Introduction
도파민 (DA) 신경 세포는 중뇌, 시상 하부, 망막, 후각 전구 등 여러 가지 뇌 영역에서 찾을 수 있습니다. 전뇌로의 선조체 추체 외로 돌출하고 모터 시스템을 형성함으로써 흑색질의 유리체 compacta (SNpc) 제어 동작 및 운동 뉴런 A9 DA. A9 DA 뉴런의 변성은 두 번째 가장 일반적인 인간의 신경 퇴행성 질환과 현재 불치 파킨슨 병 (PD)에 연결됩니다. 세포 대체 요법은 PD (1)의 치료를위한 가장 유망한 전략 중 하나이고, 따라서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기) 및 모두 포함한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 A9 DA 신경 세포를 유도에 많은 관심이 있었다 최근 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs).
많은 연구는 다양한 방법을 사용하여 hPSCs에서 A9 DA 뉴런을 유도하기 위해 노력하고 있습니다. 신경을 통해 최초의 보고서 생성 된 모든 DA 뉴런장미 전구 단계입니다. 으로 또는 2-4주, L. STUDER 동료 성공적 신경 로제트 인간 배아 줄기를 생산하는 유도 다른 세 그룹의 외부 성장 인자없이 2 MS5 PA6 또는 3-5 기질 세포와 공동 배양. 그런 다음 기계적 박리 또는 추가 차별화를위한 소화 효소에 의해이 로제트를 강화. 다른 보고서에서 연구자들은 문화의 차별화 6-9 부동 배아 체를 통해 신경 로제트 (EB)를 생성합니다. 이후 연구진은 그들이 세포 외 매트릭스에 인간 배아 줄기 및 hiPSCs 도금 단일 층을 기반으로 차별화 방법 (10, 11)을 설립 생체 배아 DA 신경 세포의 개발을 모방 DA 뉴런에 hPSCs의 분화를 유도하는 문화에서 서로 다른 성장 인자를 추가 . 이러한 모든 연구는 DA 신경 세포의 일부 특성 티로신 수산화 효소 (TH) 발현 세포를 수득되지만, 전 분화 과정은, 시간과 노동력 소모일반적으로 비효율적 인, 그리고 더 중요한 것은, 이러한 신경 세포의 A9 ID는 LMX1a 자궁외 식 (12)를 제외한 대부분의 연구에서 입증되지 않았다. 최근, 새로운 바닥 판 (FP) 기반 프로토콜은 다음 DA 신경 세포의 잠재력 FP 전구체가 먼저 분화의 초기 단계에서 소닉 고슴도치와 정식 Wnt 신호 경로의 활성화에 의해 생성 된에 13-16, 개발되었다 이러한 FP 세포는 더 DA 뉴런에 지정되었습니다. 이 프로토콜은 더 효율적이지만, 여전히 몇 가지 문제가있다; 예를 들면, 전체의 분화 과정은 장시간 (적어도 35 일) 소요 종속 피더 셀 (15)은, 또는은 또는 EB A9 아이덴티티 14 입증되지 않았다 (16) 좌우된다.
여기서, 생체 배아 DA 신경 발달과 다른 연구자들의 발표 된 결과에서 지식에 기초하여, 우리는 EFF위한 배양 조건을 최적화 한인간 배아 줄기 및 hiPSCs 모두에서 DA 뉴런의 icient 생성. 우리는 첫번째 작은 분자 CHIR99021 작은 분자 SAG와 purmorphamine와 신호 소닉 고슴도치 정식 Wnt 신호의 활성화에 의해 FP 전구 세포를 생성합니다. 이러한 FP 세포는 FOXA2, LMX1a, 코린,의 Otx2 및 네 스틴을 표현한다. 우리는 다음 등 BDNF, GDNF를 포함 성장 인자와 DA 뉴런 이러한 FP 세포를 지정했습니다. 그들은 Calbindin 17 동안 네거티브 GIRK2 대해 긍정적으로 생성 DA 뉴런 A9 세포 유형이다. 이 프로토콜은 매우 효율적이고 재현성 피더 셀 또는 EB 독립적이다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나 또는 체외 PD의 모델링 또는 PD에 대한 잠재적 치료제를 테스트 PD 환자의 hiPSCs에서 인간 배아 줄기 또는 세포 이식 연구에 대한 정상인의 hiPSCs 미만 사주에서 DA 신경 세포를 유도 할 수있다.
