Introduction
Дофаминергический (DA) нейроны можно найти в нескольких областях мозга, в том числе среднего мозга, гипоталамуса, сетчатке и обонятельных луковиц. Нейроны A9 DA в черной субстанции Парс компактов (SNPC) поведения управления и движения, проецируя на полосатом теле в переднем мозге и формирования экстрапирамидной системы двигателя. Вырождение A9 DA нейронов приводит к болезни Паркинсона (БП), который является вторым наиболее распространенным человек нейродегенеративные расстройства и в настоящее время неизлечимыми. Замена Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных стратегий для лечения PD 1, поэтому, там был большой интерес при выводе A9 DA нейроны от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), в том числе и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и Недавнее человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).
Много исследований попытались вывести A9 DA нейроны от hPSCs с использованием различных методов. Самые ранние отчеты все генерируемые DA нейроны через нейроннуюрозетка этап предшественников. По совместном культивировании с MS5 2 или ПА6 3-5 стромальных клеток с или без внешних факторов роста в течение 2-4 недель, L. Studer и коллегами и трех других групп успешно индуцированных ЭСК, чтобы произвести нейронных розетки. Затем они обогатили эти розетки от механического вскрытия или ферментативного расщепления для дальнейшей дифференциации. В других докладах, исследователи генерируется нейронных розетки через эмбриоидов тела (EB) плавающие культуры дифференциацию 6-9. Позже исследователи установили монослоя на основе метода дифференциации 10,11, где они покрытием ЭСК и hiPSCs на внеклеточного матрикса, добавили различные факторы роста в культуре, чтобы вызвать дифференциацию hPSCs к DA нейронов, которая имитирует в естественных условиях развития эмбриональных DA нейронов . Хотя все эти исследования получены тирозингидроксилазу (TH) экспрессирующие клетки с некоторыми характеристиками DA нейронов, весь процесс дифференциации время и трудоемким,как правило, неэффективно, и что более важно, A9 идентичность этих нейронов не были продемонстрированы в большинстве исследований, кроме одного с LMX1a эктопической экспрессии 12. В последнее время новый плиты перекрытия (FP) основанное был разработан протокол 13-16, в котором предшественники FP с DA нейронов потенциала были впервые подготовлена путем активации звуковой ежа и канонических Wnt сигнальных путей на ранней стадии дифференцировки, а затем эти клетки FP были дополнительно указываться в DA нейронов. Хотя этот протокол является более эффективным, все еще существуют некоторые проблемы; Например, весь процесс дифференциации занимает много времени (по крайней мере, 35 дней), и это зависит от клеток-фидеров 15, или EB зависит 16 или личность A9 не была продемонстрирована 14.
Здесь, на основе знаний из в естественных условиях эмбрионального развития DA нейронов и опубликованных результатов других исследователей, мы оптимизировали условий культивирования для эфпоколение циент из DA нейронов обеих ЭСК и hiPSCs. Мы сначала формируют клетки FP-предшественников путем активации канонической передачи сигналов Wnt с небольшой молекулы CHIR99021 и звуковой еж сигнализации с малых молекул SAG и purmorphamine. Эти FP клетки выразить Foxa2, LMX1a, Корин, Otx2 и нестин. Мы тогда определенном эти FP клетки к DA нейронов с факторами роста, включая BDNF, GDNF, и т.д.. Сформированные DA нейроны имеют A9 типа клеток, поскольку они являются позитивными для GIRK2 а отрицательный для кальбиндин 17. Этот протокол подачи клетка или EB независимо, высокой эффективностью и воспроизводимостью. Используя этот протокол, можно получить DA нейроны менее чем за 4 недели от ЭСК или hiPSCs нормальных людей для клеточной трансплантационной исследования, или от hiPSCs пациентов с БП для моделирования в пробирке PD или тестирования потенциальных терапевтических агентов для PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 приготовления питательных сред
- Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) среды путем объединения следующее: 445 мл DMEM, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл 100x пенициллин / ампициллину маточного раствора. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 14 дней.
