Introduction
الدوبامين (DA) الخلايا العصبية يمكن العثور عليها في عدة مناطق الدماغ، بما في ذلك المخ الأوسط، المهاد، شبكية العين، وبصيلات الشم. الخلايا العصبية A9 DA في بارس المادة السوداء المكتنزة (SNpc) سلوك السيطرة والحركة من خلال إبراز أن المخطط في الدماغ الأمامي وتشكيل الجهاز الحركي خارج الهرمي. تنكس الخلايا العصبية A9 DA يؤدي إلى مرض باركنسون (PD)، الذي هو الثاني الأكثر شيوعا اضطراب الاعصاب البشري وغير قابل للشفاء حاليا. العلاج ببدائل الخلية هي واحدة من الاستراتيجيات الواعدة لعلاج PD 1، لذلك، كان هناك اهتمام كبير في استخلاص الخلايا العصبية A9 DA من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) و خلايا الأخيرة من صنع الإنسان الجذعية المحفزة (hiPSCs).
وقد حاول الكثير من البحوث لاستخلاص الخلايا العصبية A9 DA من hPSCs باستخدام أساليب مختلفة. أقرب تقارير عن الخلايا العصبية DA المتولدة من خلال العصبيةردة مرحلة السلف. من خلال التعاون مع زراعة MS5 2 أو PA6 3-5 خلايا انسجة مع أو بدون عوامل النمو الخارجية لمدة 2-4 أسابيع، L. ستودر والزملاء وثلاث مجموعات أخرى يسببها hESCs بنجاح لإنتاج ريدات العصبية. ثم أنها المخصب هذه ريدات من قبل تشريح الميكانيكية أو الهضم الأنزيمي لمزيد من التمايز. في تقارير أخرى، ولدت الباحثون ريدات العصبية خلال الجسم مضغي الشكل (EB) العائمة ثقافة التمايز 6-9. في وقت لاحق، أنشأ الباحثون أحادي الطبقة أساس طريقة التمايز 10،11، حيث مطلي hESCs وhiPSCs على مصفوفة الخلوية الإضافية وأضاف عوامل النمو المختلفة في الثقافة للحث على تمايز الخلايا العصبية hPSCs إلى DA، الذي يحاكي في الجسم الحي DA الخلايا العصبية الجنينية تنمية . على الرغم من كل هذه الدراسات التي تم الحصول عليها هيدروكسيلاز التيروزين (TH) خلايا -expressing مع بعض خصائص الخلايا العصبية DA، عملية التمايز كلها تستهلك الوقت والعمل،غير فعالة بشكل عام، والأهم من ذلك، كانت هوية A9 من هذه الخلايا العصبية لم تظهر في معظم الدراسات باستثناء واحد مع LMX1a التعبير خارج الرحم 12. مؤخرا، تم تطوير لوحة الطابق الجديد (FP) المستندة إلى بروتوكول 13-16، والتي تم إنشاؤها السلائف FP مع DA إمكانات الخلايا العصبية لأول مرة تفعيل القنفذ سونيك والكنسي WNT مسارات الإشارات خلال المرحلة الأولى من التمايز، ومن ثم تم تحديد هذه الخلايا FP أيضا على الخلايا العصبية DA. على الرغم من هذا البروتوكول هو أكثر كفاءة، لا تزال هناك بعض المشاكل؛ على سبيل المثال، عملية التمايز كلها تستغرق وقتا طويلا (35 يوما على الأقل) هي وحدة تغذية الخلايا تعتمد 15، أو هي EB تعتمد 16 أو هوية A9 لم أظهر 14.
