Introduction
Dopaminérgico (DA) neurônios pode ser encontrada em várias regiões do cérebro, incluindo o mesencéfalo, hipotálamo, retina, e bulbos olfatórios. Os neurônios A9 DA na substância negra pars compacta (SNPC) comportamento de controle e movimento, projetando para o estriado na parte frontal do cérebro e formando o sistema motor extrapiramidal. A degeneração de neurónios DA A9 leva à doença de Parkinson (PD), que é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e humano actualmente incurável. A terapia de substituição de células é uma das mais promissoras para o tratamento da DP 1, por conseguinte, tem havido um grande interesse na determinação neurónios A9 DA a partir de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo ambas as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e o células humanas recentes tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs).
Muitas pesquisas têm tentado obter neurônios A9 DA de hPSCs usando vários métodos. Os primeiros relatórios de todos os neurônios DA gerados através de uma neuralroseta estágio progenitor. Por co-cultura com MS5 2 ou PA6 3-5 células estromais com ou sem fatores de crescimento externo para 2-4 semanas, L. Studer e colegas e três outros grupos induzidos com sucesso hESCs para produzir rosetas neurais. Eles, então, enriquecido essas rosetas por dissecção mecânica ou digestão enzimática para uma maior diferenciação. Em outros relatos, os pesquisadores geraram rosetas neurais através do corpo embrióide (EB) flutuantes cultura diferenciação 6-9. Mais tarde, os investigadores estabeleceram um método de diferenciação de monocamada com base 10,11, onde banhado hESCs e hiPSCs na matriz extra-celular, adicionou diferentes factores de crescimento em cultura para induzir a diferenciação de hPSCs de neurónios DA, que imita o in vivo DA desenvolvimento embrionário neurónio . Apesar de todos estes estudos obtidos tirosina hidroxilase (TH) células -expressing com algumas características de neurônios DA, todo o processo de diferenciação é o tempo e trabalho consumindo,geralmente ineficiente, e mais importante ainda, a identidade A9 destes neurónios não foram demonstradas na maioria dos estudos, com excepção de um com Lmx1a expressão ectópica 12. Recentemente, uma placa de novo piso (FP) protocolo baseada foi desenvolvido 13-16, em que os precursores PF com DA potencial neurônio foram gerados primeiro pela ativação do sonic hedgehog e canônicas vias de sinalização Wnt durante a fase inicial de diferenciação, e, em seguida, essas células FP foram melhor especificados para os neurônios de DA. Apesar de este protocolo é mais eficiente, ainda existem alguns problemas; por exemplo, todo o processo de diferenciação leva muito tempo (pelo menos 35 dias) e é dependente de células alimentador 15, ou seja 16 ou EB dependente da identidade A9 não foi demonstrada 14.
Aqui, a partir do conhecimento do desenvolvimento in vivo DA neurônio embrionário e os resultados publicados por outros pesquisadores, nós otimizamos as condições de cultivo para o FEPgeração icient de neurônios DA de ambos os hESCs e hiPSCs. Nós primeiro gerado células precursoras FP pela ativação da via de sinalização Wnt canônica com pequena molécula CHIR99021 e sonic hedgehog sinalização com pequenas moléculas SAG e purmorphamine. Estas células FP expressar Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestin. Em seguida, essas células especificado PF para neurônios DA com fatores de crescimento, incluindo BDNF, GDNF, etc. Os neurônios DA gerados são do tipo de célula A9 como eles são positivos para GIRK2 enquanto negativo para calbindina 17. Este protocolo é de células de alimentação ou EB independente, altamente eficiente e reprodutível. Usando este protocolo, pode-se derivar neurônios DA em menos de 4 semanas a partir de hESCs ou hiPSCs de pessoas normais para estudo transplante de células, ou de hiPSCs de pacientes com DP para in vitro modelagem de PD ou testar agentes terapêuticos potenciais para a DP.