- Подготовка содержащей сыворотку культуральной среды HPSC путем объединения следующий: 385 мл DMEM / F12, 100 мл замены нокаутом в сыворотке крови (КСР), 5 мл 100x не-незаменимую аминокислоту раствор, 5 мл 100x пенициллин / ампициллин исходный раствор, 5 мл 100x -mercaptoethanol маточного раствора, и 10 нг / мл bFGF. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.
- Подготовка mTeSR1 бессывороточной среды путем объединения следующее: 400 мл mTeSR1 базальной среды, 100 мл 5x добавки, и 5 мл 100x пенициллин / ампициллин раствор. Хранить среды при 4 ° С в течение не более 10 дней.
- Подготовка 10x коллагеназы IV маточного раствора: отвешивать 0,5 г коллагеназы IV власть, ирастворить его с 50 мл DMEM / F12 и фильтра стерилизуют. Сделать аликвоты и запастись их при -20 ° С в течение нескольких месяцев.
- Готовят 0,1% раствор желатина: отвесить 0,5 г желатина (из бычьей кожи, тип B) мощности и растворить его деионизованной водой. Держите автоклаве стерилизуют раствор при комнатной температуре в течение недели.
- Подготовьте KSR дифференциации среды путем объединения следующих: 410 мл DMEM, 75 мл KSR, 5 мл 100x несущественные аминокислоты исходного раствора, 5 мл 100x пенициллин / ампициллин маточного раствора, 5 мл 100x -mercaptoethanol маточного раствора. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: KSR варьируется от партии к партии, которые могут повлиять на эффективность дифференциации. Поэтому лучше, чтобы проверить несколько партий KSR найти лучший для дифференциации. - Подготовьте N2 дифференциации среды путем объединения следующих: 98 мл DMEM, 1 мл 100x N2 дополнения и 1 мл 100x пенициллина / ампициллин маточного раствора. Держите фильтр стерилизовать среду на 4° C в течение не более 10 дней.
- Подготовка B27 дифференциации среды путем объединения следующий: 480 мл Neurobasal среду, 10 мл 50x B27 добавки, 5 мл 100x глютамаксом маточного раствора, и 5 мл 100x пенициллин / ампициллин раствор. Хранить фильтр стерилизуют среду при температуре 4 ° С в течение не более 10 дней.
2 Культура ЭСК и hiPSCs на MEF фидерных клеток
ЭСК H9 были получены из WiCell научно-исследовательского института и hiPSCs были созданы в лаборатории Reijo Pera через ретровируса-опосредованной трансдукции Яманака факторы OCT3 / 4, Sox2, KLF4, и с-тус 18.
- По крайней мере, за один день до прохождения клеток, подготовить некоторые желатиновых пластин, добавив 1 мл 0,1% желатина в 1 лунку 6-луночные планшеты, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение не менее 30 мин.
- После инкубации, аспирация желатина из пластин, и облучение семян инактивированной MEF клеток на планшетах при плотности 1,6 × 10 5 клеток/ Лунку в среде MEF с помощью гемоцитометра для подсчета клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовить MEF кормушки, чем за 3 дня до прохождения клеток. - Пассаж клетки один день после посева MEF кормушки: аспирата средние от hPSCs, добавить 1 мг / мл коллагеназы IV к клеткам в 1 мл / лунку, и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 1 часа.
- Во время этой инкубации, мыть MEF питатели один раз PBS, а затем добавить теплой (37 ° С), содержащей сыворотку культуральной среды HPSC на 1,5 мл / лунку.
- Через 1 час, коснитесь планшета для культуры пару раз так, что большинство из недифференцированных колоний будут отключаться от пластин, в то время как дифференцированные колонии остаются прикрепленными. Осторожно собрать плавающие колонии, и передавать их в 15 мл трубки.
- Осторожно промыть пластины один раз с теплым (37 ° C) DMEM / F12 и передавать DMEM / F12 в ту же пробирку на 15 мл.
- Центрифуга трубки на 179 мкг в течение 3 мин.
- Аспирируйте среду из трубок, стараясь не потревожить осадок. Добавить войнум HPSC культуральной среды, пипетки клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разорвать их на мелкие кластеры и хорошо перемешать.
