Introduction
Dopaminerge (DA) nevroner kan bli funnet i flere områder av hjernen, inkludert midthjernen, hypothalamus, netthinnen, og olfactory pærer. A9 DA nevroner i substantia nigra pars comp (SNpc) kontroll atferd og bevegelse ved å projisere til striatum i brain og danner ekstrapyramidale motoriske system. Degenerasjon av A9 DA nevroner fører til Parkinsons sykdom (PD), som er den nest vanligste menneskelige nevrodegenerativ lidelse og for tiden uhelbredelig. Cell erstatningsterapi er en av de mest lovende strategi for behandling av PD-1, og derfor har det vært stor interesse for å utlede A9 DA nevroner fra humane pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert både humane embryonale stamceller (hESCs) og den siste menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs).
Mye forskning har forsøkt å utlede A9 DA nevroner fra hPSCs ved hjelp av ulike metoder. De tidligste rapportene alle genererte DA nevroner gjennom en neuralrosett stamfar scenen. Ved co-dyrking med MS5 2 eller PA6 3-5 stromale celler med eller uten eksterne vekstfaktorer for 2-4 uker, L. Studer og kolleger og tre andre grupper vellykket indusert hESCs å produsere nevrale rosetter. De deretter beriket disse rosetter ved mekanisk disseksjon eller enzymatisk fordøyelse for ytterligere differensiering. I andre rapporter, genererte forskere nevrale rosetter gjennom embryoid kroppen (EB) flytende kultur differensiering 6-9. Senere etablerte forskere en monolayer basert differensiering metode 10,11, hvor de belagt hESCs og hiPSCs på ekstracellulære matrise, lagt ulike vekstfaktorer i kulturen å indusere differensiering av hPSCs til DA nevroner, som etterligner in vivo embryonale DA neuron utvikling . Selv om alle disse studiene erholdt tyrosin hydroksylase (TH) -expressing celler med noen karakteristikker av DA nevroner, er hele differensieringsprosessen tid og arbeidskrevende,generelt ineffektiv, og enda viktigere, A9 identiteten til disse nevronene ble ikke påvist i de fleste studier bortsett fra den ene med LMX1a ektopisk uttrykk 12. Nylig ble en ny gulvplate (FP)-basert protokoll utviklet 13-16, hvor FP-forløpere med DA neuron potensial ble først generert ved aktivering av den soniske hedgehog og kanoniske Wnt signalveier under de tidlige trinn av differensiering og deretter disse FP celler ble ytterligere spesifisert til DA nevroner. Selv om denne protokollen er mer effektiv, er det fortsatt noen problemer; For eksempel tar det hele differensieringsprosessen lang tid (minst 35 dager) og i matecelleavhengig 15, eller er avhengig av EB 16 eller A9 identitet ble ikke påvist 14.
Her, basert på kunnskap fra in vivo embryonale DA neuron utvikling og andre forskeres publiserte resultater, har vi optimalisert forholdene kultur for efficient generasjon av DA nevroner fra begge hESCs og hiPSCs. Vi først generert FP forløper celler ved aktivering av den kanoniske Wnt signal med lite molekyl CHIR99021 og sonisk pinnsvin signaliserer med små molekyler SAG og purmorphamine. Disse FP celler uttrykker FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 og NESTIN. Vi deretter spesifisert disse FP cellene til DA nevroner med vekstfaktorer inkludert BDNF, GDNF, etc. De genererte DA nevroner er av A9 celletype som de er positive for GIRK2 mens negativ for Calbindin 17. Denne protokollen er mater celle eller EB uavhengig, svært effektiv og reproduserbar. Ved hjelp av denne protokollen, kan man utlede DA nevroner i mindre enn 4 uker fra hESCs eller hiPSCs av normale personer for celletransplantasjon studie, eller fra hiPSCs av PD pasienter for in vitro modellering av PD eller testing potensielle terapeutiske midler for PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Culture Media
- Forbered museembryo fibroblast (MEF) medium ved å kombinere følgende: 445 ml DMEM, 50 ml føtalt bovint serum (FBS) og 5 ml 100 x penicillin / ampicillin stamløsning. Hold filtersterilisert medium ved 4 ° C i ikke mer enn 14 dager.
- Forbered serum-inneholdende hPSC kulturmediet ved å kombinere følgende: 385 ml DMEM / F12, 100 ml knockout serum erstatning (KSR), 5 ml 100 x ikke-essensiell aminosyre stamløsning, 5 ml 100 x penicillin / ampicillin stamløsning, 5 ml 100x -mercaptoethanol stamløsning, og 10 ng / ml bFGF. Hold filtersterilisert medium ved 4 ° C i ikke mer enn 10 dager.