هنا، على أساس من المعرفة في الجسم الحي تطوير DA الخلايا العصبية الجنينية والنتائج المنشورة الباحثين الآخرين، قمنا الأمثل الظروف الثقافة لممثل المؤسسةicient جيل من الخلايا العصبية DA من كلا hESCs وhiPSCs. نحن ولدت لأول مرة خلايا FP السلائف من تفعيل الإشارات WNT الكنسي مع جزيء صغير CHIR99021 والقنفذ سونيك يشير مع جزيئات صغيرة SAG وpurmorphamine. هذه الخلايا FP تعبر FOXA2، LMX1a، CORIN، OTX2 وNESTIN. نحن ثم تحديد هذه الخلايا إلى الخلايا العصبية DA FP مع عوامل النمو بما في ذلك عامل التغذية العصبية، GDNF، الخ. الخلايا العصبية DA المولدة هي من A9 نوع من الخلايا كما هي ايجابية للGIRK2 حين سلبية للCalbindin 17. هذا البروتوكول هو الخلايا المغذية أو EB مستقلة وذات كفاءة عالية وقابلة للتكرار. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء استخلاص الخلايا العصبية DA في أقل من 4 أسابيع من hESCs أو hiPSCs من الأشخاص العادي للدراسة زرع الخلايا، أو من hiPSCs من المرضى PD لفي المختبر نمذجة PD أو اختبار العوامل العلاجية المحتملة لPD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام
- إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 445 مل DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS)، و 5 مل 100X البنسلين / الأمبيسلين محلول المخزون. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 14 يوما.
- إعداد hPSC مستنبت من خلال الجمع بين التالية التي تحتوي على المصل: 385 مل DMEM / F12، 100 مل استبدال خروج المغلوب المصل (KSR)، 5 مل 100X غير الأساسيين حل محلول المخزون من الأحماض الأمينية، 5 مل 100X البنسلين / الأسهم الأمبيسلين، 5 مل 100X -mercaptoethanol حل الأوراق المالية، و 10 نانوغرام / مل bFGF. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 10 يوما.
- إعداد mTeSR1 المصل خالية المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 400 مل mTeSR1 المتوسطة القاعدية، 100 مل 5X ملحق، و 5 مل 100X حل الأوراق المالية البنسلين / الأمبيسلين. إبقاء المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 10 يوما.
- إعداد محلول المخزون 10X كولاجيناز الرابع: يزن 0.5 غرام من كولاجيناز الرابع السلطة، وحله مع 50 مل DMEM / F12 وفلتر تعقيم. جعل مأخوذة والمخزون منها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر.
- إعداد 0.1٪ محلول الجيلاتين: تزن 0.5 غرام من الجيلاتين (من الجلد البقري، نوع B) السلطة وحله مع الماء منزوع الأيونات. إبقاء الأوتوكلاف الحل تعقيمها في درجة حرارة الغرفة لمدة أسابيع.
- إعداد KSR التمايز المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 410 مل DMEM، 75 مل KSR، 5 مل 100X حل غير الأساسيين الأسهم الأحماض الأمينية، 5 مل 100X البنسلين / الأمبيسلين محلول المخزون، 5 مل 100X -mercaptoethanol محلول المخزون. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 10 يوما.
ملاحظة: KSR يختلف من الكثير الكثير، والتي قد تؤثر على كفاءة التمايز. ولذلك فمن الأفضل لاختبار عدة دفعات من KSR للعثور على أفضل واحد للتمايز. - إعداد N2 التمايز المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 98 مل DMEM، 1 مل 100X ملحق N2 و 1 مل 100X حل الأوراق المالية البنسلين / الأمبيسلين. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4° C لمدة لا تتجاوز 10 يوما.
- إعداد B27 التمايز المتوسطة من خلال الجمع ما يلي: 480 مل المتوسطة neurobasal، 10 مل 50X B27 الملحق، 5 مل glutamax 100X حل الأوراق المالية، و 5 مل 100X حل الأوراق المالية البنسلين / الأمبيسلين. إبقاء فلتر تعقيم المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز 10 يوما.
2. ثقافة hESCs وhiPSCs على الخلايا المغذية MEF
تم الحصول على hESCs H9 من معهد بحوث معهد ويسيل وأنشئت hiPSCs في المختبر ريجو بيرا من خلال بوساطة الارتجاعي تنبيغ ياماناكا عوامل OCT3 / 4، SOX2، KLF4، وج MYC 18.
- قبل يوم واحد على الأقل مرور الخلية، وإعداد بعض لوحات الجيلاتين بإضافة 1 مل 0.1٪ إلى 1 الجيلاتين جيدا من 6 لوحات جيدا، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- بعد الحضانة، ونضح الجيلاتين من لوحات، والبذور التشعيع المعطل خلايا MEF على لوحات في كثافة 1.6 × 10 5 خلايا/ جيد في المتوسط MEF باستخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا.
