Introduction
多巴胺（DA）神经元可以在几个脑区域，包括脑，下丘脑，视网膜，和嗅球中找到。在A9多巴胺神经元在黑质致密部（黑质）控制由突出到前脑，纹状体和形成锥体外运动系统的行为和动作。 A9多巴胺神经元变性导致帕金森氏病（PD），这是第二个最常见的人类神经变性疾病，目前无法治愈的。细胞替代疗法是最有前途的策略为PD 1的处理中的一个，因此，出现了在由人多能干细胞（hPSCs）导出A9多巴胺神经元的极大兴趣，包括人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和最近的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）。
许多研究都试图通过各种方法hPSCs得到A9的多巴胺神经元。通过神经网络的最早报道都产生多巴胺的神经元莲座祖阶段。通过合作，培养与MS5 2或3-5尼龙6间质细胞有或没有外部生长因子2-4周，L的Studer和同事成功地诱导人类胚胎干细胞产生神经花环其他三个组。然后，他们丰富了这些玫瑰花机械清扫或酶消化进一步分化。在其他报告中，研究人员通过生成的胚体悬浮培养分化6-9神经花环（EB）。后来，研究人员建立了基于单层分化方法10,11，在那里它们镀人类胚胎干细胞和人iPS细胞的细胞外基质，添加于不同生长因子的培养以诱导hPSCs分化为多巴胺神经元，其模拟了体内胚胎DA神经元的发展。虽然所有这些研究中得到的酪氨酸羟化酶（TH）表达细胞与多巴胺神经元的某些特征，整个分化过程中的时间和劳动消耗，通常效率低，而且更重要的是，这些神经元的A9身份，除了一个与LMX1a异位表达12多数研究都没有表现出来。最近，一种新的地板板（FP）的协议被开发13-16，其中，首先由活化的音猬和经典Wnt信号转导途径的过程中分化的早期阶段产生的FP的前体与多巴胺神经元的电势，然后这些计划生育细胞进一步指明DA能神经元。虽然这个协议是更有效的，但仍存在一些问题;例如，在整个分化过程需要很长的时间（至少35天），是饲养细胞依赖的15，或者是EB依赖性16或A9身份没有被证实14。
在此基础上，从体内胚胎多巴胺神经元发育等研究人员公布业绩的知识，我们优化培养条件为EFFicient代来自人类胚胎干细胞和iPS细胞多巴胺神经元。我们首先生成的FP的前体细胞通过激活Wnt信号传导的小分子CHIR99021和音猬蛋白与小分子SAG和嘌吗啡胺的信令。这些计划生育细胞表达FOXA2，LMX1a，CORIN，OTX2和巢。然后，我们指定了这些计划生育细胞对多巴胺神经元的生长因子，包括BDNF，GDNF 等 。生成的多巴胺神经元的A9细胞类型，因为它们是阳性GIRK2而负钙结合蛋白17。该协议是饲养细胞和EB独立，高效和可重复性。通过此协议，一个也可以，或者从PD患者的体外模型的PD或测试潜在的治疗药物为PD iPS细胞在不到4周的胚胎干细胞或正常人的细胞移植研究iPS细胞获得多巴胺神经元。
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Protocol
1，准备文化传媒
- 通过结合下面的制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）介质：445毫升的DMEM 50毫升胎牛血清（FBS）和5ml 100X青霉素/氨苄青霉素贮备液。保持过滤灭菌后的培养基在4℃不超过14天。
- 制备HPSC培养基由下列组成含有血清的385毫升的DMEM / F 12，将100ml敲除血清替代品（KSR），将5ml 100×非必需氨基酸原液，将5ml 100×青霉素/氨苄青霉素贮备液，加入5ml 100倍巯基乙醇储备液和10ng / ml的bFGF。保持过滤灭菌后的培养基在4℃下不超过10天。
- 制备mTeSR1无血清培养基中通过组合下列动作：400毫升mTeSR1基础培养基，加入100ml 5×补充和5ml 100X青霉素/氨苄青霉素贮备液。请媒体在4℃下不超过10天。