- Перенесите клетки на новые MEF фидеров на 1: 3-1: 6 соотношение.
- Изменение среды каждый день, и проход клетки каждые 5-6 дней.
3 Получение клеток для дифференциации
- По крайней мере, за один день до приготовления клеток, подготовить некоторые Матригель пластины (обычно 3 лунки 6-луночного планшета). Развести Матригель с холодной (4 ° С) DMEM / F12 в 1:40 и добавить 1 мл Матригель на лунку 6-луночных планшетах. Выдержите Матригель пластин при 4 ° С в течение ночи. ПРИМЕЧАНИЕ: Можно запечатать Матригель пластины парафильмом и запастись их при 4 ° С до тех пор, как за одну неделю.
- Используйте клетки (этап 2) 4 дня после прохождения. Удалите все дифференцированные колонии от пластин. Аспирируйте среды из культуральной пластины, добавить 1 мл на лунку Accutase, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
- Во время инкубации, подготовить некоторые гельAtin пластин добавлением 1 мл желатина 1 колодец 6-луночных планшетах. Поместите эти тарелки и матригелем тарелки, приготовленные за день до в инкубаторе.
- После 5-минутной инкубации или когда клетки стали полуплавающие, пипеток клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать их в одиночных камерах.
- Соберите одиночных клеток в 15 мл пробирки и центрифуги при 258 мкг в течение 3 мин.
- Ресуспендируют клеток с соответствующим количеством сыворотки, содержащей культуральную среду HPSC, а также добавить Thiazovivin в конечной концентрации 2 мкМ.
- Передача клеток на покрытых желатином пластин в соотношении 1: 1, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы удалить MEF питатели.
- Перенесите клетки к 15 мл коническую трубку, добавить соответствующее сыворотки, содержащей HPSC среду и подсчета клеток с гемоцитометре.
- Центрифуга клетки при 258 мкг в течение 3 мин.
- В центрифуге, добавить Thiazovivin в соответствующие mTeSR1 среды, чтобы сделать концентрации 2 мкМ.
- После центрифугирования, аspirate среду и добавить соответствующее mTeSR1 среду с Thiazovivin так что есть 1,8 х 10 5 клеток / мл среды.
- Выньте пластины Матригель из инкубатора, аспирации Матригель и добавить 2 мл смешанных клеток на 1 лунку 6-луночных планшетах.
Примечание: плотность клеток должна быть 3,6 × 10 4 клеток / см 2 площади поверхности. - Возвращение пластины обратно в инкубатор, и пусть клетки приложить в течение 24 часов.
- 24 часа в сутки после посева клеток, аспирация старый субстрат и добавить 2 мл новый mTeSR1 среду на лунку и пусть клетки расти еще 24 часов, прежде чем начать дифференцировку.
Сотовый Дифференциация
- Начните дифференциации 48 часа после replating клетки на матригеля пластин.
- Аспирируйте культуральную среду от пластины, промыть клетки один раз PBS, и добавляют 2 мл следующем дифференцировки среды на лунку: KSR дифференцировки среде с добавлением 10 мкМ SB431542 и 100 нМ LDN-193189. Отметить этот день как D0 дифференциации.
- Изменение средней ежедневно с D0 до D20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить среду для использования не более 2 дней за один раз. - Используйте следующую среду для D1 и D2: KSR дифференциации среду, дополненную 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, и 50 нг / мл FGF8b.
- Используйте следующую среду для D3 и D4: KSR дифференциации среду, дополненную 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, 50 нг / мл FGF8b и 3 мкМ CHIR99021.
- Используйте следующую среду для D5 и D6: 75% KSR дифференцировки среды плюс 25% N 2 дифференцировки среде с добавлением 100 нМ LDN-193189, 0,25 мкМ SAG, 2 мкМ purmorphamine, 50 нг / мл FGF8b и 3 мкМ CHIR99021.
- Используйте следующую среду для D7 и D8: 50% KSR дифференциации среды плюс 50% N2 дифференциации среде с добавлением 100 нМ LDN-193189 и 3 мкМ CHIR99021.