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Protocol
문화 미디어의 1 준비
- 다음을 조합하여 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 배지를 준비 : 445 ml의 DMEM, 50 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 및 5 ㎖의 100X 페니실린 / 암피실린 원액. 이하 십사일 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오.
- 준비 혈청 함유 다음 조합함으로써 hPSC 배지를 : 385 ml의 DMEM / F12, 100 ㎖ 녹아웃 혈청 여분 (KSR), 5 ㎖ 100X 비 필수 아미노산 원액, 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 원액, 5 ㎖ 100X를 원액 메르 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖의 bFGF. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오.
- 다음을 조합하여 mTeSR1의 무 혈청 배지를 제조 : 400 ml의 mTeSR1 기본 배지 100 ㎖의 5 배 보충, 및 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 원액. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 매체를 보관하십시오.
- 10 배 콜라겐 IV 주식 솔루션을 준비 : 0.5 g 콜라게나 제 IV 전원을 달아50 ml의 DMEM / F12 및 필터 소독 그것을 녹인다. 분취 량을 확인하고 달 동안 C ° -20을 재고.
- 0.1 % 젤라틴 용액을 준비 : 전원 (소 피부, B 형에서) 0.5 g 젤라틴을 달아 탈 물로 녹인다. 주 실온에서 오토 클레이브 멸균 솔루션을 유지합니다.
- 다음을 조합하여 KSR 분화 배지를 제조 410 ㎖의 DMEM, 75 ml의 KSR을, 5 ㎖의 원액을 메르 캅토 에탄올 100X 비 필수 아미노산 원액, 5 ㎖ 100X 페니실린 / 암피실린 스톡 용액 5 ㎖를 100 배. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오.
참고 : KSR은 분화 효율에 영향을 미칠 수있는 많은으로 많이 다릅니다. 그것은 차별화를위한 최선의 일을 찾기 위해 KSR의 여러 배치를 테스트하는 것이 좋습니다. - 다음을 결합하여 N2 차별화 매체를 준비합니다 : 98 ㎖의 DMEM, 1 ml의 100 배 N2 보충 및 1 ml의 100 배 페니실린 / 암피실린 원액을. 4에서 필터 살균 매체 유지없이 10 일 이상 C를 °.
- 10 ㎖ 50X B27 보충제, 5 ㎖의 원액을 glutamax 100X, 100X 및 5 ㎖ 페니실린 / 암피실린 스톡 용액, 480 ml의 neurobasal 매체 : 다음을 조합하여 B27 분화 배지를 준비한다. 더 이상 10 일 동안 4 ° C에서 필터 살균 매체를 보관하십시오.
MEF 피더 세포에 인간 배아 줄기 및 hiPSCs의 2 문화
H9의 인간 배아 줄기는 WiCell 연구소에서 얻은하고 hiPSCs는 야마나카의 레트로 바이러스 매개 형질 도입을 통해 Reijo 페라 실험실에서 설립되었다 요인 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 C-MYC 18.
- 적어도 일일 세포 통로 전에, 6 - 웰 플레이트의 1도에 1 ㎖의 0.1 % 젤라틴을 추가하여 일부 젤라틴 판을 준비하고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품어.
- 배양 플레이트에서 흡 젤라틴 및 시드 조사 후에는 1.6 x 10 5의 세포 밀도로 플레이트 상 MEF 세포를 불 활성화/ 웰 MEF 배지에서 세포를 세는 혈구를 사용.