- Forbered mTeSR1 serumfritt medium ved å kombinere følgende: 400 ml mTeSR1 basalmedium, 100 ml 5x supplement, og 5 ml 100 x penicillin / ampicillin stamløsning. Hold medium ved 4 ° C i ikke mer enn 10 dager.
- Forbered 10x kollagenase IV stamløsning: veie 0,5 g kollagenase IV makt, ogoppløse den med 50 ml DMEM / F12 og filter sterilisere. Gjør porsjoner og lager dem ved -20 ° C i månedsvis.
- Forbered 0,1% gelatin løsning: veie 0,5 g gelatin (fra storfe hud, type B) makt og oppløse den med ionisert vann. Hold autoklav sterilisert oppløsning ved romtemperatur i flere uker.
- Forbered KSR differensiering medium ved å kombinere følgende: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x ikke-essensiell aminosyre stamløsning, 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamløsning, 5 ml 100X -mercaptoethanol stamløsning. Hold filtersterilisert medium ved 4 ° C i ikke mer enn 10 dager.
MERK: KSR varierer fra parti til parti, noe som kan påvirke differensiering effektivitet. Det er derfor bedre å teste flere grupper av KSR å finne den beste for differensiering. - Forbered N2 differensiering medium ved å kombinere følgende: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 supplement og en ml 100x penicillin / ampicillin stamløsning. Hold filter sterilisert medium ved 4° C for ikke mer enn 10 dager.
- Forbered B27 differensiering medium ved å kombinere følgende: 480 ml Neurobasal medium, 10 ml 50x B27 supplement, 5 ml 100X glutamax stamløsning, og 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamløsning. Hold filtersterilisert medium ved 4 ° C i ikke mer enn 10 dager.
2. Culture of hESCs og hiPSCs på MEF mateceller
H9 hESCs ble innhentet fra WiCell Research Institute og hiPSCs ble etablert i Reijo Pera laboratoriet gjennom retrovirus-mediert transduksjon av Yamanaka faktorer Okt3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC 18.
- Minst én dag før cellepassasje, forberede noen gelatinplater ved tilsetning av 1 ml 0,1% gelatin til en brønn av seks-brønners plater, og platene inkuberes ved 37 ° C i minst 30 min.
- Etter inkubering aspireres gelatin fra platene, og frø bestråling inaktivert MEF-celler på platene med en tetthet på 1,6 x 10 5 celler/ Brønn i MEF medium ved hjelp av et hemocytometer for å telle cellene.
MERK: Du kan forberede MEF matere så tidlig som 3 dager før celle passasje. - Passage cellene én dag etter plating MEF forer: aspirere mediet fra hPSCs, tilsett 1 mg / ml collagenase IV til cellene ved 1 ml / brønn, og cellene inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Under denne inkubasjon vaskes MEF forer en gang med PBS, og deretter legge til varm (37 ° C) i serum-inneholdende hPSC kulturmedium med 1,5 ml / brønn.
- Etter 1 time, trykk på kultur plate et par ganger slik at de fleste av de udifferensierte kolonier vil løsne fra platene, mens de differensierte kolonier fortsatt festet. Samle forsiktig flytende kolonier, og overføre dem til 15 ml tube.
- Forsiktig vaske platen en gang med varmt (37 ° C) DMEM / F12 og overføre DMEM / F12 inn i den samme 15 ml tube.
- Sentrifuger rørene ved 179 xg i 3 min.
- Aspirer medium fra rørene, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten. Legg krigm hPSC kulturmedium, cellene pipettere opp og ned flere ganger for å bryte dem opp i små klaser og blander dem godt.
- Overfør cellene til nye MEF matere på 1: 3-1: 6 ratio.
- Endre medium hver dag og passasje cellene hver 5-6 dager.
3. Utarbeidelse av celler for Differensiering
- Minst én dag før tilberedning av celler, forberede noen Matrigel platene (typisk tre brønner i en 6-brønn plate). Fortynn Matrigel med kald (4 ° C) DMEM / F12 på 01:40 og tilsett 1 ml Matrigel per brønn av seks-brønners plater. Inkuber Matrigel platene ved 4 ° C over natten. MERK: Man kan forsegle matrigel plater med Parafilm og lager dem ved 4 ° C så lenge som en uke.