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Protocol
1 Preparação de Meios de Cultura
- Prepare de fibroblastos de rato embrionário (MEF) forma, combinando o seguinte: 445 ml de DMEM, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), e solução de reserva de 5 ml de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 14 dias.
- Prepare HPSC meio de cultura através da combinação do seguinte contendo soro: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de soro de substituição nocaute (KSR), 5 ml de 100x não essencial solução solução de estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / estoque ampicilina, 5 ml de 100x mercaptoetanol a solução estoque, e 10 ng / ml de bFGF. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.
- Prepare a meio isento de soro mTeSR1 combinando o seguinte: 400 ml de meio basal mTeSR1, 100 ml de suplemento de 5x, e 5 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha meio a 4 ° C por não mais que 10 dias.
- Preparar a solução estoque 10x colagenase IV: pesar 0,5 g de energia colagenase IV, edissolvê-la com 50 ml de DMEM / F12 e filtro de esterilizar. Faça alíquotas e armazená-las à temperatura de -20 ° C durante meses.
- Preparar a solução de gelatina a 0,1%: pesam-se 0,5 g de gelatina (a partir de pele de bovino, de tipo B) de alimentação e dissolvê-lo com água desionizada. Mantenha a solução esterilizada em autoclave à temperatura ambiente durante semanas.
- Preparar meio de diferenciação KSR combinando o seguinte: 410 ml de DMEM, 75 mL KSR, 5 ml 100x solução não-essencial estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / solução estoque ampicilina, 5 ml de solução de estoque 100x mercaptoetanol. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.
NOTA: KSR varia de lote para lote, o que pode afetar a eficiência de diferenciação. Por isso, é melhor testar vários lotes de KSR para encontrar o melhor para a diferenciação. - Preparar meio de diferenciação N2 combinando o seguinte: 98 ml de DMEM, 1 ml de suplemento de N2 100x e 1 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4° C por não mais que 10 dias.
- Preparar meio de diferenciação B27, combinando o seguinte: 480 ml de meio neurobasal, 10 ml de 50x suplemento B27, 5 ml de solução de estoque de GlutaMax 100x, 100x e 5 ml de solução de reserva de penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.
2 Cultura de hESCs e hiPSCs em células alimentadoras MEF
Os hESCs H9 foram obtidos a partir de Instituto de Pesquisa WiCell e hiPSCs foram estabelecidas em laboratório Reijo Pera através de transdução mediada por retrovírus de Yamanaka fatores OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC 18.
- Pelo menos um dia antes da passagem de células, preparar algumas placas de gelatina adicionando 1 ml de 0,1% de gelatina a uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
- Após a incubação, a partir de placas de gelatina aspirado, e semente de irradiação inactivado células MEF nas placas a uma densidade de 1,6 x 10 5 células/ Poço em meio de MEF utilizando um hemocitómetro para contar as células.
NOTA: Se necessário, preparar alimentadores MEF logo aos três dias antes da passagem da célula. - Células de passagem um dia após o plaqueamento alimentadores MEF: médias aspirado de hPSCs, adicionar 1 mg / ml de colagenase IV em células em 1 ml / poço, e incuba-se as células a 37 ° C durante 1 hora.
- Durante esta incubação, lavam alimentadores MEF uma vez com PBS e, em seguida adicionar água morna (37 ° C) HPSC meio de cultura contendo soro a 1,5 mL / poço.
- Depois de 1 hora, toque na placa de cultura de um par de vezes para que a maioria das colônias indiferenciadas vai separar as placas, enquanto as colônias diferenciadas permanecem ligados. Cuidadosamente recolher as colônias flutuantes, e transferi-los para tubo de 15 ml.
- Lavar suavemente a placa uma vez com água morna (37 ° C) de DMEM / F12 e transferir DMEM / F12 no mesmo tubo de 15 ml.
- Centrifugar os tubos a 179 xg por 3 min.