ملاحظة: اختياريا تحضير مغذيات MEF قبل وقت مبكر من مرور 3 أيام الخلية. - خلايا مرور يوم واحد بعد الطلاء مغذيات MEF: نضح المتوسطة من hPSCs، إضافة 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع من الخلايا في 1 مل / جيد، واحتضان خلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- خلال هذه الحضانة، وغسل مغذيات MEF مرة واحدة مع PBS، ثم قم بإضافة دافئ (37 درجة مئوية) التي تحتوي على مصل hPSC مستنبت في 1.5 مل / جيد.
- بعد 1 ساعة، اضغط على لوحة الثقافة بضع مرات حتى أن معظم المستعمرات غير متمايزة وفصل من لوحات، في حين لا تزال مستعمرات متباينة المرفقة. جمع بعناية المستعمرات العائمة، ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
- غسل بلطف مرة واحدة مع لوحة دافئ (37 درجة مئوية) DMEM / F12 ونقل DMEM / F12 في نفس أنبوب 15 مل.
- أنابيب الطرد المركزي في 179 x ج لمدة 3 دقائق.
- نضح المتوسطة من الأنابيب، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه. إضافة حربم hPSC مستنبت، ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر لهم في مجموعات صغيرة ومزجها جيدا.
- نقل الخلايا على مغذيات MEF جديدة في 1: 3-1: 6 النسبة.
- تغيير متوسطة كل يوم ومرور الخلايا كل 5-6 أيام.
3. إعداد الخلايا لتمايز
- في قبل إعداد خلايا الأقل يوم واحد، وإعداد بعض لوحات Matrigel (عادة 3 آبار لوحة 6 جيدا). تمييع مع Matrigel الباردة (4 درجات مئوية) DMEM / F12 في 1:40 وإضافة 1 مل Matrigel لكل بئر من 6 لوحات جيدا. احتضان لوحات Matrigel عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: يمكن للمرء أن ختم لوحات Matrigel مع parafilm والمخزون منها في 4 درجات مئوية لطالما أسبوع واحد.
- استخدام الخلايا (انظر الخطوة 2) بعد مرور 4 أيام. إزالة كافة المستعمرات متباينة من لوحات. نضح المتوسطة من لوحة الثقافة، إضافة 1 مل accutase لكل بئر، واحتضان خلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أثناء الحضانة، وإعداد بعض هلامatin وحات بإضافة 1 مل الجيلاتين جيدا إلى 1 من 6 لوحات جيدا. وضع هذه اللوحات وMatrigel لوحات أعدت قبل يوم واحد في الحاضنة.
- بعد حضانة 5 دقائق أو عندما تصبح خلايا شبه العائمة، وخلايا ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لجعلها في خلايا مفردة.
- جمع الخلايا واحد إلى 15 مل أنابيب، والطرد المركزي في 258 x ج لمدة 3 دقائق.
- Resuspend الخلايا مع كمية مناسبة من المصل يحتوي hPSC مستنبت، وإضافة Thiazovivin إلى تركيز النهائي من 2 ميكرومتر.
- نقل الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة في نسبة 1: 1، واحتضان خلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة مغذيات MEF.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، إضافة المصل المناسب تحتوي hPSC المتوسطة وعدد الخلايا مع عدادة الكريات.
- الطرد المركزي الخلايا في 258 x ج لمدة 3 دقائق.
- أثناء الطرد المركزي، إضافة إلى Thiazovivin المناسبة mTeSR1 المتوسطة لجعل تركيز 2 ميكرومتر.
- بعد الطرد المركزي، وspirate المتوسط وإضافة المناسب المتوسطة mTeSR1 مع Thiazovivin حتى ان هناك 1.8 × 10 5 خلية / مل المتوسطة.
- اخراج لوحات Matrigel من الحاضنة، نضح Matrigel وإضافة 2 مل من الخلايا المختلطة على 1 جيدا لوحات 6 جيدا.
ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلايا 3.6 × 10 4 خلية / سم 2 من مساحة السطح. - العودة لوحات العودة إلى الحاضنة، والسماح للخلايا نعلق لمدة 24 ساعة.
- 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، ونضح المتوسطة القديم وإضافة 2 مل المتوسطة mTeSR1 جديدة لكل بئر، والسماح الخلايا تنمو لمدة 24 ساعة أخرى قبل بدء التمايز.
