مرة واحدة، تتوازن هذه اللوحة في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل، محمية من الضوء.
- تتوازن عينات من الحمض النووي في 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، والاستغناء nuclease خالية من المياه إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا.
ملاحظة: إن حجم المياه تعتمد على تركيز كل عينة DNA المدخلات وينبغي أن تكون كافية لتؤدي إلى تركيز النهائي من 50 نانوغرام / UL. - باستخدام هان السائلdling الروبوت، ماصة 1 ميكروغرام من الحمض النووي في بئر من لوحة 96-جيدا (انظر 1.5)، ليصبح إجمالي حجم إلى 20 ميكرولتر.
ملاحظة: يمكن استخدام أصغر كميات من الحمض النووي على الرغم من أن نوعية البيانات الناتجة يجوز المساس (للعينات الثمينة، وكميات DNA إدخال تصل إلى 400 نانوغرام يمكن استخدامها). - باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، ونقل 20 ميكرولتر من النيوكليوتيدات معايرتها والاشعال في كل بئر من لوحة من الحمض النووي المخفف.
- ختم لوحة 96-جيدا مع قبعات الشريط (ختم ضيق أمر بالغ الأهمية).
- تفسد الحمض النووي في 99 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز PCR مع غطاء ساخنة وباردة ثم المفاجئة على الجليد لمدة 5 دقائق لالاشعال يصلب.
- باستخدام الروبوت معالجة السائل، وإضافة 10 ميكرولتر من Klenow إكسو DNA إنزيم البلمرة على كل السلطات الوطنية المعينة ومزيج ماصة بدقة.
ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الكلي 50 ميكرولتر. - ختم لوحة 96-جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
ملاحظة: الحضانة أقصر من 4 ساعات كافية ولكن لO / N فيcubation يمكن أن يكون أكثر ملاءمة. - باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، وإضافة 5 ميكرولتر من العازلة توقف إلى كل بئر.
ملاحظة: يتم عرض موجز للالكواشف المستخدمة للتفاعل وضع العلامات في الجدول 1.
2. إزالة الفردية النيوكليوتيدات
- إزالة النيوكليوتيدات الفردية باستخدام السيليكا غشاء أساس الأعمدة تدور والروبوت معالجة عمود الدوران المخصص (يمكن أيضا معالجة الأعمدة تدور يدويا). اتبع تعليمات الشركة الصانعة.
- نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب 2 مل. قبل تسمية هذه مع إسم البائع جيدا.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يؤديها يدويا أو باستخدام يفضل التعامل مع الروبوت السائل. - في حالة استخدام عمود الدوران وتجهيز الروبوت، ثم تحميل الروبوت مع 2 مل أنابيب، والأعمدة تدور تنقية الحمض النووي ومخازن المرتبطة بها.
- إضافة 250 ميكرولتر الملح عالية، والحمض النووي ملزمة عازلة (عازلة PB) إلى رد فعل التوسيم لربط الحمض النووي المسمى إلى السيليكاالغشاء.
- إزالة الشوائب عن طريق غسل غشاء مرتين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة (العازلة PE).
- إضافة 15 ميكرولتر منخفض شطف العازلة الملح (العازلة EB) إلى غشاء لاسترداد، DNA النقي وصفت في حجم ~ 12 ميكرولتر.
- نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب 2 مل. قبل تسمية هذه مع إسم البائع جيدا.
3. الجمع بين أزواج HYB
- الجمع بين الأزواج المناسبة من cyanine 3 و 5 DNA المسمى، COT-1 DNA، وهو مزيج عرقلة التي توفرها الشركة المصنعة وعازلة التهجين التي توفرها الشركة المصنعة باستخدام الروبوت التعامل مع السائل.
ملاحظة: هذه الأزواج HYB يمكن أن يكون نموذج والمرجعية، أو عينة مقابل عينة إذا المشتركة التنوعات هي ليست قضية (على سبيل المثال، ونحن بشكل روتيني الزوج عينات النمط الظاهري متطابقة، مثل النمو الشاذ المريض الكلوي مقابل المريض تعظم الدروز الباكر، لأنها جدا من غير المرجح أن تحمل نفس CNV هامة سريريا). في حالة استخدام الحمض النووي المرجعية، ويوصى إمدادات DNA التجاري، وينبغي أن تتم معالجتها إلى جانب العينة.- باستخدام معالجة السائل ريال عمانيبوت، إضافة COT-1 DNA (3333 نانوغرام / ميكرولتر)، ومنع المزيج وعازلة تهجين إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا بحيث يكون لكل يحتوي أيضا 1.1 ميكرولتر COT-1 DNA، 4.95 ميكرولتر مزيج الحجب و24.75 التي توفرها الشركة المصنعة ميكرولتر العازلة التهجين.
- إضافة 9.35 ميكرولتر من DNA cyanine المناسب 3 المسمى إلى كل بئر. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة.
- إضافة 9.35 ميكرولتر من DNA cyanine المناسب 5 المسمى إلى كل بئر. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة.
