Summary
CGH array para la detección de variantes de número de copias genómicas ha reemplazado análisis de cariotipo de bandas-G. Este artículo describe la tecnología y su aplicación en un laboratorio de servicio de diagnóstico.
Introduction
Se ha sabido durante muchos años que las supresiones o copias extra de segmentos cromosómicos provocan discapacidad intelectual, dismorfia y malformaciones congentical, y en algunos casos causar síndromes genéticos 1. Sin embargo, la única tecnología disponible hasta mediados de la década de 2000 para la detección de todo el genoma de estos cambios fue G-bandas cromosoma análisis, que tiene una resolución de alrededor de 5-10 MB, dependiendo de la región y la naturaleza de los desequilibrios, y que no puede detectar cromosomas anormales donde el material ha sido reemplazado por una región de un cromosoma diferente con el mismo patrón de bandas. Técnicas citogenéticas auxiliares tales como la hibridación fluorescente in situ y la sonda de amplificación ligadura específica multiplex han estado disponibles durante el interrogatorio de loci específicos, en los casos de sospecha de desequilibrio sindrómico específico, pero no fue hasta la introducción de la gama de hibridación genómica comparada (CGH array) en s de diagnóstico clínico de rutinaervicio 2-5 que la detección de todo el genoma de las variantes de número de copias (CNV) se hizo posible en un gran aumento de resolución (por lo general alrededor de 120kb). Trabajos de servicio clínico junto estudios de investigación han demostrado que la CNV para algunas regiones se han generalizado en la población normal 6-7, mientras que otro CNV, previamente indetectables, están asociados con neurodisabilities como el autismo y la epilepsia 8-11.
El protocolo descrito en este documento se utiliza en nuestro laboratorio de diagnóstico clínico UK National Health Service (NHS); utilizamos estrategias de hibridación novela, ensayo de lotes y la robótica para minimizar el costo de este servicio financiado por el estado.
Antes de el protocolo detallado a continuación, el ADN de alta calidad debe ser extraído del material de partida apropiado, comúnmente sangre, células cultivadas o muestras de tejido. Espectrofotometría se puede utilizar para medir la concentración (debe ser> 50 ng / ul) y comprobar 260: 280 razón de absorbancia (b debee 1,8-2,0). La electroforesis en gel se puede utilizar para verificar que el ADN es de alto peso molecular sin degradación significativa.
Este protocolo está diseñado para los laboratorios de mayor rendimiento que está etiquetando 96 muestras por corrida utilizando la robótica de manipulación de líquidos automatizados. Sin embargo, puede ser adaptado para laboratorios de rendimiento inferiores sin automatización.
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Protocol
Reacción 1. El etiquetado
- Antes de su uso, dUTPs pre-alícuota cianina 3 y 5-etiquetados, nucleótidos no marcados y cebadores aleatorios en las concentraciones recomendadas por el fabricante en placas y tienda de 96 pocillos a -20 C listo para su uso. A los fines de este protocolo, alícuota 10,5 l de la dUTP etiquetado apropiado y 10,5 l nucleótidos no marcados y cebadores aleatorios a cada pocillo.
- Descongelar la placa lista para el uso de 96 pocillos de nucleótidos y cebadores a 4 ° C durante aproximadamente 1 hora, protegido de la luz.
- Una vez descongelado, esta placa de equilibrar a temperatura ambiente durante al menos 30 min, protegido de la luz.
- Equilibrar muestras de ADN a 60 ° C durante al menos 15 min.
- El uso de un robot de manejo de líquidos, dispensar agua libre de nucleasa a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
NOTA: El volumen de agua dependerá de la concentración de cada muestra de ADN de entrada y debe ser suficiente para dar lugar a una concentración final de 50 ng / ul. - El uso de un líquido de hanrobot dling, pipeta de 1 g de ADN en un pocillo de la placa de 96 pocillos (véase 1.5) para llevar el volumen total a 20 l.
NOTA: Pequeñas cantidades de ADN se pueden usar aunque la calidad de los datos resultantes puede verse comprometida (para muestras preciosas, cantidades de ADN de entrada abajo a 400 ng pueden ser utilizados). - El uso de un robot de manejo de líquidos, transferir 20 l de los nucleótidos y cebadores equilibradas en cada pocillo de la placa de DNA diluido.