تمايز الخلايا
- بدء التمايز 48 ساعة بعد replating الخلايا على لوحات Matrigel.
- نضح مستنبت من لوحة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من متوسطة التمايز التالية لكل بئر: KSR المتوسطة التمايز تستكمل مع 10 ميكرومتر SB431542 و 100 نانومتر LDN-193189. اجعل هذا اليوم كما D0 التمايز.
- تغيير متوسطة كل يوم من D0 إلى D20.
ملاحظة: يمكن للمرء أن إعداد المتوسطة للاستخدام لا يزيد عن 2 أيام في المرة الواحدة. - استخدام المتوسطة التالية لD1 و D2: KSR المتوسطة التمايز تستكمل مع 10 ميكرومتر SB431542، 100 نانومتر LDN-193189، 0.25 ميكرومتر SAG، 2 ميكرومتر purmorphamine، و 50 نانوغرام / مل FGF8b.
- استخدام المتوسطة التالية لD3 و D4: KSR المتوسطة التمايز تستكمل مع 10 ميكرومتر SB431542، 100 نانومتر LDN-193189، 0.25 ميكرومتر SAG، 2 ميكرومتر purmorphamine، 50 نانوغرام / مل FGF8b، و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- استخدام المتوسطة التالية لD5 D6 و: 75٪ KSR التمايز المتوسطة بالإضافة إلى 25٪ التمايز N2 المتوسطة تستكمل مع 100 نانومتر LDN-193189، 0.25 ميكرومتر SAG، 2 ميكرومتر purmorphamine، 50 نانوغرام / مل FGF8b، و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- استخدام المتوسطة التالية لD7 وD8: 50٪ KSR التمايز المتوسطة بالإضافة إلى 50٪ التمايز N2 المتوسطة تستكمل مع 100 نانومتر LDN-193189 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- استخدام المتوسطة التالية لوD9 D10: 25٪ KSR التمايز المتوسطة بالإضافة إلى 75٪ التمايز N2 المتوسطة تستكمل مع 100 نانومتر LDN-193189 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
- استخدام المتوسطة التالية لD11 D12 و: B27 التمايز المتوسطة تستكمل مع 3 ميكرومتر CHIR99021، 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية الدماغي، 10 نانوغرام / مل GDNF، 1 نانوغرام / مل TGF3، 0.2 ملي حمض الاسكوربيك و 0.1 ملي المخيم.
- استخدام المتوسطة التالية لبقية التمايز: B27 التمايز المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية الدماغي، 10 نانوغرام / مل GDNF، 1 نانوغرام / مل TGF3، 0.2 ملي حمض الاسكوربيك و 0.1 ملي المخيم.
- في حوالي D16 التمايز، وإعداد بعض بولي L-الأورنيثين / لوحات Laminin / فيبرونكتين]. تمييع بولي L-الأورنيثين حل الأسهم مع الباردة (4 ° C) PBS إلى 15 ميكروغرام / مل، إضافة 1 مل إلى 1 جيدا لوحات 6 جيدا، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- نضح الحل بولي L-الأورنيثين، تغسل الصحون 3 مرات مع الماء المعقم ثم الهواء الجاف لوحات.
- تمييع laminin الأسهم سولution مع الباردة (4 ° C) PBS إلى 1 ميكروغرام / مل، إضافة 1 مل إلى جانب واحد من 6 لوحات جيدا، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- نضح الحل laminin، تغسل الصحون 3 مرات مع الماء المعقم ثم الهواء الجاف لوحات.
- تمييع الحل الأسهم فبرونيكتين مع الباردة (4 ° C) PBS إلى 2 ميكروغرام / مل، إضافة 1 مل إلى 1 جيدا من 6 لوحات جيدا، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- ختم لوحات مع parafilm ووضعها في 4 درجات مئوية لطالما أسبوعين.
- بعد 20 يوما من التمايز، replate الخلايا لبولي-L-الأورنيثين / لوحات Laminin / فيبرونكتين]. نضح التمايز المتوسطة، إضافة 1 مل دافئ (37 درجة مئوية) accutase إلى 1 جيدا لوحات 6 جيدا، واحتضان خلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أثناء الحضانة، ووضع بولي-L-الأورنيثين / لوحات Laminin / فيبرونكتين] في الحاضنة.
