Summary
Array CGH til påvisning af genomiske kopital varianter har erstattet G-banded karyotype-analyse. Dette papir beskriver den teknologi og dens anvendelse i en diagnostisk tjeneste laboratorium.
Introduction
Det har været kendt i mange år, at deletioner eller ekstra kopier af kromosomale segmenter forårsager intellektuelle handicap, dysmorphism og congentical misdannelser, og i nogle tilfælde forårsage genetiske syndromer 1. Den eneste teknologi, der findes indtil midten af 2000'erne for hele genomet detektion af disse ændringer var imidlertid G-banded kromosom analyse, som har en opløsning på omkring 5-10 MB, afhængigt af region og arten af den ubalance, og som ikke kan opdage unormale kromosomer hvor materialet er blevet erstattet af en region fra et andet kromosom med samme banding mønster. Accessoriske cytogenetiske teknikker såsom fluorescens in situ hybridisering og multiplex ligation-specifik probe forstærkning har været til rådighed for afhøring af specifikke loci, i tilfælde af mistanke om specifik syndromisk ubalance, men det var ikke før indførelsen af matrix komparativ genomisk hybridisering (array CGH) i rutinemæssig klinisk diagnostisk service 2-5 at genom-dækkende påvisning af kopi nummer varianter (CNVs) blev mulig på et stærkt forøget opløsning (typisk omkring 120 KB). Klinisk servicearbejde sideløbende undersøgelser har vist, at CNVs for nogle regioner er udbredt i den normale population 6-7, anden CNVs mens tidligere målbart, er forbundet med neurodisabilities som autisme og epilepsi 8-11.
Den i dette papir protokol bruges i vores UK National Health Service (NHS) klinisk diagnostisk laboratorium; vi bruger nye hybridiseringsmetoder strategier, batch test og robotteknologi til at minimere omkostningerne i denne statsfinansieret tjeneste.
Forud for protokollen beskrevet nedenfor, bør høj kvalitet DNA ekstraheres fra det passende udgangsmateriale, almindeligvis blod, dyrkede celler eller vævsprøver. Spektrofotometri kan anvendes til at måle koncentrationen (bør være> 50 ng / ul), og kontroller 260: 280 absorbans forhold (bør be 1,8-2,0). Gelelektroforese kan anvendes til at kontrollere, at DNA'et er af høj molekylvægt uden væsentlig nedbrydning.
Denne protokol er beregnet til højere gennemløb laboratorier, som er mærkning 96 prøver pr run hjælp af automatiserede håndtering af flydende robotteknologi. Det kan imidlertid være indrettet til lavere gennemløb labs uden automation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mærkningen Reaktion
- Inden brug pre-alikvot cyanin 3 og 5-mærkede dUTPs, umærkede nukleotider og tilfældige primere ved producenten anbefalede koncentrationer i 96 brønde plader og opbevares ved -20 C klar til brug. Med henblik på denne protokol, portion 10,5 pi af den passende mærket dUTP og 10,5 pi umærkede nukleotider og tilfældige primere til hver brønd.
- Optø klar-til-brug 96-brønds plade af nukleotider og primere ved 4 ° C i ca. 1 time, beskyttet mod lys.
- Når optøet, ækvilibrere denne plade ved stuetemperatur i mindst 30 min, beskyttet mod lys.
- Ækvilibrer DNA-prøver ved 60 ° C i mindst 15 min.
- Ved hjælp af en væske håndteringsrobot, dispensere nuclease-frit vand til hver brønd i en 96-brønds plade.
BEMÆRK: Mængden af vand vil afhænge af koncentrationen af hvert input DNA-prøve og bør være tilstrækkelig til at resultere i en endelig koncentration på 50 ng / ul. - Ved hjælp af en væske hehandlingsaggregater robot, pipette 1 ug af DNA i en brønd af 96-brønds plade (se 1.5) for at bringe det samlede rumfang til 20 pi.