주 : 선택적으로 빠르면 3 일 정도 세포 통로 전에 MEF 피더를 준비합니다. - 통로 세포 MEF 피더 도금 후 일일 : hPSCs에서 흡인 매체 잘 / 1 ML에서 세포에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV를 추가하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 세포를 배양한다.
- 이 부화하는 동안, PBS로 한번 MEF 피더 세척 한 다음도 1.5 ㎖ /에서 따뜻한 (37 ° C) 혈청 함유 hPSC 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 미분화 식민지의 대부분이 판에서 분리 수 있도록 차별화 된 식민지가 연결된 상태를 유지하면서 1 시간 후, 배양 접시에 몇 번을 누릅니다. 조심스럽게 떠 식민지를 수집하고, 15 ML 튜브로 전송합니다.
- 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) DMEM / F12 한 번 접시를 씻어 같은 15 ML 튜브로 DMEM / F12을 전송합니다.
- 3 분 동안 179 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 펠렛을 방해하지 않도록주의 튜브에서 대기음 매체. 전쟁 추가m hPSC 배지, 작은 클러스터로 휴식과 잘 섞는다까지 여러 번 아래로 세포를 피펫.
- 일에 새로운 MEF 피더에 세포를 전송 : 3-1 : 6 비율.
- 모든 5~6일 매일 통로 세포 매체를 변경합니다.
차별화를위한 세포의 3 준비
- 세포의 준비를하기 전에 적어도 하루에 일부 마트 리겔 플레이트 (6 웰 플레이트의 일반적으로 세 우물)을 준비합니다. 1시 40분 찬 (4 ° C) DMEM / F12와 마트 리젤을 희석하고 6 웰 플레이트 잘 당 1 ㎖의 마트 리젤을 추가합니다. 4 ° C에서의 하룻밤 마트 리겔 판을 품어. 참고 : 하나는 파라 필름과 매트 리겔 판을 밀봉 한 것과 일주일 동안 4 ° C에서 그들을 재고 할 수 있습니다.
- 사일 통과 한 후 세포를 (2 단계 참조)를 사용합니다. 판의 모든 차별화 된 식민지를 제거합니다. 배양 접시에서 대기음 매체는 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 잘 한 ML accutase 당 추가하고, 부화.
- 배양 동안 일부 젤을 준비6 - 웰 플레이트에 1 ㎖ 젤라틴 1 내지도 추가하여 플레이트 ATIN. 이 판과 배양기에서 일일 전에 준비 마트 리겔 플레이트를 놓습니다.
- 세포가 될 때 반 부동 5 분 배양 후 또는 피펫 세포 위아래로 여러 번 단일 세포로 만들 수 있습니다.
- 3 분 동안 258 XG에 한 15 ml의 튜브에 세포와 원심 분리기를 수집합니다.
- 재현 탁 된 hPSC 배지를 함유하는 혈청의 적절한 양의 세포, 및 2 μM의 최종 농도 Thiazovivin 추가.
- 1에서 젤라틴 코팅 플레이트 상에 세포를 전송 : 30 분 동안 37 ° C에서 1 비율 및 배양 세포는 MEF 피더를 제거합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송, hPSC 매체를 포함하는 적절한 혈청을 추가하고 혈구와 세포를 계산합니다.
- 3 분 동안 258 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리기 중에 2 μM의 농도를 만들기 위해 mTeSR1 매체 처분시 Thiazovivin 추가.
- 원심 분리기, 후매체를 spirate 및 / ㎖ 매체 1.8 × 10 5 세포가되도록 Thiazovivin와 적절한 mTeSR1 매체를 추가 할 수 있습니다.
- , 인큐베이터에서 마트 리젤 판을 꺼내 마트 리젤을 대기음 6 웰 플레이트의 일에 잘 혼합 세포 2 ㎖를 추가합니다.
