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Biology

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

Introduction

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장기 문화는 생체 내 연구에서 복잡하지만 관련성이 높은 사이의 간격 및 세포 라인 모델의 편리하지만 대략적인 시뮬레이션을 다리에 유용한 모델을 제공합니다. 췌장의 경우, 내분비와 외분비 세포 시뮬레이션 세포주가 변형 되더라도 췌장 전구 세포로 완전히 동등한 어떠한 세포주도 없다. 성인 전체 췌장을 배양 할 수 없습니다; 절연 내분비 아일렛 세포 증식없이 몇 주 동안 유지 될 수 있으며, 조직 조각은 몇 시간에서 5 시험 관내에서 유지 될 수있다. 배아의 췌장 문화가 널리 개발을 연구뿐만 아니라 사용되었습니다뿐만 아니라 8을 처리하는 이미지로, 상피 - 간엽 상호 작용 4,6,7을 조사하기 위해 화학적으로 그 9 방해 할 수 있습니다. 두 기관 배양 방법이 주로 사용된다 : 첫 번째는 conve입니다 피브로넥틴 코팅 플레이트 2에 췌장 꽃 봉오리를 배양에 구성촬상 목적 더욱 편리 할; 두 번째 옵션은 문화에 가장 형태 형성을 유지 공기 - 액체 인터페이스 3,4에서 필터에 대한 기관입니다. 매우 유용하지만, 이러한 방법은 평탄화의 어느 정도 이어질; 정상적인 발달에 비해 시작 인구가 췌장 세포 및 중간 엽 세포의 모든 유형을 포함하는 복잡한 같이 선조의 팽창은 매우 제한된다.

문화 능력과 분산 일차 전지를 확장 계보 관계를 연구하고 고립 된 세포 유형 (10)의 고유 특성을 발견 할 가치가있다. 스기야마 등. 11 췌장 전구 세포 및 피더 레이어에 문화에 3 ~ 5 일 일부 기능 문자를 유지 내분비 전구 세포를 유지할 수 있습니다. 조상의 자연 / 줄기 세포하지만 neurosphere를 12, 13 mammospheres에 가깝다 Pancreatospheres는 성인 독도 및 유관 세포에서 확장되었습니다이러한 분야를 생성하는 것은 명확하지 않다. 또, 생리 현상과는 대조적으로, pancreatospheres 일부 뉴런에게 14,15을 함유 하였다. 분야는 최근 배아 췌장 전구 세포 (16, 17)과 좋은 시조 확장 이후의 분화와 pancreata 18 재생에서 생산하지만, 형태 형성을 요점을 되풀이하는 데 실패했다.

소형 기관에 자체 조직으로 분산 종종 정의 세포에서 3D 모델은 최근 번성하고 소장 (19, 20),(21),(22), 전립선 (23)과 기관 등의 여러 장기의 개발 또는 성인 매출을 시뮬레이션 한 24. 광섬유 컵 25, 26 또는 뇌 부위 (27)의 경우와 같이 몇몇 경우에, 형태 형성 발달과 분화는, ES 세포로부터 3D로 효과적으로 요약되었다.

여기, 우리 DES그들은 차별화 자체 구성 할 수 있습니다 3D 리겔 비계에서 해리 다 능성 췌장 전구 세포를 확장하는 방법을 cribe.

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Protocol

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이 프로토콜은 쥐 E10.5에서 파생 된 췌장 organoids 상피 췌장 세포를 해리 성장하는 것을 목표로하고있다.

이 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리적 승인을 필요로합니다.