- بعد حضانة 5 دقائق أو عندما تصبح خلايا شبه العائمة، خلايا ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لجعلها في خلايا مفردة.
- جمع الخلايا واحدة في 15 مل أنابيب مخروطية، وإضافة كمية مناسبة من المتوسطة neurobasal لخلية العد، والتي سوف تختلف اعتمادا على التوسع (بعد 11 يوما من التمايز، الخلايا قد توسع 15-20 أضعاف). عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- الطرد المركزي الخلايا في 258 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف، و resuspend الخلايا مع B27 التمايز المتوسطة بحيث تركيز الخلية هو 1 × 10 6 خلية / مل المتوسطة.
- نضح فبرونيكتين من لوحات، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل الخلايا ل1 جيدا من 6 لوحات جيدا.
ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الخلية لreplating 2 × 10 5 خلية / سم 2 من مساحة السطح. - تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة لإزالة أي خلايا ميتة غير مرتبط.
- تغيير متوسطة كل يوم حتى نقطة الوقت المطلوب لإجراء تجربة معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض لمحة عامة عن بروتوكول التمايز في الشكل 1. كفاءة بروتوكول التمايز المعروضة هنا تعتمد على وضع الخلايا تبدأ. لذا، من المهم جدا للتأكد من أن أول واحد يزيل كل المستعمرات متباينة قبل النأي hPSCs إلى الخلايا واحد للتمايز، والثانية، واحد يستنزف معظم، إن لم يكن كلها، والخلايا المغذية MEF التي تفرخ الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة لمدة 30 دقيقة، والثالثة، واحدة لوحات الخلايا واحدة hPSC في الكثافة المناسبة على لوحة Matrigel. كما هو موضح في الشكل 2، replated الخلايا واحد hPSC سوف توسع شكل مجموعات خلال 48 ساعة قبل التمايز، والتي تشكل حوالي 70٪ التقاء في لوحات. ثم بعد التمايز، وهذه الخلايا الوصول إلى نقطة التقاء كاملا في قصيرة قدر 3-4 أيام، وبدءا من D16-D17 حول هذه الخلايا متموجة تبدأ لجعل بعض المساحات في لوحات، وبعض محاور / neurites التي يمكن بالفعللوحظ في هذه المساحات وتحت طبقات الخلية. بعد أن replated في D20، وخلايا متباينة المرفقة ونمت كتل صغيرة. ثم خلال 5 أيام القادمة، محاور عصبية أكثر كثافة بكثير وسليمة شكليا / neurites التي تخرج من كتل، ومحاور / neurites التي من كتل مختلفة تشكل بعض الاتصالات. خلال الثقافة على المدى الطويل، الخلايا العصبية في أجمة واحدة تولد المزيد من التمديدات، والحصول على أكثر نضجا ولها مزيد من الاتصالات مع الخلايا العصبية في كتل المجاورة.
بعد 11 يوما من التمايز، hPSCs يمكن تحويلها بكفاءة لالسلائف FP، وكما هو موضح في الشكل (3)، وتقريبا كل خلايا تعبر عن FP علامات خلية السلائف NESTIN وFOXA2، وأكثر من 90٪ من الخلايا تعبر عن ثلاث علامات أخرى CORIN، OTX2 وLMX1a. ثم بعد أيام أكثر من التمايز، يتم تحديد الخلايا إلى الخلايا العصبية السلائف FP DA لأنها تعبير عن TUJ1 وTH (الشكل 4A). هذه الخلايا العصبية DA هي الهوية A9 كما اكسبريسق GIRK2 حين سلبية لCalbindin (الشكل 4B). تظهر التجارب المناعية أيضا أنه لا توجد GFAP + الخلايا النجمية وعدد قليل جدا من الخلايا العصبية GABAergic (الشكل 4C)، مشيرا إلى أن التمايز يتم تحديد حصرا نحو الخلايا العصبية النسب DA.