NOTE : 세포 밀도가 3.6 × 104 세포 / 표면적이 cm이어야한다. - 인큐베이터에 번호판을 반환하고, 세포를 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- 24 시간 세포를 도금 후, 오래된 매체를 대기음 잘 당 2 ㎖의에게 새로운 mTeSR1 매체를 추가하고 분화를 시작하기 전에 세포가 다른 24 시간 동안 성장 할 수 있습니다.
세포 분화
- 마트 리겔 플레이트에 세포를 replating 후 분화 48 시간을 시작합니다.
- 플레이트에서 기음 문화 매체는 PBS로 한 번 세포를 씻어 잘 당 다음과 같은 분화 배지 2 ㎖를 추가 : 10 μM SB431542 및 100 nm의 LDN-193 보충 KSR 차별화 매체189 마크 분화 D0로이 일.
- D20에 D0에서 매일 매체를 변경합니다.
참고 : 한 번에 이일보다 더 사용하기 위해 미디어를 준비 할 수 있습니다. - 10 μM SB431542, 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b 보충 KSR 차별화 매체 : D1과 D2에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.
- 10 μM SB431542, 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b, 3 μM의 CHIR99021 보충 KSR 차별화 매체 : D3와 D4에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.
- 100 nm의 LDN-193189, 0.25 μM SAG, 2 μM의 purmorphamine, 50 NG / ㎖ FGF8b, 3 μM CHIR99021 보충 75 % KSR 차별화 매체 플러스 25 % N2 차별화 매체 : D5 및 D6에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.
- 100 nm의 LDN-193189와 3 μM CHIR99021 보충 50 % KSR 차별화 매체 플러스 50 % N2 차별화 매체 : D7과 D8에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.
- 100 nm의 LDN-193189와 3 μM의 CHIR99021 보충 25 % KSR 차별화 매체 플러스 75 % N2 차별화 매체 : 다음 D9에 대한 중간 및 D10을 사용합니다.
- 3 μM CHIR99021, 10 NG / ml의 BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF, 1 NG / ㎖ TGF3, 0.2 MM의 아스 코르 빈산 및 0.1 mM의 캠프로 보충 B27 차별화 매체 : D11과 D12에 대해 다음 매체를 사용합니다.
- 10 NG / ml의 BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF, 1 NG / ㎖ TGF3, 0.2 MM의 아스 코르 빈산 및 0.1 mM의 캠프로 보충 B27 차별화 매체 : 차별화의 나머지 부분에 대한 다음과 같은 매체를 사용합니다.
- 분화에 대한 D16에서 일부 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴 판을 준비합니다. 폴리-L-오르니 틴 감기 (4 ° C에서)와 원액을 15 ㎍ / ml의 PBS가, 하룻밤 37 ° C에서 접시를 6 웰 플레이트의 1도에 1 mL를 넣고 배양 희석.
- , 폴리-L-오르니 틴 솔루션을 기음 판에게 멸균 수로 3 회 세척 한 후 공기가 판을 건조.
- 라미닌 재고 졸을 희석1 ㎍ / ㎖의 감기 (4 ° C) PBS와의 ution는 6 - 웰 플레이트 잘 하나에 1 mL를 넣고 하룻밤 37 ° C에서 번호판을 품어.
- , 라미닌 솔루션을 기음 판에게 멸균 수로 3 회 세척 한 후 공기가 판을 건조.
- , 2 ㎍ / ㎖의 감기 (4 ° C) PBS와 피브로넥틴 원액을 희석 6 - 웰 플레이트의 1도에 1 mL를 넣고 하룻밤 37 ° C에서 번호판을 품어.
- 파라 필름으로 밀봉 판과 최대 2 주부터 4 ° C에 배치합니다.
- 분화 20 일 후, 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴 플레이트에 세포를 replate. 기음 차별화 매체는, 6 웰 플레이트의 1도에 1 ml의 따뜻한 (37 ° C) accutase을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양한다.
- 배양 동안 인큐베이터에 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 / 피브로넥틴이 판을 배치합니다.
- 5 분간 배양 한 후, 또는 세포가 될 때까지 아래로 수회 부드럽게 피펫 세포 세미 부동하나의 세포로합니다.