E10.5 마우스 배아에서 지느러미 췌장 버드 1. 해부

  1. 가위로 복부를 열고 배아 일 (E) 10.5 초과 임신 쥐를 희생, 두 자궁 뿔을 제거하고 차가운 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 둘 베코 가득 10cm 페트리 접시에 배치 수정 필수적인 매체 (DMEM)을 얼음에 보관. 세포 파종에 희생에서 전체 실험은 세포 손상을 방지하기 위해 60 ~ 90 분에 이루어집니다.
  2. 작은 가위를 사용하여 개별 배아 세그먼트로 자궁을 분리합니다. 차가운 PBS와 35mm 페트리 접시에 하나의 배아를 전송하고 위의 조명과 해부 현미경을 시각화. 해부 집게와 주변 근육, 탈락과 노른자 SA를 제거C와 배아를 노출합니다. 다시 차가운 DMEM 매체에 배아를 놓습니다. 태아 간단 3 ㎖ 플라스틱 전송 피펫 / 적기를 사용하여 전송 될 수있다. 계속하기 전에 유사한 방식으로 모든 개인 배아를 분리합니다.
  3. PBS에 깨끗한 35mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다.
    1. 앞다리를 제거하는 얇은 집게 (0.05 mm 폭)를 사용합니다. 조심스럽게 척수 지역에서 소화 기관 (그림 1)을 분리 개방에 집게를 삽입합니다. 선택 사항 : 더 편리하게, 위를 참조하십시오 아래 노른자 줄기 아래 마음과 꼬리 영역으로, 태아의 상체를 제거합니다.
    2. 위, 간, 소장을 찾습니다. 집게를 사용하여 소장에 위장에서 소화 기관을 분리하고 (그림 1) 얼음에 차가운 DMEM에 배치합니다. 지느러미 췌장 꽃 봉오리는 위장 등쪽, 후부 (그림 1)가 포함되어 있습니다.
    3. 시미에있는 모든 개인 위장관 분리계속하기 전에 고맙다 방식. 배아 유전자형을해야 할 경우, 절개시에 꼬리를 수집하고 얼음에 차가운 DMEM과 24 웰 플레이트에서 다른 잘되는 모든 개인 위장관을 유지합니다.
  4. 차가운 PBS에 깨끗한 35mm 페트리 접시에 한 위장관 놓습니다. 이제 해부 현미경 등의 췌장 봉오리를 시각화하고 해부 시야에서 아래에서 조명을 사용합니다. 이러한 조건은 볼륨의 시각화를 최적화합니다. 전해 날카롭게 텅스텐 바늘 또는 20 G 주사기 바늘을 사용하여, 상피 주위 가급적 간엽 가진 췌장 새싹 (도 1)을 격리.
    1. 2 ~ 3 분 동안 차가운 디스 파제 용액 (1.25 ㎎ / ㎖)를 포함하는 배양 접시에 고립 된 꽃 봉오리를 전송합니다. 이 시점에서 전송이 가장 편리하게 입 통제 유연한 튜브에 부착 불꽃 뽑아 50 μL 유리 모세관을 수행 할 수 있습니다. 대안 적으로, 그러나 더 RI 함께새싹을 잃을 SK는 적절한 플라스틱 팁을 10 μL 자동 피펫 (Pipetman)를 사용합니다.
    2. 미세한 제어 췌장 봉오리 흡입과 배출을 수행합니다. 다시 PBS에서 췌장 봉오리를 넣어. 또한 유리 모세관 (그림 1)를 사용하여 바늘과 부드러운 열망을 가진 중간 엽에서 분리 된 췌장 봉오리를 청소합니다.
    3. 전체 중간 엽을 제거 할 때, 차가운 PBS에서 췌장 싹 씻어; (60 - 웰 미니 트레이 차가운 DMEM 10 μL로 가득) 개인 우물에서 차가운 DMEM 각 봉오리를 전송합니다. 그것은 조직이 매우 끈적하게하는, 디스 파제에서 중간 엽을 제거하지 않는 것이 중요합니다.