- Aspirar médio dos tubos, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Adicionar guerram HPSC meio de cultura, Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para quebrá-las em pequenos aglomerados e misture bem.
- Transferência das células para novos alimentadores MEF em 1: 3-1: 6 ratio.
- Troca da mídia todos os dias e passagem das células a cada 5-6 dias.
3 Preparação de Células para Diferenciação
- Pelo menos um dia antes da preparação de células, preparar algumas placas de Matrigel (tipicamente três poços de uma placa de 6 poços). Dilui-se com o Matrigel frio (4 ° C) de DMEM / F12 a 1:40 e adicionar 1 mL de Matrigel por poço de placas de 6 poços. Incubar as placas de Matrigel a 4 ° C durante a noite. NOTA: É possível selar as placas de Matrigel com Parafilm e armazená-las a 4 ° C durante o tempo que uma semana.
- Use células (ver Passo 2) 4 dias após a passagem. Remova todas as colônias diferenciadas das placas. Aspirar o meio da placa de cultura, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubar as células a 37 ° C durante 5 min.
- Durante a incubação, preparar alguns gelatin placas por adição de 1 ml de gelatina a um poço de placas de 6 poços. Colocar estas placas e as placas de Matrigel preparadas um dia antes na incubadora.
- Após a 5 min de incubação ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, as células de pipeta para cima e para baixo várias vezes para fazê-los em células individuais.
- Recolha de células individuais em tubos de 15 ml e centrifugar a 258 xg durante 3 min.
- Suspenda as células com uma quantidade apropriada de soro contendo meio de cultura, HPSC e adicionar Thiazovivin para a concentração final de 2 fiM.
- Transferência de células em placas revestidas com gelatina na proporção 1: 1, e incubar as células a 37 ° C durante 30 minutos para remover os alimentadores de MEF.
- Transferência das células para um tubo cónico de 15 ml, adicionar soro contendo meio apropriado HPSC e contagem das células com um hemocitómetro.
- Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min.
- Durante centrífuga, adicionar Thiazovivin se apropriar mTeSR1 meio para fazer uma concentração de 2 uM.
- Depois de centrifugação, umaspirate o meio e adicionar meio mTeSR1 apropriado com Thiazovivin de modo que não são de 1,8 x 10 5 células / ml de meio.
- Retire das placas de Matrigel da incubadora, aspirar o Matrigel e juntar 2 ml de células mistas para um poço das placas de 6 poços.
NOTA: A densidade celular deve ser 3,6 x 10 4 células / cm2 de área de superfície. - Retorne as placas de volta para a incubadora, e deixar que as células anexar, durante 24 horas.
- 24 h após o plaqueamento das células, aspirar meio antigo e adicionar 2 ml de meio novo mTeSR1 por poço e deixar crescer as células durante mais 24 horas antes de iniciar a diferenciação.
Diferenciação Celular
- Iniciar a diferenciação de 48 horas após replating as células em placas de Matrigel.
- Aspirar o meio de cultura da placa, lave as células uma vez com PBS, e adicionar 2 ml do seguinte meio de diferenciação por poço: meio de diferenciação KSR suplementado com 10 pM e 100 nM SB431542 LDN-193189 Marque este dia como D0 de diferenciação.
- Mude meio todos os dias das D0 a D20.
NOTA: Pode-se preparar o meio para o uso não mais do que dois dias de cada vez. - Utilizar o meio seguinte para o D1 e D2: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b.
- Usar o seguinte meio para a D3 e D4: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021.
- Utilizar o meio seguinte para D5 e D6: 75% KSR meio de diferenciação, mais 25% de meio de diferenciação de N2 suplementado com 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021.
- Use o seguinte meio para D7 e D8: 50% KSR meio de diferenciação mais 50% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021.
- Use o seguinte meio para D9 e D10: 25% KSR meio de diferenciação mais 75% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021.