- 15 ml의 원추형 튜브에 단일 세포를 수집하고, 팽창에 따라 달라질 셀 카운팅 neurobasal 매체의 적당량을 추가 (분화 11 일 후, 세포를 15 ~ 20 배로 확대있다). 혈구를 사용하여 세포를 카운트.
- 3 분 동안 258 XG에서 세포를 원심 분리기. B27 분화 배지로 기음 상청액, 세포를 재현 탁하고 세포 농도 / ㎖ 배지 1 × 10 6 세포가되도록.
- 접시에서 대기음 피브로넥틴은 PBS로 두 번 세척하고, 6 - 웰 플레이트의 한 웰에 2 ㎖의 세포를 추가합니다.
NOTE : replating 대한 세포 밀도가 2 × 105 세포 / 표면적이 cm이어야한다. - 모든 부착되지 않은 죽은 세포를 제거하기 위해 24 시간 후 매체 변경합니다.
- 주어진 실험에 대해 원하는 시점까지 매일 매체를 변경합니다.
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Representative Results
분화 프로토콜의 개요는도 1에 도시된다. 여기에 제시된 분화 프로토콜의 효율은 출발 세포의 상태에 의존한다. 따라서, 첫 번째는 분화 단일 세포로 hPSCs 해리 전에 분화 콜로니를 제거하며, 둘째, 하나는 모든 경우에, MEF 피더 세포 젤라틴 - 코팅 된 플레이트상에서 세포를 배양하여, 대부분 고갈 것을 확인하는 것이 중요 30 분, 그리고 세 번째, 마트 리겔 플레이트 상에 적절한 밀도로 한 판 hPSC 단일 세포. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단일 hPSC 세포 플레이트에 약 70 % 합류점을 형성, 분화 이전에 48 시간 동안 클러스터로 확장 할 도말. 그런 다음 분화 한 후,이 세포는 짧은 3 ~ 4 일 만에 전체의 합류에 도달하고, D16-D17 주위에서 시작하여,이 합류 세포는 판에 약간의 공간을 만들기 위해 시작, 일부 축삭 / 신경 돌기는 이미 수이러한 공간 및 세포층으로 관찰 될 수있다. D20에 도말 한 후, 분화 세포 부착 및 작은 덩어리 증가했다. 그런 다음 오일 동안 더 많은 집중과 형태 학적 손상 축삭 / 신경 돌기는 수풀에서 나와서 축삭 / 다른 덩어리에서 신경 돌기는 일부 연결을 형성한다. 장기 배양하는 동안, 한 덩어리의 뉴런이 더 많은 확장을 생성 더 성숙 얻을 이웃 덩어리의 뉴런과 더 많은 연결을 가지고있다.
분화 11 일 후에 hPSCs 효율적 FP 전구체로 전환 될 수 있으며,도 3에 도시 된 바와 같이, 거의 모든 세포는 FP 전구 세포 마커 네 스틴 및 FOXA2을 표현하고, 세포의 90 % 이상이 다른 3 개의 마커보기 코린,의 Otx2 표현 및 LMX1a. 그들은 TUJ1 및 TH (도 4a)를 표현하는 것에 따라 더 분화 일 후에 FP 전구 세포는 DA 신경에 지정된다. 그들은 EXPRES 이러한 DA 뉴런은 A9의 정체성 아르의 GIRK2의 동안은 Calbindin (그림 4B) 부정적이다. 면역 염색 실험은 분화가 독점적으로 DA 신경 계통으로 지정되어 있는지를 나타내는 더 GFAP + 성상 세포와 거의 GABA 성 뉴런 (그림 4C)가있을 없다는 것을 보여줍니다.