분산 된 세포의 2. 도금 및 문화

  1. 세정 10 ㎕의 PBS로 가득 60도 미니 트레이의 원추형의 우물에 불꽃 뽑아 유리 모세관 모든 배아에서 해부 상피를 전송합니다.
    1. 트립신 0.05 %의 10 μL에 꽃 봉오리로 이동ND는 4 분 동안 37 ° C에서 배양 할 수 있습니다. 10 μL의 DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 우물에 새싹 전송하여 트립신을 불 활성화.
    2. 피펫 풀러으로 뽑아가는 모세 혈관을 통해 흡인 세포 현탁액을 떼어 놓다. 이것은 세포를 해리 상하 피펫 팅하면서이 단계에서 기포를 방지하는 것이 중요하다. 췌장 organoids 최적 ~ 15 세포의 작은 그룹에서 시작하기 때문에 부분적인 분리는 (그림 1)를 추천합니다.
  2. 개별 처리로 인한 차이를 최소화하기 위해 에펜 도르프 튜브에 몇개의 배아 세포를 해변. 1:3 비율로 냉장 마트 리겔에서 세포 현탁액을 희석. 나누어지는 96 - 웰 플레이트, 8 μL / 잘 또는 영상에 최적화 된 접시에 (아래 참조)이 혼합물.
  3. 리겔은 두껍게 할 수 있도록 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 선택의 매체의 70 μL로 우물을 채우기 (organoid 또는 구, 탭보기 참조레 1, 2), 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 %의 공기를 포함하는 습한 환경에서 떠나
  4. 매 4 일째 매체를 교체합니다. 매일 성장하는 췌장 식민지를 모니터링 및 이미징하여 프로세스를 문서화합니다.
  5. 이전에보고 된 28 또한 작은 분자 또는 단백질, 간섭 실험을 위해이 단계에서 배지에 첨가 할 수있다.

표 1 : Organoid 매체.

소재의 이름 주식 집중 최종 매체에 집중 주식의 볼륨
페니실린 - 스트렙토 마이신 100 % 1 % 50 μL
녹아웃 혈청 교체 (보충) 100 % 10 % 500 μL
2 - 머 캅토 에탄올 14.3 M 0.1 ㎜ 1 μL
포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 16 μM 16 nM의 5 μL
Y-27632 (ROCK 저해제) 50 mM의 10 μM 1 μL
EGF 50 ㎍ / ㎖의 25 NG / ML 2.5 ㎕의
재조합 인간 1 R-spondin 250 ㎍ / ㎖의 500 NG / ML 10 μL
- 또는 -
재조합 마우스 R-spondin 1 250 ㎍ / ㎖의 500 NG / ML 10 μL
재조합 인간 FGF1 (aFGF) 100 ㎍ / ㎖의 25 ㎍ / ㎖의 1.25 μL
헤파린 (Liquemin) 2500 U / ㎖ 2.5 U / ㎖ 2 μL
권장binant 인간 FGF10 100 ㎍ / ㎖의 100 NG / ML 5 μL
DMEM/F-12 4,412.25 μL
합계 5,000 μL

표 2 : 구 매체.

소재의 이름 주식 집중 최종 매체에 집중 주식의 볼륨
페니실린 - 스트렙토 마이신 100 % 1 % 50 μL
B27의 X50 (보충) 100 % 10 % 100 μL
재조합 인간 FGF2 (bFGF를) 100 ㎍ / ㎖의 64 NG / ML 3.2 ㎕의
Y-27632 (ROCK 저해제) 50 mM의 10 μM 1 μL
DMEM/F-12 4845.8 μL
합계 5000 μL

Organoid 개발의 진행 상황 3. 영상

  1. 이미지 organoids 하나를 매일 또는 시간 경과 현미경 형광 시간 경과 현미경을 사용하여. 시간 경과 영상의 경우, XY (Z) 자동 거꾸로 형광 현미경을 사용합니다.
  2. 4 - 웰 플레이트 또는 2-5 ML 매체로 채워진 유리 바닥 접시에 3 μL의 예금 작은 방울. 배 장거리 목적으로 이미지. 참고 : 형광 트레이서을 표현 형질 전환 마우스를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 영화 1은 Pdx1 - Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + 마우스 4에서 organoids의 초기 확장. 핵 GFP 개별 개체 만 유사한 원리는 형광 막과 세포를 추적하는 데 적용 할 수있는 세포를 추적 할 수 있도록 사용자가 그러한MT / MG 마우스 29로.
  3. 초점이 감도을 방지하고 수동으로 정의 된 위치에 3 일 이상 1 사진 / 시간을 취할 수있는 소프트웨어 제어 자동화를 설정하는 세포를 파종 한 후 시간 경과 영상 3 시간을 시작합니다. 각 위치에 대한, 형광 마커의 발현을보고, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지뿐만 아니라, GFP 신호를 획득.