- Utilizar o meio seguinte para D11 e D12: diferenciação de meio B27 suplementado com 3 uM CHIR99021, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP.
- Utilizar o meio seguinte para o resto de diferenciação: meio de diferenciação B27 suplementado com 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP.
- A cerca de D16 de diferenciação, preparar algumas placas / laminina / Fibronectina poli-L-ornitina. Dilui-se poli-L-ornitina solução estoque com frio (4 ° C) de PBS a 15 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
- Aspirar a solução de poli-L-ornitina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas.
- Diluir laminina estoque solbuição com frio (4 ° C) de PBS a 1 mg / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
- Aspirar a solução de laminina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas.
- Diluir solução-mãe de fibronectina com frio (4 ° C) de PBS a 2 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
- Placas de vedação com Parafilm e colocá-los a 4 ° C por até duas semanas.
- Após 20 dias de diferenciação, replate células para os / as placas Laminin / fibronectina poli-L-ornitina. Aspirar o meio de diferenciação, adicionar 1 ml de água morna (37 ° C) a Accutase um poço de placas de 6 poços, e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min.
- Durante a incubação, colocar as placas / poli-L-ornitina Laminina / fibronectina na incubadora.
- Após a incubação de 5 min ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, suavemente as células para cima e para baixo da pipeta várias vezes paratorná-los em células individuais.
- Recolher as células individuais em tubos de 15 mL cónico, e adicionar a quantidade apropriada de meio neurobasal para contagem de células, que irá variar dependendo de expansão (após 11 dias de diferenciação, as células podem expandir de 15-20 vezes). Contar as células usando um hemocitômetro.
- Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com meio de diferenciação B27 de modo a que a concentração de células é de 1 x 10 6 células / ml de meio.
- Aspirar fibronectina a partir das placas, lava-se duas vezes com PBS, e adicionar 2 ml de células para um poço de placas de 6 poços.
NOTA: A densidade celular para replating deve ser de 2 x 10 5 células / cm2 de área de superfície. - Mude médio de 24 horas mais tarde para remover as células mortas não acopladas.
- Mudar meio todos os outros dias até que os pontos de tempo desejado para uma dada experiência.
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Representative Results
Uma visão geral do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1. A eficiência da diferenciação protocolo aqui apresentada baseia-se no estado das células iniciadoras. Portanto, é essencial ter a certeza de que, em primeiro lugar um remove todas as colónias diferenciadas antes dissociando hPSCs em células individuais de diferenciação, e, segundo, uma esgota a maioria, se não todas, as células alimentadoras MEF por incubação das células em placas revestidas com gelatina durante 30 min, e em terceiro lugar, uma das placas de células individuais HPSC na densidade adequada na placa de Matrigel. Tal como ilustrado na Figura 2, novamente semeadas células individuais HPSC irá expandir como aglomerados durante a 48 horas antes de diferenciação, formando cerca de 70% de confluência em placas. Em seguida, após a diferenciação, essas células atingem confluência completo em tão curto quanto 3-4 dias e, a partir de cerca de D16-D17, estas células confluentes começar a fazer alguns espaços nas placas, e alguns axônios / neurites já podiaser observado nesses espaços e nas camadas de células. Depois de ser replated em D20, as células diferenciadas em anexo e cresceu como pequenos aglomerados. Então, durante os próximos 5 dias, os axônios muito mais intensas e morfologicamente intactas / neurites sair das aglomerações, e os axônios / neurites de diferentes aglomerados formam algumas conexões. Durante a cultura de longo prazo, os neurônios em uma moita gerar mais extensões, obter mais maduro e tem mais conexões com os neurônios em aglomerações vizinhas.