BEMÆRK: Der kan anvendes mindre mængder af DNA selv om kvaliteten af resulterende data kan være kompromitteret (for dyrebare prøver, kan bruges input DNA mængder ned til 400 ng). - Ved hjælp af en væske håndteringsrobot overføres 20 pi af den ækvilibrerede nukleotider og primere i hver brønd af pladen af fortyndet DNA.
- Seal 96-brønds plade med strip hætter (en tæt forsegling er afgørende).
- Denaturere DNA ved 99 ° C i 10 minutter i en PCR-maskine med en opvarmet låg og derefter snap afkøles på is i 5 minutter til at anneale primere.
- Ved hjælp af en flydende håndtering robot, tilsættes 10 pi Klenow Exo DNA-polymerase enzym til hver DNA og pipette blandes grundigt.
BEMÆRK: Det samlede volumen skal være 50 pi. - Seal 96-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer.
BEMÆRK: En kortere inkubationstid på 4 timer er tilstrækkelig dog en O / N icubation kan være mere praktisk. - Ved hjælp af en væske håndteringsrobot tilsættes 5 ul stoppuffer til hver brønd.
BEMÆRK: En sammenfatning af de anvendte reagenser til mærkning reaktionen er vist i tabel 1.
2. Fjernelse af inkorporerede nukleotider
- Fjern inkorporerede nukleotider under anvendelse af silica-membran baseret spinsøjler og en dedikeret spinkolonne forarbejdning robot (spin søjler kan også behandles manuelt). Følg producentens anvisninger.
- Overfør indholdet af hver brønd til en 2 ml rør; pre-label disse med såvel ID'er.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres manuelt eller fortrinsvis ved hjælp af en flydende håndteringsrobot. - Hvis du bruger et spin kolonne behandling robot, læg robotten med 2 ml rør, DNA rensning spin-søjler og tilhørende buffere.
- Tilføj 250 pi høj salt, DNA-bindende buffer (buffer PB) mærkning reaktion til at binde det mærkede DNA til silicamembran.
- Fjerne urenheder ved vask af membranen to gange med 500 pi vaskepuffer (puffer PE).
- Der tilsættes 15 pi lav salt elueringsbuffer (buffer EB) til membranen at genvinde oprensede mærkede DNA i et volumen på ~ 12 pi.
- Overfør indholdet af hver brønd til en 2 ml rør; pre-label disse med såvel ID'er.
3. Kombiner Hyb Pairs
- De passende par af cyanin 3 og 5-mærket DNA, COT-1 DNA, en producent-leveret blokerende mix og en producent-leveret hybridiseringsbuffer ved hjælp af en væske håndtering robot.
BEMÆRK: Disse HYB par kan være en prøve og en reference, eller prøve vs prøve, hvis delte CNVs er ikke et problem (f.eks vi rutinemæssigt parre fænotype-uoverensstemmende prøver, såsom en nyre dysplasi patient vs en craniosynostosis patient, som de er meget usandsynligt, at bære den samme klinisk signifikant CNV). Hvis du bruger en reference-dna, er en kommerciel DNA forsyning anbefales, og det skal behandles sammen med prøven.- Ved hjælp af en flydende håndtering robot tilsættes COT-1-DNA (3333 ng / pl), fabrikanten leveret blokerende mix og hybridiseringspuffer til hver brønd i en 96-brønds plade, således at hver brønd indeholder 1,1 pi COT-1-DNA, 4,95 pi blokerende mix og 24,75 pi hybridiseringspuffer.
- Tilføj 9,35 pi af den passende cyanin 3-mærket DNA til hver brønd. Pre-vådt hver spids at øge pipettering nøjagtighed.
- Tilføj 9,35 pi af den passende cyanin 5-mærket DNA til hver brønd. Pre-vådt hver spids at øge pipettering nøjagtighed.
- Seal 96-brønds plade og vortex i 1 min. Spin 96-brønds plade til at indsamle indhold i bunden af hver brønd.
4. Hybridisering
- Forvarm en hybridisering ovnen til 65oC og Forvarm en opbakning dias og en hybridisering kammer for hvert array dias.