조직학에 대한 Organoids 4. 복구

  1. 얼음에 96 - 웰 플레이트를 배치하고 얼음 차가운 PBS로 교체, 매체를 제거합니다. 이것은 부분적으로 리겔을 해중합.
  2. 조심스럽게 전체 아키텍처를 방해하지하기 위해 1000 μL 팁을 사용하여 주변의 리겔을 제거, 각 organoid를 대기음. 얼음 차가운 PBS로 잘 각 organoid을 전송합니다. 얼음에 플레이트를 유지합니다. 리겔 직접 고정도 가능합니다.
  3. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 15 분 동안 organoid 고쳐 자당에 냉동 보존 및 젤라틴에 포함. 각 처리organoid 이전 (요한슨 등., 2007) 4 기술로 저온 절편 제작 및 조직학에 대한.

PCR 및 생화학을위한 Organoids 5. 복구

  1. 얼음에 96 - 웰 플레이트를 놓고 매체를 제거합니다. 세포의 RNA를 안정시키고 보호하기 위해 잘 당 RNAlater의 60 μl를 추가합니다.
  2. 부분적으로 얼음을 해중합하여 각 아니라 기계적에서 젤을 방해. 전체 아키텍처를 중단 또는 200 μL 팁으로 기계적으로 젤을 방해하여 (리겔 포함) 전체를 잘 복구 할 수 있도록 1000 μL 팁을 사용하여 개별 organoids를 복구 하나. 이는 RNAse 무료 끈적 에펜 도르프 튜브에 잘 콘텐츠를 전송하기 위해 1000 μL 팁을 사용하여 얼음에 보관.
  3. 60 μL의 RNAlater에 우물을 세척하고 같은 에펜 도르프 튜브에 남아있는 내용을 추가합니다.
  4. 4 ℃에서 500 ~ 1,000 XG에서 5 분 튜브를 스핀
  5. 만 20 ~ 30 μl를 떠나, 뜨는을 제거함께 펠릿과 튜브 RNAlater의. 생화학의 경​​우, 가능한 한 건조 샘플을 저장합니다.
  6. 즉시 RNAlater에서 샘플을 동결하지 마십시오; 4 ° CO / N에 상점 (RNAlater 철저하게 조직을 침투 할 수 있도록). 조직은 장기 저장을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 나중에 조직의 파괴와 RNA의 소량의 추출을 위해 처리 할 수​​ 있습니다.

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Representative Results

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3D 리겔에서 해리와 시드 E10.5 지느러미 췌장 전구 세포는 췌장 개발을 요점을 되풀이하다. 조상은 쉽게 형광 기자와 올 수 있습니다. 우리의 경우 우리는 (그림 2) Neurog3 4 활성화하지 않고 타목시펜의 부재에 따라서 Pdx1 프로모터 (Pdx1 - Ngn3-ER TM-nGFP) (동영상 1)에 의해 제어되는 핵 GFP 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 사용.

organoid 매체와, 세포의 작은 클러스터의 초기 압축은 제 시간에 발생한다. 확장 후 처음 4 일 동안 클러스터의 확대 (도 2a)에 의해 검출 될 수있다. 5 일에서 분기 20 % 큰 organoids에 형성한다. 단일 세포를 확장하고 대형 클러스터 Pdx1 식 (28)을 그대로 유지하면서 Pdx1 식을 잃지 않는다.