الرقم 1. نظرة عامة على بروتوكول التمايز، مع عوامل النمو / الجزيئات الصغيرة والمتوسطة تستخدم لثقافة كل يوم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المورفولوجيةآل التغييرات خلال التمايز. تم مطلي hESCs H9 والخلايا واحد في كثافة الخلية المناسبة كما هو موضح، و48 ساعة بعد ذلك، وهذه الخلايا تصل إلى حوالي 70٪ التقاء في لوحة والمستعمرات (D0). خلال الأيام القليلة الأولى من التمايز، الخلايا تتوسع بسرعة لتصل إلى أكثر من 90٪ التقاء بعد 24 ساعة من التمايز (D1)، ثم تصبح نقطة التقاء بعد 48 ساعة المزيد (D3). ومع ذلك، فإن معظم هذه الخلايا لا يزال يحمل مورفولوجيا HESC نموذجي مع نواة إلى ارتفاع نسبة السيتوبلازم (D3). كما يقول التمايز في الخلايا تتوسع أكثر وتفقد تدريجيا HESC التشكل. في نهاية D11 التمايز، وهناك أكثر من طبقات الخلايا في أجزاء كثيرة من لوحة، كما يتضح من لون أغمق من الخلايا في بعض المناطق أكثر من غيرها (D11). بدءا من D17 إلى D20 حول ماتت بعض الخلايا، وترك بعض المساحات في لوحة، ويمكن أن يكون بالفعل لاحظت بعض التوقعات الخلايا العصبية في هذه المساحات لالثانية أحيانا تحت طبقة الخلية (D20). بعد replating خلية في نهاية D20 لبذل المزيد من المساحات للخلايا أن تنمو وتمايز الخلايا تتجمع مجموعات صغيرة، الكثير من محاور / neurites التي تنبثق من هذه المجموعات، ومحاور / neurites التي من مجموعات مختلفة تشكل في بعض وصلات قصيرة قدر 4-5 أيام (D25). شريط الحجم، 200 ميكرون.
كانت متباينة الشكل 3. المناعية للعلامات FP في مرحلة مبكرة من hESCs التمايز. H9 لمدة 11 يوما باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا. كانت خلايا ثم ثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪، permeabilized مع تريتون X-100، ومنعت مع المصل حمار ثم الملون لFP علامات خلية السلائف. كما هو موضح هنا، تقريبا جميع خلايا تعبر FOXA2 وNESTIN، وأكثر من 90٪ من الخلايا التعبير عن LMX1a، CORIN، وOTX2، مما يشير إلى كفاءة تحويل عالية جدا من hESCs إلى خلايا FP. شريط الحجم، 200 ميكرون.
الرقم 4. المناعية للعلامات العصبية DA في مراحل متأخرة من التمايز. كانت متباينة (A) hESCs H9 لمدة 25 يوما، وكانت تخضع لخلايا المناعية للعموم الخلايا العصبية علامة TUJ1 وتستخدم عادة DA الخلايا العصبية علامة TH. كما هو موضح هنا، وإن كانت هناك خلايا أكثر إيجابية TUJ1 من الخلايا إيجابية TH، جميع خلايا TH، معربا عن بقايا في الخلايا، معربا عن TUJ1، وخلايا TH-معربا تمثل على الأقل نصف جميع الخلايا. (B). تم التفريق بين hESCs H9 مزيد مدة 25 يوما أخرى (تماما 50 يوما) ثم كانت الخلايا المناعية خاضعة لل. أظهرت النتائج أن هناك نسبة أعلى من TH-معربا عن الخلايا عشرلأنه في D25. تقريبا كل هذه الخلايا معربا عن TH-أيضا عن GIRK2 في حين أن معظم منهم السلبي لCalbindin، مما يدل على هوية النوع الفرعي A9 من الخلايا العصبية DA ولدت، وهو نوع من الخلايا التي فقدت في PD. أظهر (C) للخلايا المناعية في D25 التمايز أن هناك خلايا التعبير GFAP، وعدد قليل جدا من خلايا التعبير عن GABA. شريط الحجم، 200 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (بما في ذلك hESCs وhiPSCs) يمكن التفريق في المختبر لتوليد معظم، إن لم يكن كل، أنواع الخلايا من الجسم بما في ذلك الخلايا العصبية DA، الذي ثبت في الدراسات السابقة 19. هنا، على أساس المعرفة من الدوبامين العصبية الجنينية تطوير 20 والبروتوكولات المنشورة من المختبرات الأخرى 14،15، نحن الأمثل الظروف الثقافة لتوليد الخلايا العصبية DA من hESCs وhiPSCs. هذا البروتوكول هو الكفاءة، واستنساخه لدينا تطبيق هذا البروتوكول الموصوفة هنا إلى H1 و H9 HESC خطوط وخطوط hiPSC من كل من المرضى PD والضوابط تتأثر بنجاح.