- Denaturere mærkede DNA i en præ-hybridisering inkubering før de anvender til arrays. Udfør hybridisering i en roterende ovn i 24 timer.
- Inkubér 96-brønds plade ved 70 ° C i 30 minutter og derefter forlade ved 37 ° C i mindst 5 min.
- Arbejder på en opvarmet platform ved 42 ° C, indlæse hver opbakning dias ind i et hybridiseringskammeret før brug. Sørg for, at den gennemsigtige del af pakningen slide flugter med "windowed" del af hybridiseringskammeret.
- Pipetter 42 pi af hybridiseringsblanding forberedt tidligere (se afsnit 3) på den korrekte position på array'et opbakning dias. Pre-vådt hver spids at øge pipettering nøjagtighed. Pipet langsomt på midten af hver position, og sørg for at væsken ikke rører gummiringen grænsen.
- Når alle positioner på opbakning slide er fyldt, sænk forsigtigt array slide på den og samle hybridiseringskammeret. Sørg for, at den side af array med at skrive på den står den opbakning dias. Sørg for at spænde hybridiseringskammeret skruen helt.
- Undersøg den samlede hybridisering kammer. Ensure at der ikke er lækage af hybridisering mix uden for gummiring grænser og hver luftboble er ~ 4 mm i højden, når hybridiseringskammeret er hvilede på sin ende lodret. Drej hybridiseringskammeret og kontrollere, at der ikke er nogen luftbobler, der sidder fast i position og ikke bevæger sig. Hvis der er nogen af dem, giver kammeret en skarp hane på bænken. Kontroller, at alle luftbobler er i bevægelse.
- Placer hybridisering kammer i den roterende ovn ved 65 ° C i 24 timer. Sørg for, at ovnen rotor er afbalanceret; anvende andre tomme kamre, hvis nødvendigt.
5. Vask og scanning af dias
- Vask arrays for at fjerne overskydende mærket DNA og derefter scanne at måle fluorescensen af hver probe.
- Tag hybridiseringsegenskaber kamre ud af ovnen og demontere. Array og pakningen slides vil blive holdt sammen; nedsænkes disse i vaskebuffer 1 og bruge et par af plast, flade kantede pincet til at lirke dem fra hinanden.
- Discard pakningen slide og placere array dias i et rack nedsænket i buffer 1.
- Vask array dias i ~ 700 ml frisk vaskebuffer 1 i 5 minutter, kraftig omrøring (brug en loppe og en magnetisk omrører).
- Overfør array dias til ~ 700 ml vaskebuffer 2 og vask i 90 sek, kraftig omrøring. Løft forsigtigt array glider ud af vaskebuffer 2 skal de opstår tørre.
- Læg array dias i et dias indehaver af scanneren ved hjælp af en dias beskytter. Læg glide ind array scanneren og scanne efter array producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hver probe på en hybridiseret array visualiseres som en blanding af røde og grønne fluorochromer (se figur 1). Forholdet mellem rød til grøn fluorescerende signal for hver probe kvantificeres ved scanneren og tilhørende software plotter disse som log2 nøgletal efter deres genomiske position, og identificerer områder, der falder uden forudindstillede grænser. De resulterende array-spor tillader fortolkning af regionerne identificeret som genomisk ubalanceret. For eksempel spor fra et barn med Williams syndrom, en tilbagevendende mikrodeletion syndrom medieret af lavt kopiantal gentagelser i den proximale region af kromosom 7, er illustreret i figur 2. Denne ubalance blev identificeret af softwaren og angivet ved en rød linie.