이러한 조건에서, 조상은 사양을 받다분기 상피 구조의 출현과 tacular의 형태 형성. 조상이 지역 사회의 신호에 대한 강한 요구를 나타내는 ≥ 4 - 세포 클러스터에서 접종하는 경우에만이 과정이 일어난다. 외분비 (아밀라아제 +) 또는 내분비 (인슐린 + 또는 하나를 표현하고 차별화 된 세포 : 조직 학적 분석은 문화의 날 7 후, 생성 된 미니 기관이 췌장 전구 세포 (그림 3B SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + 세포)로 구성되어 있음을 알 수 글루카곤 +) 마커 (그림 3A, C). 내분비 세포로 분화 (0.1 % 정도) 내생 췌장에서보다 하부이지만 FGF1이 배양액 (28)에 첨가되지 않은 경우 1 %로 증가된다. 현저하게, 시드 조상 예상 췌장 계통으로 분화 할뿐 아니라, 그들은 또한 자발적으로 정상적인 췌장 구조를 채용하고 있습니다. 비록 E10.5 다 능성 췌장 전구 세포는 중앙 루멘에 직면 막에 Mucin1와 aPKC의 분리에 의해 입증하고 그들이 분지 관 네트워크로 구성하는 등 문화의 세포가 극성을, 편광되지 않습니다. 지역적인 "팁과 트렁크"도메인이 등장 : 선방 세포는 세포의 일부 또는 전체 왕관으로 주변에있는 동안 HNF1B + 전구 세포와 내분비 세포는 중앙 지역에서 지역화됩니다. organoids는 10 일 동안 배양에서 유지 될 수있다; 이 기간 후에, 그들은 일반적으로 자신의 건축 조직을 잃고 낭성 (도시하지 않음)가된다. 계대 부분 해리 후에 수행되지만 신속 낭종 형성, BMP Noggin의 억제제 (28)의 첨가에 의해 감소되는 현상에 이르게 할 수있다.

구 매체로, 확장이 더 자주하고 단일 세포의 2 %에서 볼 수 있습니다; 그럼에도 구 형성의 효율은 seede의 크기와 상관D 클러스터 28. 하루에 2 / 3에서, 루멘은 가끔 지역 다층 영역 (그림 2B)로 크게 모노 층 중공 분야에 선도적 인, 그 후 작은 클러스터에서 감지되고 확장된다. 리겔 (그림 3D-H)에서 검색 할 때이 분야는 축소합니다. 이러한 조건에서 얻어진 구조는 주로 12 일에 분화 외분비와 내분비 세포의 작은 비율 (도 3d-H)로, 췌장 전구 세포로 구성된다. 모든 셀 (그림 3 층)의 중앙 루멘에 직면 막에서 aPKC의 분리에 의해 입증으로 분야의 조상은, 치근단 편광된다. Pancreatospheres 적어도 두 (미도시) 계대 될 수있다.