Após 11 dias de diferenciação, hPSCs pode ser eficientemente convertido em precursores de PF, e, tal como ilustrado na Figura 3, quase todas as células expressam marcadores de células da FP precursor nestina e Foxa2, e mais de 90% das células expressam marcadores mais três CORIN, OTX2 , e Lmx1a. Então, depois de mais dias de diferenciação, as células precursoras PF são especificados para neurônios DA como eles expressam TUJ1 e TH (Figura 4A). Estes neurónios DA são de identidade A9 em que express GIRK2 enquanto são negativos para calbindina (Figura 4B). Experimentos Imunocoloração também mostram que não há GFAP + astrócitos e muito poucos neurônios GABAérgicos (Figura 4C), indicando que a diferenciação é exclusivamente especificada para o neurônio linhagem DA.
Figura 1 Visão geral do protocolo de diferenciação, com fatores de crescimento / pequenas moléculas e meio de cultura utilizado para cada dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 morfológicaai muda durante a diferenciação. hESCs H9 foram plaqueadas como células individuais na densidade celular apropriada, tal como descrito, e 48 horas depois, as células atingem cerca de 70% de confluência em placas de colónias (D0). Durante os primeiros alguns dias de diferenciação, as células expandir-se rapidamente, atingindo mais de 90% de confluência após 24 horas de diferenciação (D1), e em seguida tornam-se confluência após mais de 48 horas (D3). No entanto, a maioria destas células ainda exibem a morfologia típica de células estaminais embrionárias humanas com elevada núcleo para citoplasma (D3). Como diferenciação passa, as células se expandem mais e perdem gradualmente hESC morfologia. No final de D11 de diferenciação, não são mais do que uma camada de células em várias partes de chapa, como é evidenciado por uma cor mais escura de células em algumas áreas do que os outros (D11). A partir de cerca de D17 a D20, algumas células morreram, deixando alguns espaços na placa, e algumas projecções neuronais já pode ser observada nestes espaços umnd, por vezes sob a camada de células (D20). Após repique celular no final de D20 para fazer mais espaços para que as células crescem e diferenciação, as células agregar como pequenos grupos, muito mais axônios / neurites emergir desses grupos, e os axônios / neurites de diferentes grupos formam algumas conexões em tão curto quanto 4-5 dias (D25). Barra de escala, de 200 um.
Figura 3. imunocoloração para marcadores FP na fase precoce da hESCs diferenciação. H9 foram diferenciadas durante 11 dias utilizando o protocolo aqui descrito. As células foram então fixadas com 4% de paraformaldeído, permeabilizadas com Triton X-100, bloqueadas com soro de burro e, em seguida, coradas para FP marcadores celulares precursor. Como mostrado aqui, quase todas as células expressam Foxa2 e nestina, e mais de 90% das células expressam Lmx1a, CORIN, eOTX2, indicando uma conversão muito alta eficiência de hESCs às células PF. Barra de escala, de 200 um.
Figura 4 Imunocoloração para marcadores de neurônios de DA em estágios tardios da diferenciação. (A) hESCs H9 foram diferenciados por 25 dias, e as células foram sujeitas a imunomarcação para o pan-neurônio marcador TUJ1 e comumente usado DA marcador neurônio TH. Como mostrado aqui, embora existam mais células positivas do que as células positivas TUJ1 TH, todas as células que expressam TH-resíduo nas células que expressam TUJ1, e as células TH-expressam representar, pelo menos, metade de todas as células. (B). Os hESCs H9 foram ainda mais diferenciado por mais 25 dias (num total de 50 dias) e, em seguida, as células foram sujeitas a imunomarcação. Os resultados mostraram que há maior percentual de TH-expressando células Thum que no d25. Quase todas estas células que expressam TH também expressar GIRK2 enquanto a maior parte deles são negativos para calbindina, indicando a identidade A9 subtipo dos neurónios DA gerados, o qual é o tipo de célula que é perdido na doença de Parkinson. (C) A imunocoloração para células em diferenciação de D25 mostrou que não existem células que expressam GFAP, e muito poucas células expressam GABA. Barra de escala, de 200 um.