- Используйте следующую среду для D9 и D10: 25% KSR дифференциации среды плюс 75% N2 дифференциации среду, дополненную 100 нМ LDN-193189 и 3 мкм CHIR99021.
- Используйте следующую среду для D11 и D12: B27 дифференцировки среде с добавлением 3 мкм CHIR99021, 10 нг / мл BDNF, 10 нг / мл GDNF, 1 нг / мл TGF3, 0,2 мМ аскорбиновой кислоты и 0,1 мМ цАМФ.
- Используйте следующую среду для остальной части дифференциации: B27 дифференцировки среде, дополненной 10 нг / мл BDNF, 10 нг / мл GDNF, 1 нг / мл TGF3, 0,2 мМ аскорбиновой кислоты и 0,1 мМ цАМФ.
- Около D16 дифференциации, подготовить некоторые поли-L-орнитин / Ламинин / фибронектина пластины. Развести поли-L-орнитин раствор с холодной (4 ° С) PBS до 15 мкг / мл, добавляют 1 мл на 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
- Аспирируйте поли-L-орнитин решение, промыть пластины 3 раза стерильной водой, а затем высушить воздух пластины.
- Развести ламинина фондовый зольution с холодной (4 ° С) PBS с 1 мкг / мл, добавляют 1 мл на одну лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
- Аспирируйте ламинина решение, промыть пластины 3 раза стерильной водой, а затем высушить воздух пластины.
- Развести фибронектин маточного раствора с холодной (4 ° С) PBS до 2 мкг / мл, добавляют 1 мл на 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
- Seal пластины с парафильмом и разместить их на 4 ° С до тех пор, как две недели.
- После 20 дней дифференциации, replate ячейки на поли-L-орнитин / Ламинин / фибронектина пластин. Аспирируйте дифференциации среднего, добавить 1 мл теплого (37 ° С), чтобы Accutase 1 лунку 6-луночных планшетах, и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
- Во время инкубации, разместить поли-L-орнитин / ламинин / фибронектина пластин в инкубаторе.
- После 5-минутной инкубации или когда клетки стали полуплавающие, мягко пипетки клетки вверх и вниз несколько раз впревратить их в одиночных камерах.
- Соберите отдельные клетки в 15 мл конические пробирки и добавить соответствующее количество Neurobasal среды для подсчета клеток, который будет изменяться в зависимости от расширения (после 11 дней дифференциации, клетки могут расширить 15-20 раз). Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Центрифуга клетки при 258 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочной жидкости и ресуспендирования клеток В27 дифференцировки среды таким образом, чтобы концентрацию клеток 1 × 10 6 клеток / мл среды.
- Аспирируйте фибронектина с пластин, дважды промывали PBS и добавляют 2 мл клеток в 1 лунку 6-луночных планшетах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток для replating должно быть 2 х 10 5 клеток / см 2 площади поверхности. - Изменение средней 24 часа спустя, чтобы удалить любые одиноких мертвые клетки.
- Измените среднего через день, пока желаемых временных точках для данного эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор протокола дифференцировки показано на рисунке 1. Эффективность протокола дифференцировки представленной здесь полагается на статус исходных клеток. Таким образом, крайне важно, чтобы убедиться, что, первый удаляет все дифференцированные колонии до диссоциации hPSCs на отдельные клетки к дифференциации, и второй, один истощает большинство, если не все, то MEF фидерных клеток путем инкубации клеток на покрытых желатином пластин в течение 30 мин, и третье, один пластин HPSC отдельные клетки в соответствующем плотности на пластине Matrigel. Как показано на рисунке 2, высевали HPSC отдельные клетки, как будет расширяться кластеров в течение 48 часов, после чего дифференциации, образуя около 70% слияния в пластинах. Тогда после дифференцировки эти клетки достигают полной слияния в максимально коротким 3-4 дней, а начиная с вокруг Д16-D17, эти сливающиеся клетки начинают делать некоторые пробелы в пластинах, а некоторые аксоны / нейриты уже могнаблюдается в этих пространствах и под клеточных слоев. После пересевали на D20, дифференцированные клетки прикреплены и вырос как небольшие пряди. Затем в течение следующих 5 дней, гораздо более интенсивные и морфологически неповрежденные аксоны / нейриты выйти из глыб, и аксоны / нейриты из разных сгустки образуют некоторые связи. В долгосрочной культуры, нейроны в одной глыбе генерировать больше расширений, станут более зрелыми и имеют больше связей с нейронами в соседних глыбах.