- ختم لوحة 96-جيدا ودوامة لمدة 1 دقيقة. تدور لوحة 96-جيدا لجمع محتويات في الجزء السفلي من كل بئر.
4. التهجين
- سخن الفرن التهجين إلى 65oC وprewarm شريحة واحدة دعم واحد غرفة التهجين لكل شريحة صفيف.
- تفسد الحمض النووي المسمى في الحضانة ما قبل التهجين قبل أن تنطبق على المصفوفات. أداء التهجين في فرن الدورية لمدة 24 ساعة.
- احتضان لوحة 96-جيدا عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تترك على 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
- العمل على منصة ساخنة في 42 درجة مئوية، وتحميل كل شريحة دعم في غرفة التهجين قبل استخدامها. تأكد من أن الجزء الشفاف من الشريحة طوقا محاذاة مع الجزء "إطارات" للغرفة التهجين.
- الماصة 42 ميكرولتر من مزيج التهجين معدة مسبقا (انظر القسم 3) على الموقف المناسب على مجموعة دعم الشرائح. قبل الرطب كل طرف لتعزيز pipetting لدقة. الماصة ببطء على مركز كل موقف، والتأكد من السائل لا تلمس الحدود حلقة مطاطية.
- وحالما يتم شغل كل المناصب على الشريحة الدعم، خفض بعناية الشريحة مجموعة على ذلك، وتجميع غرفة التهجين. تأكد من أن الجانب المصفوفة مع الكتابة على أنها تواجه الشريحة الدعم. تأكد من إحكام التهجين غرفة المسمار بالكامل.
- تفقد غرفة التهجين تجميعها. Eتكفل لللا يوجد أي تسرب من مزيج التهجين خارج حدود حلقة مطاطية وكل فقاعة الهواء ~ 4 مم في الارتفاع عند استراح في غرفة التهجين على نهايته عموديا. تدوير غرفة التهجين وتحقق من عدم وجود أي فقاعات الهواء التي عالقون في موقف وعدم التحرك. إذا كان هناك أي من هذه، وإعطاء الغرفة حنفية حاد على مقاعد البدلاء. تأكد من أن جميع فقاعات الهواء تتحرك.
- ضع غرفة التهجين في فرن الدورية عند 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تأكد من الدوار الفرن متوازن. استخدام غرف فارغة أخرى إذا لزم الأمر.
5. غسل والشرائح الضوئي
- غسل صفائف لإزالة الزائد المسمى DNA ثم مسح لقياس مضان من كل التحقيق.
- خذ غرف التهجين من الفرن وتفكيك. سوف يكون عالقا الشرائح مجموعة وحشية معا. غمر هذه في غسل العازلة 1 واستخدام زوج من البلاستيك، وملقط فوز شقة لابعاد بينهما.
- ديscard الشريحة حشية ووضع الشريحة مجموعة إلى رف المغمورة في المخزن 1.
- غسل الشريحة في مجموعة ~ 700 مل من غسل العازلة الطازجة 1 لمدة 5 دقائق مع التحريك بقوة (استخدام برغوث والنمام المغناطيسي).
- نقل الشريحة مجموعة إلى ~ 700 مل غسل عازلة 2 ويغسل لمدة 90 ثانية، واثارة بقوة. رفع بلطف الشرائح مجموعة من غسل العازلة 2، يجب أن ظهورها الجاف.
- تحميل الشريحة مجموعة إلى حامل الشريحة من الماسح الضوئي، وذلك باستخدام واقي الشريحة. تحميل الشريحة في مجموعة الماسح الضوئي والمسح الضوئي باتباع إرشادات الشركة المصنعة الصفيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتصور كل مسبار على مجموعة المهجنة على شكل مزيج من fluorochromes الأحمر والأخضر (انظر الشكل 1). وكميا نسبة اللون الأحمر إلى إشارة الفلورسنت الخضراء لكل التحقيق بواسطة الماسح الضوئي والبرامج المرتبطة المؤامرات هذه كما نسب log2 وفقا لموقفهم الجيني، ويحدد المناطق التي تقع خارج حدود محددة مسبقا. آثار مجموعة الناتجة تسمح تفسير المناطق تحديدها على أنها غير متوازنة genomically. على سبيل المثال، تتبع من طفل متلازمة وليامز، وهو متلازمة microdeletion المتكررة بوساطة يكرر نسخة منخفضة في المنطقة القريبة من كروموسوم 7، هو موضح في الشكل (2). وقد تم تحديد هذا الخلل من قبل البرنامج والمشار إليها بواسطة خط أحمر.