في بروتوكول لدينا، وهناك ثلاث خطوات أساسية للحصول على كفاءة عالية التمايز: أولا، يجب أن يكون هناك مستعمرات hPSC متباينة في الخلايا قبل توجيه التمايز. غالبا ما ينظر إلى التمايز وعفوية لجميع الطبقات الجرثومية الثلاث في حثقافة PSC، من المهم لإزالة هذه المستعمرات متباينة قبل نأينا هذه hPSCs إلى خلايا واحدة. ثانيا، ينبغي أن تستنفد مغذيات MEF من hPSCs فصلها، كما أظهرت تقارير سابقة أن الخلايا MEF يمكن لعوامل السرية التي تعزز التجديد الذاتي وتمنع التمايز 21. لهذا الغرض، واحتضان hPSC خلية MEF مخاليط على لوحات الجيلاتين المغلفة لمدة 30 دقيقة يجب أن تكون كافية لإزالة ما يقرب من جميع الخلايا MEF. ثالثا، ينبغي مطلي على hPSCs واحدة في كثافة الخلية المناسبة للتمايز. وزيادة كثافة الخلية يؤدي إلى موت الخلايا في معظم أنحاء D11 التمايز، وفي الوقت نفسه تخفيض كثافة الخلية سيؤدي إلى انفصال وموت الخلايا في وسط لوحة في قصيرة قدر أقل من 7 أيام، على الرغم من أن الخلايا على سوف حافة التفريق جيدا (لا تظهر البيانات). إذا يلاحظ المرء كل هذه المعايير الثلاثة، فمن السهل للحصول على الخلايا العصبية DA بكفاءة من hPSCs مع بروتوكول تدريجي لدينا.
بروتوكول المعروضة هنا يقوم أساسا على تقرير سابق بواسطة L. ستودر وزملاؤه 14 مع بعض التعديلات. أولا، بدأ تمايز هنا 48 ساعة بعد الطلاء خلية واحدة عندما تصل خلايا فقط حوالي 70٪ التقاء، بينما في تقريرهم، بدأ التمايز عندما تصل خلايا التقاء الكامل (3 أيام أو أكثر للثقافة بعد خلية واحدة تصفيح). في تجربتنا، بدءا من تمايز خلايا متكدسة دون مرور الخلية حتى يوم 20 يؤدي إلى موت الخلايا شديد أثناء عملية التمايز. ثانيا، نحن استبدال البروتين SHH مكلفة في دراستهم مع SAG، صغيرة ناهض التي تحتوي على جزيء chlorobenzothiophene لسمو المسار 22. وبالتالي، مقارنة مع بروتوكولات المنشورة سابقا، هذا واحد هو موضح هنا خلية العصبية المغذية وردة مستقلة، وتقوم أساسا على جزيئات صغيرة لمواصفات FP. وهو بالتالي أقل تكلفة وأقل الزمني وتستغرق والعمل. بطبيعة الحال، فإن لىmitation من هذا البروتوكول هو استخدام KSR في الأيام الأولى من التمايز. KSR يختلف من الكثير الكثير، والتي قد تؤثر على كفاءة التمايز. لذا، ينبغي للمرء اختبار دفعات مختلفة من KSR للحصول على واحد أن يعمل على نحو أفضل في حمل السلائف FP بعد 11 يوما من التمايز.
وباختصار، ينبغي للبروتوكول التمايز ملموح هنا تيسير ما يلي: (1) توليد الخلايا العصبية DA من hESCs أو hiPSCs من الأشخاص الطبيعي العلاج ببدائل خلية لPD. (2) جيل من الخلايا العصبية DA من iPSCs المريض PD لنمذجة واختبار العقاقير العلاجية المحتملة لPD في المختبر؛ (3) دراسة الجينات / تنظيم مسارات إشارات تنمية الخلايا العصبية DA الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