그림 1
그림 1. procedur의 도식 표현전자. 위장관는 초기 배아에서 해부하며 이후 지느러미 췌장 꽃 봉오리 격리됩니다. 간엽 제거하고, 췌장 전구 세포는 트립신을 사용하여 분해된다. 얻어진 부분적으로 분산 된 후 세포 성장 인자 제거 된 매트 리겔에서 낮은 밀도로 시딩 하였다. 바 확장 :. 스케일 바는 200 ㎛ 인 결과 organoid 그림을 제외하고 1.00 mm를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
시간이 지남에 따라 문화의 그림 2. 진행. (A) organoid 매체로 성장하고 60 시간 동안, 도금 후 3 시간에서 시간 경과 현미경에 따라 췌장 전구 세포의 작은 클러스터. 보ttom 패널, 문화의 7 일 후에 organoid. 스케일 바 : 200 ㎛; A. 모든 패널에 적용되는 구 (B) 예 60 시간 경과에 따라 문화의 날 7시에 촬영. 스케일 바 : 200 ㎛; B에서 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 조직학. 7 일간의 (AC) 시리얼 부분은 전구 (B - HNF1B) 스테인드 organoid과 분화 (A - 아밀라아제, C - 인슐린) 마커. organoid는 상피로 구성되어있다 (A - E-cadherin의) 및 치근단 (B - mucin1) 편광 세포. 점선은 비 포상 중앙 영역 (A)에 대응한다HNF1B (B) 및 내분비 (C) 세포를 감지 전구 스테인드 7 일 구체 (DH) 섹션. (G - HNF1B, H - SOX9) 내분비 (D - 인슐린과 글루카곤) 마커. 상피 (E - E-cadherin의) - 세포 분야는 치근단 (aPKC D, F) 편광으로 구성되어있다. 스케일 바 :. 50 ㎛가 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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시험 관내에서 기능적인 베타 세포의 대규모 생산은 여전히 하나 비효율적이다. 이 도전적인 상황에서, 발달 생물학 연구 기능의 베타 세포의 분화에 필요한 정확한 신호를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 체외에서 배아의 췌장 전구 세포의 유지 보수, 확장과 차별화 할 수 있습니다. 이것은 다른 내분비 호르몬을 공동으로 표현하지 않는 인슐린을 생산하는 베타 세포의 형성을 포함, Pdx1 높은 수준의 인슐린을 성숙하고 처리 된 인슐린 (28)이 프로 convertases을 표현했다. 시스템 내에서 중요한 핵심 요소는 (외생 적 헤파린에 의해 potentiated 추가 FGF에 의해 자극) FGF의 활동이며, 노치 (내인성) 신호 전달 경로뿐만 아니라 Y-27632에 의해 바위 - 억제 : 그 요인의 부재, 혹은 전혀 organoids 및 분야의 제한된 번호가 28을 생성 하였다. FGF 및 안 요구CH 활성은 쉽게 생체 28 췌장 개발의 중요도를 기준으로 이해된다. ROCK 저해제는 해리가 모두 증가 세포 죽음, 전구 전사 인자 Pdx1의 강력한 억제와 확장의 부족으로 리드에 따라서 미사 역학의 hyperactivati​​on를 공개, blebbistatin로 치환 될 수있다. 흥미롭게도, organoid 매체의 많은 추가 구성 요소를 개별적으로 필요로 입증 된, 그러나 그들의 결합 부재 (28)를 분기 상피의 손실을 초래했다. 매체의 특정 필수 성분 이외에, 그것은 조상의 해리의 레벨을 제어하는​​ 것이 중요하다. 사실, 전구의 증식과 Pdx1 유지 보수는 크게 4 개 이상의 세포의 그룹으로 승격됩니다. 압축은 Pdx1을 유지하고 확장하는 실패 컴팩트 결과 첫 12 시간과 실패에서 관찰 할 수있다. ROCK 저해제는이 필수적이다과정.

FACS는 정렬되지만, 시스템의 효율이 잠재적 전구 세포의 개수를 조절 재 응집에 의해 개선 될 수 후 모멘트 organoids에 형성되지 않는다. 이 배양 시스템의 또 다른 중요한 요소는 3D 행렬이다. 세포는 리겔 또는 플레이트 확산의 바닥에 너무 가까이 리겔에 넣어 Pdx1 식을 잃게됩니다. 리겔은 대부분 생화학 적 구성 요소, 특히 라미닌뿐만 아니라 기계적인 신호 (28)를 제공한다. 실제로, 매트릭스의 강성이 중요한 역할을한다. 뻣뻣한 하이드로 겔은 췌장 전구 세포의 유지 보수 및 확장 (28) 관대하지 않으며 희석 리겔은 하나가 아닙니다. 리겔이 희석되면 1시 10분 췌장 전구 세포를 배양 할 수 없습니다.