그림 성장 인자 / 작은 분자 각각의 일에 사용되는 배지로 분화 프로토콜의 개요 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 형태 학적알은 한 바와 같이 H9의 인간 배아 줄기 적절한 세포 밀도에서 단일 세포로 도금 하였다. 분화 동안 변경하고, 그 이후로 48 시간이,이 세포는 식민지 (D0)로 플레이트에서 약 70 %의 합류에 도달합니다. 분화의 처음 며칠 동안, 세포 분화에 24 시간 (D1)이 90 % 이상에 도달 합류 빠르게 확장하고 48 시간 이상 (D3) 이후에 합류된다. 그러나, 이들 세포의 대부분은 여전히 세포질 비율 (D3)로 높은 핵 hESC의 일반적인 형태를 나타낸다. 차별화이 지남에 따라 세포는 더 확장하고 점차적으로 hESC의 형태를 잃게됩니다. 기타 (D11)보다 일부 지역에서는 셀의 어두운 색에 의해 입증 분화 D11의 단부에서 판의 많은 부분에서 하나 이상의 세포층이있다. D20 D17에 대한에서 시작, 일부 세포는 판에 약간의 공간을 남겨두고 사망, 일부 신경 세포의 돌기는 이미 이러한 공간에서 관찰 할 수있는ND 때때로 전지 층 (D20) 미만. 성장 세포 분화에 대한 더 많은 공간을 만들기 위해 D20의 끝에서 세포 replating 후, 세포가 작은 클러스터를 집계, 더 많은 축삭 / 신경 돌기는 이러한 클러스터에서 등장하고, 축삭 / 다른 클러스터에서 신경 돌기는 짧은에서 일부 연결을 형성 4~5일 (D25). 스케일 바, 200 μm의.
차별화. H9의 인간 배아 줄기의 초기 단계에서 FP 마커 그림 3 면역 염색은 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 십일일에 대한 차별화 하였다. 세포는 트리톤 X-100과 permeabilized 4 % 파라 포름 알데히드, 당나귀 혈청 차단하고 FP 전구 세포 마커 스테인드 고정되었다. 여기에 도시 된 바와 같이, 거의 모든 세포 FOXA2 및 네 스틴을 표현하고, 세포의 90 % 이상이 LMX1a, 코린을 표현하고,의 Otx2, FP에 인간 배아 줄기 세포에서 매우 높은 효율의 변환을 나타낸다. 스케일 바, 200 μm의.
차별화의 후반 단계에서 DA 신경 세포 마커 그림 4 면역 염색. (A) H9의 인간 배아 줄기 25 일 동안 분화 및 세포는 팬 - 신경 세포 마커 TUJ1 및 일반적으로 사용되는 DA 신경 세포 마커 TH에 대한 면역 염색의 대상이었다되었다. TH 양성 세포 이상 TUJ1 양성 세포가 있지만, 여기에 도시 된 바와 같이, 모든 TH-발현 세포는 TUJ1 발현 세포에 잔류 및 TH-발현 세포는 모두 세포의 적어도 절반을 나타낸다. (B). H9의 인간 배아 줄기는 또한 세포가 면역 염색의 대상이었다 다음 다른 이십오일 (완전히 오십일)과 차별화했다. 결과는 TH를 발현하는 세포 번째의 높은 비율이 있다는 것을 보여 주었다그 D25에서. 그들 중 대부분은 Calbindin 마이너스 동안 거의 모든 TH-발현 세포의 또한 PD에 손실 셀 타입 생성 된 DA 뉴런의 A9 하위 유형 ID를 나타내는, GIRK2을 표현한다. 차별화의 D25에서 세포 면역 염색 (C)는이 GFAP을 표현에는 세포 없으며, 거의 세포가 GABA를 표현 것으로 나타났다. 스케일 바, 200 μm의.