- Sellar la placa de 96 pocillos con tapas de la tira (un sello hermético es crucial).
- Desnaturalizar el ADN a 99 ° C durante 10 min en una máquina de PCR con una tapa calentada y luego haga presión fría en hielo durante 5 min a cebadores de recocido.
- El uso de un robot de manipulación de líquidos, añadir 10 l de ADN Exo Klenow enzima polimerasa de ADN y cada mezcla pipeta a fondo.
NOTA: El volumen total debe ser de 50 l. - Sellar la placa de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C durante 16 horas.
NOTA: Una incubación más corto de 4 horas es suficiente, sin embargo un O / N enincubación puede ser más conveniente. - El uso de un robot de manejo de líquidos, añadir 5 l de tampón de parada a cada pocillo.
NOTA: Un resumen de los reactivos utilizados para la reacción de marcaje se muestra en la Tabla 1.
2. La eliminación de nucleótidos no incorporados
- Retire los nucleótidos no incorporados utilizando sílice-membrana basada columnas giratorias y un robot de procesamiento spin columna dedicada (las columnas de giro también se pueden procesar de forma manual). Siga las instrucciones del fabricante.
- Transferir el contenido de cada pocillo a un tubo de 2 ml; pre-etiqueta de estos con las identificaciones así.
NOTA: Este paso se puede realizar manualmente o preferiblemente usando un robot de manejo de líquidos. - Si se utiliza un robot de procesamiento columna de centrifugación, a continuación, cargar el robot con tubos de 2 ml, spin columnas de purificación de ADN y tampones asociados.
- Añadir 250 l de sal alta, el ADN de tampón de unión (tampón PB) para la reacción de marcaje para unir el ADN marcado a la sílicemembrana.
- Eliminar las impurezas por lavado de la membrana dos veces con 500 l de tampón de lavado (tampón PE).
- Añadir 15 l de tampón de elución de baja sal (tampón EB) a la membrana para recuperar el, ADN marcado purificado en un volumen de ~ 12 l.
- Transferir el contenido de cada pocillo a un tubo de 2 ml; pre-etiqueta de estos con las identificaciones así.
3. Combine Pairs Hyb
- Combine los pares apropiados de cianina 3 y 5 de ADN marcado, COT-1 DNA, una mezcla de bloqueo suministrado por el fabricante y un tampón de hibridación suministrado por el fabricante con un robot de manejo de líquidos.
NOTA: Estos pares Hyb pueden ser una muestra y una referencia o muestra vs muestra si CNVs compartido no son un problema (por ejemplo, emparejamos rutinariamente muestras-fenotipo no coincidentes, como un paciente displasia renal vs un paciente craneosinostosis, ya que son muy poco probable que llevar la misma clínicamente significativa CNV). Si se utiliza un ADN de referencia, se recomienda un suministro de ADN comercial, y debe ser procesado junto con la muestra.- El uso de un tratamiento de líquidos robot, añadir COT-1 DNA (3333 ng / l), el suministrado por el fabricante de la mezcla y el bloqueo de tampón de hibridación a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de manera que cada pocillo contiene 1,1 l COT-1 DNA, 4,95 l de la mezcla de bloqueo y 24,75 tampón de hibridación l.
- Añadir 9,35 l de la DNA de cianina apropiado marcado con 3 a cada pocillo. Pre-húmedo cada punta para mejorar la precisión de pipeteo.
- Añadir 9,35 l de la DNA de cianina apropiado marcado con 5 a cada pocillo. Pre-húmedo cada punta para mejorar la precisión de pipeteo.
- Sellar la placa de 96 pocillos y agitar durante 1 min. Girar la placa de 96 pocillos para recoger contenidos en la parte inferior de cada pocillo.
4. La hibridación
- Precaliente un horno de hibridación a 65 ° C y precalentar una diapositiva de respaldo y una cámara de hibridación para cada diapositiva matriz.