organoid 시스템은 생존, 증식, 분화, 양극화의 관점에서 췌장 전구 세포에 작은 분자 및 재조합 단백질의 효과를 테스트하는 데 사용하고 분기 할 수 있습니다28. 또한 췌장 개발 28 동안 서로 다른 세포 유형의 협력을 테스트하는 데 사용될 수있다. 우리는 췌장 전구 세포의 접근은 다른 organoid 시스템 17,27에서와 같이 바이러스 성 표적으로 유전자 조작을 허용 것이라고 확신하고 있습니다. 이것은 여기 16,17,28로 이전뿐만 아니라 기술 분야와 달리 형태 형성을 가능하게하는 시스템을 17 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 우리는 또한 개발 한 배양 조건이 혈청되는 장점을 제시 피더 프리함으로써 셀룰러 및 생화학 적 복잡성을 감소 간엽 및 혈관의 결여. 그러나, 통로 organoids하는 능력에 제한이 있고, 따라서 전구 세포를 대량으로 수득 하였다. 이 embryon에서 생산 췌장 전구 세포의 소스에, 조상 더 풍부한 개발 후기 단계에 프로토콜의 적응에 의해 미래에 피할 수있다IC 줄기 (ES) 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 세포. 이것은 인간의 췌장 개발의 3D 모델에 대한 방법을 불법 체류자.

이 시스템은 또한 잠재적으로 치료의 관점에서 미래 췌장 세포의 생산을 위해 사용될 수있다. 이러한 맥락에서, 이식을위한 기능성 베타 세포의 생산은 잠재적으로 당뇨병 치료에 도움이 될 것이다. 인간 ES 또는 iPS 세포에 대한 시스템의 적응이 목적을 위해 중요 할 것입니다. 그것은 organoid 또는 구 조건을 사용할지 여부를 아직 확실하지 않다. organoid 조건은 성숙한 베타 세포의 여러 가지 특성을 가지고 있지만, 그 기능을 시험하기 위하여 남아있는 세포의 생산을 허용한다. 그러나, 이러한 셀은 현재 수많은 아니며 다른 셀 사이에서 혼합된다. 그것은 organoid 시스템의 이질성의 초기 모양은 세포 사이의 제어되지 않은 신호에 이르게하기 때문에 생산에 해로운 것이 아니라 가능성이 높습니다.

티조상을 유지 그는 구 시스템은 원칙적으로 조상의 제어 확장 및 계대 바람직하지만, 그 이후의 분화를 제어 할 수 남아 있습니다. 기타 최근에 효율적으로 차별화 할 수 pancreatospheres을 생산. 그것은 다른 프로토콜 16, 17로 얻은 분야에 피더 및 혈청없는 현재의 프로토콜에서 얻어진 분야의 성격을 비교하는 것이 중요 할 것입니다. 보기의 치료 관점에서 복잡성과 리겔의 생물학적 기원은 재현성, 건강 및 확장 성 문제를 구성 할 수있다. 예비 결과는 라미닌으로 작용 부드러운 하이드로 겔은 체외에서 췌장 전구 확장을위한 관대 한 것으로 나타났습니다. 이 젤은 아직 리겔 28만큼 효율적이지로 추가 최적화가 필요합니다.

그들의 자연적인 맥락에서 베타 세포의 생산은 잠재적으로 베타를 높일 시험 약물에 도움이 될 수 있습니다세포 활동 또는 생존 또는 증식을 증가하지만, 이러한 목적을 위해 먼저 분화의 효율을 증가시키고, 여기에 제시된 배양 조건이 더 나은 전류보다 아일렛을 유지하는지 여부를 테스트하기 위해 베타 세포의 성숙 정도를 테스트하는 것이 중요 할 것이다 서스펜션 문화. 외분비 췌장을 생산하면 췌장암과 췌장염을 표적으로하는 약물을 개발하는 것이 유용 할 수 있습니다. 여기서 다시, 생산 외분비 세포의 성숙의 정도를 충분히 조사 할 필요가있다.

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Acknowledgments

이 작품은 Det에 FRIE Forskningsråd / Sundhed OG Sygdom에서 유전학 파일럿 상에 NCCR 프론티어, 청소년 당뇨병 연구 재단의 41-2009-775 그랜트 12-126875 순차적으로 투자되었다. 저자는 비디오 촬영을 호스팅 스파 놀리 실험실 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

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References

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분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 <em>생체</em> 췌장 기관 <em>형성에</em>
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Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

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