- 准备10倍胶原酶储备液：称取0.5克胶原酶力量，用50ml的DMEM / F 12和过滤消毒溶解。请等份和股票它们在-20℃下几个月。
- 制备0.1％的明胶溶液：称取0.5克明胶（由牛的皮肤，类型B）的功率，并与去离子水溶解。保持在室温下放置两周高压釜灭菌的溶液。
- 制备KSR分化培养基中通过组合下列：410毫升的DMEM，75毫升KSR，将5ml 100倍的非必需氨基酸原液，将5ml 100×青霉素/氨苄青霉素贮备液，加入5ml 100X巯基乙醇储备液。保持过滤灭菌后的培养基在4℃下不超过10天。
注：KSR从很多很多，这可能会影响到效率的差异而不同。因此，最好进行测试KSR的几批找到最好的一个用于分化。 - 准备N2分化培养基结合以下98毫升的DMEM，加入1ml 100X补充氮气和1毫升100X青霉素/氨苄西林原液。保持过滤灭菌后的培养基在4°下不超过10天。
- 制备B27分化培养基中通过组合下列动作：480毫升Neurobasal培养基，将10毫升50×B27添加剂，加入5ml 100X Glutamax的储备溶液和5ml 100X青霉素/氨苄青霉素贮备液。保持过滤灭菌后的培养基在4℃下不超过10天。
在MEF饲养细胞的人类胚胎干细胞和iPS细胞的培养2。
该H9人类胚胎干细胞是从WiCell研究所获得，iPS细胞建立了通过山的逆转录病毒介导的转导Reijo佩拉实验室因子OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-MYC 18。
- 至少一天前孔通道，通过加入1ml 0.1％明胶为1井的6孔板中制备一些明胶板，孵育板在37℃下进行至少30分钟。
- 温育后，从板抽吸明胶，和种子后照射在1.6×10 5个细胞的密度灭活的MEF细胞上的板/孔在MEF中使用血球计数细胞。
注：细胞传代之前，早在3天可选准备MEF饲养。 - 传代细胞1天电镀MEF饲养后：从hPSCs吸出培养基，加入1毫克/毫升胶原酶细胞以1ml /孔，孵育细胞在37℃1小时。
- 在此孵育后，用PBS洗一次MEF饲养，然后以1.5毫升/加温热（37℃）含血清HPSC培养基良好。
- 1小时后，挖掘培养板几次，使大部分的未分化克隆将分离的板块，而差异化的殖民地保持连接。仔细收集漂浮的殖民地，并把它们转移到15ml试管中。
- 轻轻地用温水（37℃）的DMEM / F 12洗板一次和转移的DMEM / F12到相同的15ml试管中。
- 离心管中，在179×g离心3分钟。
- 从管，小心不要打扰颗粒吸出培养基。添加战争米HPSC培养基，吸取细胞上下数次打破成小群，并混合均匀。
- 将细胞转移到新的MEF饲养在1：3-1：6的比率。
- 每天与通路改变培养基中的细胞，每5-6天。
3，制备细胞分化
- 至少一天的准备细胞之前，准备一些基质胶板（通常为3孔6孔钢板）。稀释的Matrigel用冷的（4℃）的DMEM / F 12在1:40，添加的6孔板1毫升基底膜每孔。孵化基质胶板在4℃下过夜。注意：一个可以密封基底膜板用封口膜和股票他们在4℃下，只要一个星期。
- 使用细胞（参见步骤2）通过后4天。取下所有板块分化的殖民地。从培养板吸去培养基1毫升的Accutase每加好，并孵育细胞，在37℃下加热5分钟。
- 在培育期间，准备一些凝胶ATIN板加入1 ml明胶为1井的6孔板中。将这些板块在准备孵化前一天基质胶板材。
- 之后的5分钟的孵育或当细胞已成为半浮动，吸管细胞上下数次，使它们成单个细胞。
- 收集单细胞在15ml管中，离心分离机，在258×g离心3分钟。
- 重悬细胞与含血清HPSC培养基的适当量，并Thiazovivin添加到2μM的最终浓度。
- 转移细胞到明胶包被的板按1：1的比例，并孵育细胞，在37℃下进行30分钟以除去MEF饲养。
- 将细胞转移到15 mL锥形管中，加入含HPSC中相应的血清，细胞计数与血球。