- Desnaturalizar el ADN marcado en una incubación de pre-hibridación antes de ser aplicable a los arrays. Realizar la hibridación en un horno giratorio durante 24 horas.
- Incubar la placa de 96 pocillos a 70 ° C durante 30 min y luego salir a 37 ° C durante al menos 5 min.
- Trabajando en una plataforma se calentó a 42 ° C, cargar copias de cada diapositiva en una cámara de hibridación antes de su uso. Asegúrese de que la parte transparente de la diapositiva junta se alinea con la parte 'con ventanas' de la cámara de hibridación.
- Pipetear 42 l de la mezcla de hibridación preparado previamente (ver sección 3) en la posición adecuada en la matriz de diapositivas respaldo. Pre-húmedo cada punta para mejorar la precisión de pipeteo. Pipeta lentamente hacia el centro de cada posición, asegurándose de que el líquido no toca el límite del anillo de goma.
- Una vez que todas las posiciones de la diapositiva respaldo están llenos, cuidadosamente baje la diapositiva matriz en él y montar la cámara de hibridación. Asegúrese de que el lado de la matriz con la escritura en él se enfrenta a la diapositiva respaldo. Asegúrese de apretar el tornillo de cámara de hibridación totalmente.
- Inspeccione la cámara de hibridación montado. Esegurar que no hay fugas de mezcla de hibridación fuera de los límites de los anillos de goma y cada burbuja de aire es de ~ 4 mm de altura cuando la cámara de hibridación se apoya en su extremo verticalmente. Gire la cámara de hibridación y compruebe que no haya burbujas de aire que están atascados en posición y no se mueve. Si hay alguno de estos, dar la cámara de un golpe seco en el banquillo. Compruebe que todas las burbujas de aire se mueven.
- Coloque la cámara de hibridación en el horno giratorio a 65 ° C durante 24 hr. Asegúrese de que el rotor del horno está equilibrado; utilizar otras cámaras vacías si es necesario.
5. Lavado y Escaneo de diapositivas
- Lávese las matrices para eliminar ADN marcado exceso y luego escanear para medir la fluorescencia de cada sonda.
- Tome cámaras de hibridación fuera del horno y desmontar. Las diapositivas de la matriz y de la junta serán pegadas; sumergir estos en tampón de lavado 1 y utilizar un par de pinzas, de plástico plana filo para separarlas.
- Discard la diapositiva junta y colocar la placa matriz en un rack sumergido en tampón 1.
- Lavar el portaobjetos matriz en ~ 700 ml de tampón de lavado fresca 1 durante 5 min, se agita vigorosamente (utilizar una pulga y un agitador magnético).
- Transferir el portaobjetos matriz a ~ 700 ml de tampón de lavado 2 y lavar durante 90 segundos, revolviendo vigorosamente. Levante suavemente las diapositivas de matriz fuera de tampón de lavado 2, deben surgir seco.
- Cargar la diapositiva matriz en un soporte de diapositivas del escáner, utilizando un protector de diapositivas. Cargue la diapositiva en el escáner matriz y escanear siguiendo las instrucciones del fabricante matriz.
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Representative Results
Cada sonda en una matriz hibridada se visualiza como una mezcla de fluorocromos rojo y verde (véase la Figura 1). La proporción de rojo a la señal fluorescente verde para cada sonda se cuantifica por el escáner y el software asociado traza en log2 ratios de acuerdo a su posición genómica, e identifica las regiones incluidas límites preestablecidos fuera. Las huellas de la matriz resultantes permiten la interpretación de las regiones identificadas como genómicamente desequilibrada. Por ejemplo, la traza de un niño con síndrome de Williams, un síndrome de microdeleción recurrente mediada por baja copia repite en la región proximal del cromosoma 7, se ilustra en la Figura 2. Este desequilibrio fue identificado por el software y se indica mediante una línea roja.