بحث يجب أن نسب سجل الفلورسنت العنقودية بشكل وثيق حول 0، كما هو مبين في الشكل 2، مما يدل على أن نسبة خضراء / حمراء 1: 1 لمناطق طبيعية من الجينوم. آثار مجموعة متناثرة قد بالنتيجه تي في الدعوة غير دقيقة للمناطق غير طبيعية، أو الفشل في تحديد الخلل الجيني (انظر الشكل 3). قد يكون سبب هذا مبعثر من قبل عدد من العوامل، بما في ذلك نوعية الحمض النووي الفقراء، أو وجود ارتفاع مستويات الأوزون في الغلاف الجوي. ويوصى رصد مستويات الأوزون، وحيث مستويات الاوزون مرتفعة هي الإشكالية، هي مكرسة خزانات استبعاد الأوزون يتوفر؛ استخدام هذه الخزانات النتائج عموما في تحسين ملحوظ نوعية صفيف.
الشكل 1. صورة من مجموعة التهجين التالية. ويظهر مربع أبيض منطقة مكبرة، حيث تحقيقات الحمراء والخضراء تحقيقات يمكن تصور (تشير إلى عدم التوازن للمناطق التي تمثلها هذه التحقيقات)، على خلفية تحقيقات الصفراء (تشير إلى المناطق الجينومية متوازنة ).
الشكل 2. (A) مثال أثر للكروموسوم 7 في عينة مع حذف 1.7MB، يتضح من متوسط نسبة -0.8 43 تحقيقات متتالية. ويرتبط المنطقة المحذوفة في هذه الحالة يعانون من متلازمة وليامز-بيرون، بما يتفق مع دلالة الإحالة من الميزات تشوه، وجود خلل في القلب والإعاقة الذهنية. (ب) منطقة حذف فوق عرض في مستعرض USCS الجينوم، والتي تبين الجينات داخل المحذوفة المنطقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3).مثال على أثر مجموعة متناثرة لكروموسوم 7 في عينة مع الفقراء التهجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كاشف | الحجم (ميكرولتر) |
| الاشعال ورد فعل العازلة | 20 |
| الحمض النووي (1μg) + الماء | 20 |
| Klenow نوكلياز خارجية DNA بوليميريز | 10 |
الجدول 1. ملخص من الكواشف المستخدمة للتفاعل وضع العلامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومجموعة [ك] لم يكشف إعادة ترتيب متوازنة أو تشوهات الصيغة الصبغية مثل تثلث الصيغة الصبغية. وعلاوة على ذلك، قد لا يتم الكشف عن الاختلالات الفسيفساء مستوى منخفض. ومع ذلك، مجموعة [ك] لديها دقة أعلى للكشف CNV من التحليل الصبغي G النطاقات الذي حل محله في العديد من المختبرات علم الوراثة الخلوية. ولذلك فمن معيار الذهب الحالي لالجينوم على نطاق الكشف CNV. ويمكن استبداله تقنيات التسلسل الجيل القادم في المستقبل لكن في الوقت الراهن، تكلفتها والتعقيدات التقنية المرتبطة باستخدام باختصار يقرأ للكشف CNV يعني أن هذه ليست حتى الآن مناسبا للاستخدام السريري.
بروتوكول الموصوفة هنا هو في الاستخدام الروتيني في المختبر خدمة السريري لدينا. تتم معالجة اثنان أشواط من كل 96 عينات من كل أسبوع باستخدام الروبوت التعامل مع السائل ومخصص غشاء السيليكا معالجة عمود الدوران الروبوت. ينصح بشدة الآلي لتحسين الاتساق والحفاظ على الجودة. الحمض النووي المستخرج من الدمواللعاب، وعينات ما قبل الولادة (على سبيل المثال، الزغابات المشيمية أو السائل الذي يحيط بالجنين)، أو عينات الأنسجة يمكن أن يكون، وبشكل روتيني غير، وتستخدم مع هذا البروتوكول.
ومن المعروف الأوزون للحط من الأصباغ cyanine وبالتالي يوصى رصد الأوزون وحمايتها. التغيرات الموسمية في مستويات الأوزون هي أيضا شائعة. مراقبو مختبرنا ومستويات سجلات الأوزون بشكل مستمر. ويتم استخدام وحدة إزالة الأوزون الحائط للحد من مستويات الأوزون وأجزاء حساسة بشكل خاص للبروتوكول (أي والغسيل والمسح صفائف) يتم تنفيذها في اغطية خالية من الأوزون. إذا كان ذلك ممكنا، يتم الاحتفاظ مستويات الأوزون أقل من 5 جزء في البليون.
ويتم شراء معظم الكواشف إلى مجموعات من الشركات المصنعة الاستعانة بمصادر خارجية على نحو فعال مراقبة الجودة؛ وقد أثبت هذا أن يكون استراتيجية فعالة. ومع ذلك، هذا لا يعني أن مراقبة الجودة غير مطلوب. في الواقع، يتم مراقبة مقاييس جودة بعناية لأي الشذوذ: الانحراف المعياري مشتق من نسب log2 (دولار اميركي) ينبغي لبelow 0.2، يجب أن يكون cyanine 3 و 5-إشارة شدة أكبر من 500 وcyanine 3 و 5 إشارة إلى أن نسب الضوضاء يكون> 30. يتم إنشاء هذه المقاييس كجزء من بروتوكول المسح من قبل برنامج المسح وسجلت لرصد المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
![مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/51718.jpg)