- 离心将细胞在258×g离心3分钟。
- 在离心分离机，加Thiazovivin到合适mTeSR1中做出2μm的浓度。
- 经过离心机，spirate培养基并用Thiazovivin添加适当mTeSR1介质，以便有1.8×10 5个细胞/ ml培养基。
- 取出基质胶板从培养箱中，吸出基质胶中加入2毫升上述混合细胞到1井的6孔板中。
注：细胞密度应为3.6×10 4个细胞/表面积厘米2。 - 返回板返回孵化器，并让细胞附着24小时。
- 电镀细胞24小时后，吸旧培养基并且每孔加入2ml新mTeSR1培养基，并让细胞生长另外24小时，在开始分化前。
细胞分化
- replating细胞基底膜上板后开始分化48小时。
- 从平板上吸出培养基，用PBS洗一次细胞，并加入每孔下面的分化培养基中以2ml：KSR分化培养基中添加了10μMSB431542和100nM的LDN-193这一天，分化D0 189马克。
- 每天从D0改变介质D20。
注：可制备中使用不超过2天以上的时间。 - 使用下面的培养基为D1和D2：添加了10μMSB431542，100nM的LDN-193189，0.25μM的凹陷，2μM的嘌吗啡胺和50毫微克/毫升FGF8b KSR分化培养基中。
- 使用下面的培养基为D3和D4：添加了10μMSB431542，100nM的LDN-193189，0.25μM的凹陷，2μM的嘌吗啡胺，50毫微克/毫升FGF8b，和3μMCHIR99021 KSR分化培养基中。
- 用于D5和D6以下介质：75％KSR分化培养基中加25％的N 2的分化培养基中添加100nM的LDN-193189，0.25μM的凹陷，2μM的嘌吗啡胺，50毫微克/毫升FGF8b，和3μMCHIR99021。
- 使用的D7和D8以下介质：50％KSR分化培养基加上50％的氮气分化培养基中添加100纳米LDN-193189和3微米CHIR99021。
- 使用以下介质D9和D10：补充100纳米LDN-193189和3微米CHIR99021 25％KSR分化培养基加上75％的氮气分化培养基。
- 使用下面的培养基为D11和D12：补充有3μMCHIR99021，10毫微克/毫升的BDNF，10毫微克/毫升的GDNF，1毫微克/毫升TGF3，0.2 mM的抗坏血酸和0.1mM腺苷B27分化培养基中。
- 使用下面的培养基中分化的其余部分：B27分化培养基补充有10纳克/毫升的BDNF，10毫微克/毫升的GDNF，1毫微克/毫升TGF3，0.2 mM的抗坏血酸和0.1mM的cAMP。
- 在大约D16分化，准备一些聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤维连接蛋白片。稀聚-L-鸟氨酸原液用冷的（4℃）PBS中，以15微克/毫升，加入1毫升至1孔的6孔培养板，孵育所述板在37℃下过夜。
- 吸出聚-L-鸟氨酸溶液，洗板3次，用无菌水，然后空气干燥该板。
- 层粘连蛋白稀释溶胶股票ution用冷的（4℃）PBS中，以1微克/毫升，加入1毫升的6孔板一个孔中，并孵育所述板在37℃下过夜。
- 吸出的层粘连蛋白溶液，洗板3次，用无菌水，然后空气干燥该板。
- 稀释纤连蛋白原液用冷的（4℃）PBS中，以2微克/毫升，加入1毫升至1孔的6孔培养板，孵育所述板在37℃下过夜。
- 密封板用封口膜，并将其放置在4℃下长达两个星期。
- 经过20天的分化，replate的细胞在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白的平板上。吸出物的分化培养基，加入1毫升温（37℃）的Accutase 1井的6孔板中，并培养细胞，在37℃下加热5分钟。
- 在培育期间，将聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白板的孵化器。
- 之后的5分钟的孵育或当细胞已成为半浮动，轻轻移液管细胞上下数次使他们成单个细胞。