После 11 дней дифференциации, hPSCs может быть эффективно преобразована в прекурсоров ПС, и, как показано на рисунке 3, почти все клетки выразить FP клетка-предшественник маркеры нестин и Foxa2, и более 90% клеток выразить еще три маркеры Корин, Otx2 , и LMX1a. Тогда после нескольких дней дифференциации, клетки-предшественники FP указаны в DA нейронов как они выражают TUJ1 и TH (Рисунок 4А). Эти нейроны DA имеют A9 идентичности как они Экспрессс GIRK2 а отрицательны для кальбиндин (Рисунок 4B). Иммуноокрашивание эксперименты также показывают, что нет GFAP + астроциты и очень мало нейронов ГАМКергические (Рисунок 4C), указывая, что дифференциация исключительно указано к нейронной линии DA.
Рис.1 Обзор протокола дифференцировки, факторами роста / малых молекул и культуральной среды, используемой для каждого дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Морфологическиеаль изменяется во время дифференцировки. H9 ЭСК высевали в виде отдельных клеток в соответствующей плотности клеток, как описано, и 48 ч после этого, эти клетки достигают примерно 70% слияния в пластине, как колоний (D0). В течение первых нескольких дней после дифференцировки клетки быстро расширяться, достигая более 90% слияния через 24 часа дифференцировки (D1), а затем стать слияние после 48 часов более (D3). Тем не менее, большинство из этих клеток еще демонстрируют типичный чЭСК морфологию ядра с высоким соотношением цитоплазмы (D3). Как дифференциация продолжается, клетки расширить больше и постепенно теряют чЭСК морфологию. В конце D11 дифференциации, есть более одного слоя клеток во многих частях пластины, о чем свидетельствует более темного цвета клеток в некоторых областях, чем другие (D11). Начиная с о D17 к D20, некоторые клетки умер, оставив некоторые пробелы в своей тарелке, и некоторые нейронные прогнозы уже можно наблюдать в этих пространствахй иногда под слоем клеток (D20). После клеточной replating в конце D20, чтобы сделать больше пространства для клеток для выращивания и дифференциации, клетки агрегируют в виде небольших кластеров, намного больше аксоны / нейриты выйти из этих кластеров, и аксоны / нейриты из различных кластеров образуют некоторые связи в максимально коротким 4-5 дней (D25). Шкала бар, 200 мкм.
Рисунок 3 Иммуноокрашивание для ПС маркеров на ранней стадии дифференцировки. H9 ЭСК дифференцировались в течение 11 дней, используя протокол, описанный здесь. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом, проницаемыми с Triton X-100, блокированной с осла сыворотки, а затем окрашивали в течение ПС клеток-предшественников маркеров. Как показано здесь, почти все клетки выразить Foxa2 и нестин, и более 90% клеток выразить LMX1a, Корин, иOtx2, что указывает на очень высокую эффективность преобразования от ЭСК в ПС клеток. Шкала бар, 200 мкм.