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Discussion
(인간 배아 줄기 및 hiPSCs 모두 포함) 인간 만능 줄기 세포는 대부분을 생성하기 위해 체외에서 분화 할 수없는 모든 경우, 이전의 연구 (19)에서 설명 된 DA 신경 세포는 우리 몸의 세포 유형. 여기서, 다른 실험실 14,15부터 배아 도파민 뉴런의 발달과 기술 (20)로부터 발행 프로토콜에 기초하여, 우리는 인간 배아 줄기 및 hiPSCs에서 DA 뉴런의 생성을위한 배양 조건을 최적화. 이 프로토콜은 재현, 효율적이고 우리는 성공적으로 H1 및 H9 hESC의 라인과 PD 환자와 영향을받지 컨트롤 모두에서 hiPSC 라인에 여기에 설명이 프로토콜을 적용했습니다.
우리의 프로토콜에서 높은 분화 효율을 얻기 위해 세 가지 주요 단계가 있습니다 : 첫째, 세포 전 감독의 분화에는 차별화 된 hPSC 식민지가 없어야합니다. 세 가지 배엽에 관해서는 자발적 분화에 주로 h에서 볼 수있다PSC 문화, 그것은 하나의 세포로이 hPSCs를 해리하기 전에 이러한 차별화 된 식민지를 제거하는 것이 중요합니다. 이전 보고서를 보여 주었다 둘째, MEF 피더, 해리 hPSCs에서 소모해야하는 MEF 세포자가 재생을 촉진하고 차별화 (21)을 억제 할 수있는 비밀 요인. 이를 위해, 30 분 동안 젤라틴 - 코팅 플레이트 및 hPSC MEF 세포 혼합물을 배양하면 거의 모든 MEF 세포를 제거하기에 충분해야한다. 셋째, 하나의 hPSCs는 분화에 적합한 세포 밀도로 도금한다. 에 세포이지만, 이하 칠일 짧게에서 판의 중심에 박리 세포의 죽음을 초래한다 세포 밀도를 낮추고 셀 밀도, 분화의 주위 D11에서 가장 세포의 죽음으로 이어질 늘리면 에지가 잘 구별한다 (데이터는 미도시). 하나는 모든 세 가지 조건을 관찰하면, 효율적으로 우리 단계적 프로토콜 hPSCs로부터 DA 신경 세포를 얻는 것이 용이하다.
여기에 제시된 프로토콜은 주로 일부 수정과 L. STUDER 및 동료 (14)에 의해 이전의 보고서를 기반으로합니다. 세포가 약 70 %의 합류에 도달하면 세포가 가득 합류 (단일 셀 도금 후 문화의 3 일 이상)에 도달 할 때 자신의 보고서에서 차별화가 시작하면서 먼저, 여기에 차별화, 단일 셀 도금 후 48 시간을 시작했다. 일 (20)가 분화 과정에서 심각한 세포 사멸되기까지 우리의 경험에 의하면, 셀 통로없이 합류 세포의 분화를 시작. 둘째, SAG, HH 통로 (22)에 대한 chlorobenzothiophene 함유 작은 분자 작용제와의 연구에서 고가의 SHH 단백질을 대체합니다. 따라서, 이전에 게시 된 프로토콜에 비해, 여기에 설명이 하나 피더 세포와 신경 장미 독립, 주로 FP 사양의 작은 분자를 기반이다 그것은 따라서 적은 비용과 적은 시간과 노동이 소요됩니다. 물론, 리이 프로토콜은 mitation 분화의 제 일 KSR의 사용이다. KSR은 분화 효율에 영향을 미칠 수있는 많은에 많이 다릅니다. 따라서, 하나는 분화 11 일 후에 FP 전구체를 유도에 가장 적합한 하나를 얻기 위해 KSR의 다른 배치를 테스트해야합니다.
요약하면, 여기 descried 분화 프로토콜을 촉진한다 : 인간 배아 줄기 세포 또는 PD에 대한 대체 요법에 대한 정상인의 hiPSCs에서 DA 뉴런 (1) 생성; (2) 시험 관내 및 PD 모델링을위한 잠재적 인 치료제를 시험하기위한 PD 환자 iPSCs에서 DA 뉴런의 생성; (3) 유전자의 연구 / 인간 DA 신경 발달을 조절하는 신호 전달 경로.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
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