- 收集的单个细胞在15ml锥形管中，并加入适量的Neurobasal培养基用于细胞计数，这将取决于膨胀变化（11天后分化，细胞可以扩大15-20倍）。计数使用血球细胞。
- 离心将细胞在258×g离心3分钟。吸出上清，重悬细胞与B27的分化培养基中，使细胞浓度为1×10 6个细胞/ ml培养基。
- 从平板上吸出纤连蛋白，用PBS洗两次，然后加入2mL的细胞，以1个孔的6孔板中。
注：细胞密度为replating应为2×10 5个细胞/表面积厘米2。 - 改变中24小时后，以消除任何独立的死细胞。
- 改变培养基每隔一天，直到对于给定的实验所需要的时间点。
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Representative Results
该分化方案的概要示于图1。这里给出的分化方案的效率依赖于起始细胞的状态。因此，重要的是要确保，第一个删除所有分化集落解离hPSCs成单个细胞的分化之前，第二，1耗尽大部分，如果不是全部，在MEF饲养细胞在明胶包被的平板孵育细胞30分钟后，和第三，1板的HPSC单个细胞在适当的密度到基质胶盘。如示于图2中 ，再接种HPSC单个细胞将在分化之前的48小时为簇扩大，形成在所述板约70％汇合。然后分化后，这些细胞达到完全汇合在短至3-4天，并从周围D16-D17开始，这些融合细胞开始，使在板的一些空间，一些轴突/神经突可能已经在这些空间和细胞层下进行观察。而再接种20日龄后，分化的细胞附着和生长的小团块。然后，在接下来的5天，更密集，形态完好的轴突/神经突起的团块出来，轴突/从不同的团块突起形成一些连接。在长期的文化，在一丛的神经元产生更多的扩展功能，获得更成熟，并与邻近神经细胞团块更多的连接。
11天后分化，hPSCs可以有效地转化成FP的前体，并作为图3所示，几乎所有的细胞表达的FP的前体细胞标志物巢蛋白和FOXA2，并将细胞在90％以上表示另一三个标记CORIN，OTX2和LMX1a。然后后分化的多天里，在FP的前体细胞被指定为多巴胺神经元，因为它们表达TUJ1和TH（ 图4A）。这些多巴胺神经元是A9的身份，因为他们EXPRESŠGIRK2同时为负的钙结合蛋白（ 图4B）。免疫荧光实验还表明，没有GFAP +胶质细胞和很少GABA能神经元（ 图4C），表明分化专门向DA神经元谱系指定。
图1概述了分化方案，用生长因子/小分子和用于每一天的培养基。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2形态在分化期间人的变化。如所述的H9胚胎干细胞铺板为单细胞在适当的细胞密度，此后48小时，这些细胞中的板达到约70％汇合的菌落（D0）。在分化的第几天，这些细胞迅速扩大，分化24小时（D）后达到90％汇合，再经过48多个小时（D3），成为融合。然而，大多数这些细胞仍表现出典型的胚胎干细胞形态和高细胞核向细胞质比（D3）。随着分化的推移，细胞扩展更多的逐渐丧失人类胚胎干细胞的形态。在分化的D11的一端，有在该板的许多份以上的电池层，如由细胞在某些方面比其它（D11）较暗的颜色。大约D17到D20开始，部分细胞死亡，留下一些空间的板块，以及一些神经元的预测已经可以在这些空间被观察到第二有时细胞层（D20）下。细胞replating在D20，使更多的空间用于细胞生长和分化结束后，细胞聚集为小群，多了很多轴突/轴突从这些集群的出现，和轴突/从不同的集群突起形成短一些连接4-5天（D25）。比例尺，200微米。
图3：免疫染色为FP标志物的差异。H9胚胎干细胞的早期阶段分化为使用此处描述的协议11天。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，透化和曲拉通X-100，阻断与驴血清，然后染色以FP前体细胞标志物。如这里所示，几乎所有的细胞表达FOXA2和巢蛋白，并且所述细胞的90％以上的表达LMX1a，CORIN，并OTX2，表示由hESCs到FP单元非常高的效率转换。比例尺，200微米。