Рисунок 4 Иммуноокрашивание для DA нейронов маркеров на поздних стадиях дифференцировки. (A) H9 ЭСК дифференцировались в течение 25 дней, и клетки были подвергнуты иммуноокрашивания для пан-нейронов маркера TUJ1 и обычно используется DA нейрон маркера TH. Как показано здесь, хотя есть более TUJ1 позитивных клеток, чем TH-позитивных клеток, все TH-экспрессирующие клетки остатка в TUJ1-экспрессирующих клеток, и TH-экспрессирующие клетки представляют по крайней мере половину всех клеток. (Б). ЭСК H9 были дополнительно дифференцированы в течение еще 25 дней (всего 50 дней), а затем клетки подвергаются иммунной окраски. Результаты показали, что существует более высокий процент TH-экспрессирующих клеток-го, что на d25. Почти все эти TH-экспрессирующих клеток также экспрессируют GIRK2 то время как большинство из них являются отрицательными для кальбиндин, что указывает на подтип идентичность A9 сгенерированных DA нейронов, который является типом клеток, что теряется в PD. (С) иммуногистохимическое окрашивание клеток при дифференциации D25 показали, что не существует клетки, экспрессирующие GFAP, и очень немногие клетки экспрессируют ГАМК. Шкала бар, 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стволовые плюрипотентные клетки человека (в том числе обоих ЭСК и hiPSCs) могут быть дифференцированы в пробирке для создания большинства, если не всех, типы клеток нашего тела, включая DA нейронов, которая была продемонстрирована в предыдущих исследованиях 19. Здесь, на основе знаний из эмбриональных дофаминергической развития нейронов 20 и опубликованных протоколов от других лабораторий 14,15, мы оптимизировали условий культивирования для генерации DA нейронов ЭСК и hiPSCs. Этот протокол является эффективным, воспроизводимым и мы успешно применили этот протокол, описанный здесь, чтобы H1 и H9 линий чЭСК и линий hiPSC как из пациентов с БП и здоровых управления.
В нашем протоколе, есть три ключевых шаги для получения высокой эффективности дифференциации: Во-первых, не должно быть никаких дифференцированные колонии HPSC в клетках перед направленной дифференцировки. Как спонтанная дифференцировка на всех трех зародышевых листков часто видели в чPSC культуры, важно, чтобы удалить эти дифференцированные колоний, прежде чем эти диссоциации hPSCs на отдельные клетки. Во-вторых, MEF питатели должны быть исчерпаны от диссоциированных hPSCs, как предыдущие доклады показали, что MEF клетки могут секретные факторы, которые способствуют самообновлению и ингибируют дифференцировку 21. С этой целью инкубации HPSC и MEF клеток смесей на покрытые желатином пластин в течение 30 мин должно быть достаточно, чтобы удалить практически все клетки MEF. В-третьих, отдельные hPSCs должны быть покрыты на соответствующем плотности клеток для дифференцировки. Повышение плотности клеток приведет к гибели большинства клеток в пределах D11 дифференциации, при снижении плотности клеток приведет к отряду и смерти клеток в центре пластины в максимально коротким меньше, чем 7 дней, хотя клеток на край будет отличать также (данные не показаны). Если наблюдается все эти три критерия, легко эффективно получать DA нейроны от hPSCs с нашей пошаговой протокола.
Протокол, представленные здесь, главным образом, на основе предыдущего доклада Л. Studer и коллег 14 с некоторыми изменениями. Во-первых, дифференциация здесь была начата 48 ч после одного покрытия сотового когда клетки достигают лишь около 70% слияния, в то время как в своем отчете, дифференциация была начата, когда клетки достигают полной слияния (3 или более дней культуры после одной клетки покрытие). По нашему опыту, начиная дифференцирование от сливающихся клеток без сотового прохождения до дня 20 не приводит к тяжелой клеточной гибели в процессе дифференцировки. Во-вторых, мы заменим дорогой SHH белка в их исследовании с SAG, агониста в chlorobenzothiophene содержащих малую молекулу для HH пути 22. Поэтому, по сравнению с ранее опубликованными протоколами, этот описанный здесь подачи клеток и нейронных розетка независимой, и базируется в основном на малых молекул для уточнения FP; Таким образом, менее дорогие и менее времени и трудоемким. Конечно, Limitation этого протокола является использование KSR в течение первых суток дифференцировки. KSR меняется от партии к партии, которые могут повлиять на эффективность дифференциации. Таким образом, следует проверить различные партии KSR получить тот, который лучше всего подходит для индукции предшественников FP после 11 дней дифференциации.
Таким образом, протокол дифференциация descried здесь должны способствовать: (1) генерация DA нейронов ЭСК или hiPSCs нормальных людей для заместительной клеточной терапии для PD; (2) генерация DA нейронов ПД ИПСК пациентов для моделирования в пробирке и тестирования потенциальных терапевтических препаратов для PD; (3) изучение генов / путей, регулирующих развитие нейронов DA человека сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