Sonda ratios de registro fluorescentes deben agruparse estrechamente alrededor de 0, como se muestra en la Figura 2, lo que indica una relación de verde / rojo de 1: 1 para las regiones normales del genoma. Rastros de matriz dispersos pueden Resul t en el llamamiento inexacta de las regiones anormales, o falta de identificación de desequilibrio genómico (ver Figura 3). Tal dispersión puede ser causada por una serie de factores, incluyendo la calidad pobre de ADN, o la presencia de niveles elevados de ozono en la atmósfera. Se recomienda la monitorización de los niveles de ozono, y donde los niveles de ozono elevados son problemáticos, gabinetes de exclusión ozono dedicados están disponibles; uso de estos gabinetes generalmente resulta en una mejor calidad notablemente matriz.
Figura 1. Imagen de una matriz después de la hibridación. La caja blanca muestra un área ampliada, donde las sondas rojas y verdes sondas se pueden visualizar (indicando desequilibrio de las regiones representadas por estas sondas), en un contexto de sondas de color amarillo (que indica regiones genómicas equilibradas ).
Figura 2. (A) Ejemplo de rastreo para el cromosoma 7 en una muestra con una deleción 1.7MB, mostrada por una relación media de -0,8 para 43 sondeos consecutivos. La región eliminada en este caso se asocia con el síndrome de Williams-Beuren, en consonancia con la indicación de referencia de rasgos dismórficos, un defecto del corazón y la discapacidad intelectual. (B) La región eliminada anteriormente se muestra en el navegador genoma USCS, mostrando los genes dentro del borrado región. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3.Ejemplo de una traza matriz dispersa para el cromosoma 7 en una muestra con la mala hibridación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Volumen (l) |
| Imprimaciones y tampón de reacción | 20 |
| ADN (1μg) + agua | 20 |
| ADN exonucleasa de la polimerasa Klenow | 10 |
Tabla 1. Resumen de los reactivos utilizados para la reacción de marcaje.
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Discussion
Array CGH no detectará reordenamientos balanceados o anormalidades ploidía como triploidía. Además, los desequilibrios de mosaico de bajo nivel no se pueden detectar. Sin embargo, array CGH tiene una mayor resolución para la detección de la CNV de análisis cromosómico bandas-G del cual ha sustituido en muchos laboratorios de citogenética. Por lo tanto, es el actual estándar de oro para la detección de la CNV en todo el genoma. Puede ser reemplazado por las tecnologías de secuenciación de próxima generación en el futuro, pero actualmente, su costo y la complejidad técnica asociada con el uso a corto lee para la detección CNV significa que esto todavía no es una buena opción para el uso clínico.
El protocolo descrito aquí es de uso rutinario en el laboratorio de servicio clínico. Dos carreras de 96 muestras cada una se procesan cada semana usando un robot de manejo de líquidos y un robot dedicado procesamiento spin columna membrana de sílica. Automatización es muy recomendable para mejorar la consistencia y mantener la calidad. ADN extraído de sangre, Saliva, muestras prenatales (por ejemplo, vellosidades coriónicas o líquido amniótico) o muestras de tejido pueden ser, y de manera rutinaria, es decir, se utiliza con este protocolo.
El ozono es conocido para degradar los colorantes de cianina y por lo tanto se recomienda la vigilancia y protección del ozono. La variación estacional en los niveles de ozono también es común. Nuestros monitores de laboratorio y los niveles de los registros de ozono continuamente. Una unidad de eliminación de la capa de ozono en la pared se utiliza para reducir los niveles de ozono y zonas especialmente sensibles de protocolo (es decir, lavado y escaneo arrays) se llevan a cabo en las campanas libre de ozono. Si es posible, los niveles de ozono se mantienen por debajo de 5 ppb.
La mayoría de los reactivos se compran como kits de fabricantes para externalizar efectivamente el control de calidad; esto ha demostrado ser una estrategia efectiva. Sin embargo, esto no significa que no se requiere control de calidad. De hecho, las métricas de calidad son monitoreados cuidadosamente en busca de anomalías: desviación estándar derivado de log2 ratios (LDI) debe ser below 0.2, cianina 3 y 5-señal intensidades deben ser mayores que 500 y cianina 3 y 5 de señal a ruido deben ser> 30. Estas métricas se generan como parte del protocolo de exploración por el software de escaneo y se registran para el seguimiento a largo plazo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
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