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Discussion
As células estaminais pluripotentes humanas (incluindo ambos os hESCs e hiPSCs) podem ser diferenciadas in vitro para gerar a maioria, se não todos, os tipos de células do nosso corpo, incluindo neurónios DA, o que foi demonstrado em estudos anteriores 19. Aqui, com base no conhecimento do desenvolvimento embrionário neurônio dopaminérgico 20 e protocolos publicados a partir de outros laboratórios 14,15, otimizamos as condições de cultura para a geração de neurônios DA de hESCs e hiPSCs. Este protocolo é eficiente, reprodutível e temos aplicado com sucesso este protocolo descrito aqui para H1 e H9 hESC linhas e as linhas hiPSC tanto dos pacientes com DP e controles não afetados.
Em nosso protocolo, existem três passos fundamentais para a obtenção da eficiência elevada diferenciação: Em primeiro lugar, não deve haver colônias HPSC diferenciadas na diferenciação das células antes indicado. Diferenciação espontânea de todas as três camadas germinativas é visto frequentemente em hCultura PSC, é importante para remover essas colônias diferenciadas antes de dissociar esses hPSCs em células individuais. Em segundo lugar, alimentadores MEF devem ser esgotados dos hPSCs dissociadas, como relatórios anteriores mostraram que as células MEF puder fatores secretos que promovam a auto-renovação e inibem a diferenciação 21. Para este fim, incubando-se as misturas de células MEF HPSC e sobre placas revestidas com gelatina de 30 min deve ser suficiente para remover praticamente todas as células MEF. Em terceiro lugar, os hPSCs individuais deve ser revestida a uma densidade de célula apropriada para a diferenciação. O aumento da densidade celular irá conduzir à morte da maioria das células em cerca de D11 de diferenciação, enquanto que o abaixamento da densidade de células irá resultar no descolamento e morte de células no centro da placa em tão curto quanto menos de 7 dias, embora em células a borda irá diferenciar bem (dados não mostrados). Se se observa todos estes três critérios, é fácil de obter de forma eficiente a partir de neurônios DA hPSCs com nosso protocolo passo a passo.
O protocolo aqui apresentado é baseado principalmente em um relatório anterior por L. Studer e colaboradores 14, com algumas modificações. Em primeiro lugar, a diferenciação aqui foi iniciado 48 horas após o plaqueamento de uma única célula quando as células atingem apenas cerca de 70% de confluência, enquanto que em seu relatório, a diferenciação foi iniciado quando as células atingem confluência completo (3 ou mais dias de cultivo após uma única célula chapeamento). Em nossa experiência, a partir de diferenciação de células confluentes, sem uma passagem de células até o dia 20, leva à morte celular grave durante o processo de diferenciação. Em segundo lugar, podemos substituir a proteína SHH caro em seu estudo com SAG, uma pequena molécula agonista contendo chlorobenzothiophene para HH caminho 22. Portanto, em comparação com protocolos publicados anteriormente, este aqui descrito é de células de alimentação e roseta neural independente, e baseia-se principalmente em pequenas moléculas para especificação FP; é, portanto, menos caro e menos que consome tempo e trabalho. Naturalmente, o limitation deste protocolo é o uso de KSR durante os primeiros dias de diferenciação. KSR varia de lote para lote, o que pode afetar a eficiência de diferenciação. Portanto, deve-se testar diferentes lotes de KSR para obter o que funciona melhor na indução precursores PF após 11 dias de diferenciação.
Em resumo, o protocolo de diferenciação divisar aqui deve facilitar: (1) a geração de neurónios DA de hESCs hiPSCs ou de indivíduos normais, para a terapia de substituição de células para a DP; (2) a geração de neurônios DA iPSCs de pacientes com DP para modelagem in vitro e testes de potenciais drogas terapêuticas para PD; (3) o estudo dos genes / vias de sinalização que regulam o desenvolvimento de neurónios DA humano.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
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