图4为免疫染色的DA神经元标志物在分化后期 。 （ 一）H9人类胚胎干细胞分化为25天，而细胞受到免疫染色泛神经元标记TUJ1和常用的DA神经元标志位。如这里所示的，虽然有更多TUJ1阳性细胞比TH阳性细胞，所有的TH-表达细胞残留在TUJ1表达细胞，以及TH-表达细胞代表至少一半的所有单元格。 （B）。该H9人类胚胎干细胞进一步分化为另外25天数（共50天），然后细胞受到免疫。结果表明，存在的TH-表达细胞的次高百分比一，在D25。几乎所有这些TH-表达细胞也表达GIRK2而其中大部分是负的钙结合蛋白，表明所生成的多巴胺神经元的A9亚型的身份，这是失去了在PD的细胞类型。 （c）在分化D25免疫染色的细胞显示没有细胞表达GFAP，只有极少数细胞表达GABA的影响。比例尺，200微米。
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Discussion
人多能干细胞（包括胚胎干细胞和人iPS细胞）可以在体外分化而产生大部分，如果不是全部，我们的身体，包括多巴胺神经元，这已被证明在以前的研究中19的细胞类型。这里，基于从胚胎多巴胺能神经元的发展20知识和公布的协议从其他实验室14,15，我们优化了培养条件对从胚胎干细胞和iPS细胞多巴胺神经元的产生。这个协议是有效的，可重复的，我们已经成功地应用在这里描述的H1和H9 hESC细胞系，并从PD患者和未受影响的同时控制hiPSC线这个协议。
在我们的协议中，有三个主要步骤，以获得高的分化效率：首先，应该在单元之前定向分化没有区别HPSC菌落。作为自发分化为所有三种胚层通常被h中PSC培养，离解这些hPSCs成单个细胞之前去除这些分化的集落是很重要的。其次，MEF饲养应该从游离hPSCs被耗尽，因为以前的报告显示，MEF细胞促进自我更新和分化抑制21能分泌因素。为了这个目的，培养于明胶包被的板进行30分钟的HPSC和MEF细胞的混合物应足够以除去几乎所有的MEF细胞。第三，在单一hPSCs应在适当的细胞密度为分化被镀件。增加细胞密度将导致大多数细胞死亡在周围D11分化的，同时降低了细胞密度将导致脱离细胞的死亡，在板的短不少于7天的中心，虽然细胞上边缘将分化良好（数据未示出）。如果一个人观察所有这三个标准，它很容易从hPSCs与我们逐步协议有效地获得多巴胺神经元。
这里介绍的协议主要是基于由L.的Studer和他的同事14的一些修改以前的报告。首先，此处的分化开始单细胞铺板后48小时时，细胞达到大约只有70％汇合，而在他们的报告中，分化细胞时达到完全汇合（后单细胞电镀3天或更多天培养的）开始。根据我们的经验，开始从融合细胞分化无细胞传代至20天会导致严重的细胞死亡过程中的分化过程。第二，我们代替昂贵的SHH蛋白质在与凹陷含chlorobenzothiophene小分子激动剂Hh通路22的研究。因此，与先前公布的方案相比，这一次在这里描述的是饲养细胞和神经花环独立的，主要基于小分子的计划生育规范;它因此是较便宜和较少的时间和劳动消耗。当然，李该协议的mitation是利用KSR的分化的第一个工作日。 KSR从很多变化到很多，这可能会影响分化效率。因此，人们应该测试KSR不同批次，以获得一个诱导计划生育前体后第11天的分化效果最好。
总之，这里descried该分化方案应促进：从人类胚胎干细胞或正常人用于帕金森病的细胞替代疗法的人iPS细胞多巴胺神经元（1）的产生; （2）产生从PD患者的iPSC多巴胺神经元在体外的建模和测试潜在的治疗药物为PD; （3）基因的研究/信号转导通路调节人体多巴胺神经元的发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
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