Probe fluorescerende log forhold bør klynge tæt omkring 0, som vist i figur 2, hvilket indikerer en grøn / rød forhold på 1: 1 for normale områder af genomet. Spredte array-spor kan Resul t i unøjagtig kaldelse af unormale områder eller manglende identifikation genomisk ubalance (se figur 3). En sådan scatter kan være forårsaget af en række faktorer, herunder dårlig DNA kvalitet, eller tilstedeværelsen af forhøjede niveauer af ozon i atmosfæren. Overvågning af ozonniveauet anbefales, og hvor forhøjede ozonniveauer er problematiske, er tilgængelige dedikerede ozon udelukkelse frysere; anvendelse af disse kabinetter generelt resulterer i markant forbedret matrix kvalitet.
Figur 1. Billede af et array efter hybridisering. Den hvide boks viser et forstørret område, hvor der kan visualiseres røde sonder og grønne sonder (med angivelse ubalance for de regioner, der er repræsenteret af disse prober), på baggrund af gule sonder (hvilket indikerer afbalancerede genomiske regioner ).
Figur 2. (A) Eksempel spor til kromosom 7 i en prøve med en 1.7MB sletning, vist med en gennemsnitlig ratio på -0,8 i 43 på hinanden følgende prober. Den slettede region i dette tilfælde er forbundet med Williams-Beuren syndrom, i overensstemmelse med den henvisning angivelse af dysmorphic funktioner, en hjertefejl og intellektuel handicap. (B) Den slettede region ovenfor vises i USCS genom browser, der viser gener i den slettede region. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3.Eksempel på en spredt vifte spor til kromosom 7 i en prøve med dårlig hybridisering. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Reagens | Volume (ul) |
| Primere og reaktionsbuffer | 20 |
| DNA (1 ug) + vand | 20 |
| Klenow exonuclease DNA-polymerase | 10 |
Tabel 1. Oversigt over de anvendte reagenser til mærkning reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Array CGH vil ikke registrere afbalancerede rearrangementer eller ploidi abnormiteter såsom triploidy. Endvidere kan lavt niveau mosaik ubalancer ikke påvises. Men matrix CGH har en højere opløsning for CNV detektion end G-banded kromosom analyse, som den har erstattet i mange cytogenetik laboratorier. Det er derfor den aktuelle gold standard for hele genomet CNV detektion. Det kan erstattes af næste generation sekventering teknologier i fremtiden, men i øjeblikket, deres omkostninger og de tekniske kompleksitet forbundet med at bruge kort læser for CNV afsløring betyder, at det endnu ikke er et godt match til klinisk brug.
Den her beskrevne protokol er i rutinemæssig brug i vores kliniske tjeneste laboratorium. To kørsler af 96 prøver hver behandles hver uge ved anvendelse af en flydende håndteringsrobot og en dedikeret silicamembranen spinkolonne forarbejdning robot. Automation anbefales stærkt at forbedre konsekvensen og bevare kvaliteten. DNA ekstraheret fra blod, Spyt, prænatal prøver (f.eks chorionvilli eller fostervand) eller vævsprøver kan være, og rutinemæssigt, der bruges med denne protokol.
Ozon er kendt for at nedbryde cyaninfarvestoffer, og derfor anbefales ozon overvågning og beskyttelse. Sæsonvariation i ozonniveauerne er også almindeligt. Vores laboratorium skærme og optegnelser ozonniveauerne kontinuerligt. En vægmonteret ozon fjernelse enhed bruges til at reducere ozonniveauer og særligt følsomme dele af protokollen (dvs. vask og scanning arrays) udføres i ozon-fri hætter. Hvis det er muligt, holdes ozonniveauerne under 5 ppb.
De fleste reagenser købt som samlesæt fra fabrikanter til effektivt outsource kvalitetskontrol; dette har vist sig at være en effektiv strategi. Men det betyder ikke, at der ikke kræves kvalitetskontrol. Faktisk er kvalitets målinger overvåges omhyggeligt for uregelmæssigheder: derivat standardafvigelse for log2 forhold (DLRS) bør below 0,2, bør cyanin 3 og 5-signalintensiteter være større end 500 og cyanin 3 og 5-signal-støj-forhold bør være> 30. Disse målinger genereres som en del af scanning-protokollen ved scanning software og registreres for langsigtet overvågning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