- Bruk celler (se trinn 2) 4 dager etter passasje. Fjern alle de differensierte kolonier fra platene. Aspirer mediet fra kulturplaten, tilsett 1 ml accutase per brønn, og cellene inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
- Under inkubasjon, forberede noen gelAtin platene ved tilsetning av 1 ml gelatin til en brønn av seks-brønners plater. Plasser disse platene og matrigel-platene forberedt en dag før i kuvøse.
- Etter 5-min inkubasjon eller når cellene har blitt semi-flytende, til pipetter celler opp og ned flere ganger gjøre dem til enkeltceller.
- Samle enkeltceller inn i 15 ml sentrifuge-rør, og ved 258 x g i 3 min.
- Resuspender cellene med passende mengde serum som inneholder hPSC kulturmedium, og legge Thiazovivin til den endelige konsentrasjon på 2 uM.
- Overfør cellene bort på gelatin-belagte plater ved forholdet 1: 1, og inkuberes cellene ved 37 ° C i 30 min for å fjerne MEF matere.
- Overfør cellene til en 15 ml konisk rør, tilsett passende serum inneholdende hPSC medium og tell cellene med et hemocytometer.
- Sentrifuger cellene ved 258 x g i 3 min.
- Under sentrifuge, tilsett Thiazovivin til passende mTeSR1 medium for å lage en konsentrasjon på 2 uM.
- Etter sentrifuge, etspirate medium og tilsett hensiktsmessig mTeSR1 medium med Thiazovivin, slik at det er 1,8 x 10 5 celler / ml medium.
- Ta ut Matrigel platene fra inkubatoren, suge Matrigel og tilsett 2 ml av de blandede celler inn 1 brønnen av de 6-brønns plater.
MERK: Celletettheten bør være 3,6 x 10 4 celler / cm 2 av overflateareal. - Returnere platene tilbake til inkubatoren, og la cellene feste i 24 timer.
- 24 timer etter plating cellene, aspirer gamle medium og tilsett 2 ml ny mTeSR1 medium per brønn og la cellene vokse for en annen 24 timer før du starter differensiering.
Celledifferensiering
- Begynn differensiering 48 timer etter replating cellene på matrigel plater.
- Aspirer kulturmedium fra platen, vaskes cellene en gang med PBS, og tilsett 2 ml av følgende differensieringsmedium per brønn: KSR differensieringsmedium supplert med 10 uM SB431542 og 100 nM LDN-193189. Marker denne dagen som D0 av differensiering.
- Endre medium hver dag fra D0 til D20.
MERK: Man kan forberede medium for bruk ikke mer enn to dager om gangen. - Bruk følgende medium for D1 og D2: KSR differensiering medium supplert med 10 mikrometer SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 mikrometer SAG, 2 mikrometer purmorphamine, og 50 ng / ml FGF8b.
- Bruk følgende medium for D3 og D4: KSR differensieringsmedium supplert med 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0.25 uM SAG, 2 pM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, og 3 mikroM CHIR99021.
- Bruk følgende medium for D5 og D6: 75% KSR differensieringsmedium pluss 25% N2 differensiering medium supplert med 100 nM LDN-193189, 0.25 uM SAG, 2 pM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, og 3 uM CHIR99021.
- Bruk følgende medium for D7 og D8: 50% KSR differensiering medium pluss 50% N2 differensiering medium supplert med 100 nM LDN-193189 og 3 mikrometer CHIR99021.
- Bruk følgende medium for D9 og D10: 25% KSR differensiering medium pluss 75% N2 differensiering medium supplert med 100 nM LDN-193189 og 3 mikrometer CHIR99021.
- Bruk følgende medium for D11 og D12: B27 differensiering medium supplert med 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM askorbinsyre og 0,1 mM cAMP.
- Bruk følgende medium for resten av differensiering: B27 differensiering medium supplert med 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM askorbinsyre og 0,1 mM cAMP.
- På om D16 av differensiering, forberede noen Poly-L-ornithine / Laminin / Fibronektin plater. Fortynn Poly-L-ornitin stamløsning med kald (4 ° C) PBS til 15 ug / ml, tilsett 1 ml til en brønn av seks-brønners plater og inkuberes platene ved 37 ° C over natten.
- Aspirer Poly-L-ornitin-løsning, vaskes platene tre ganger med sterilt vann og deretter lufttørke platene.
- Fortynne laminin lager solution med kald (4 ° C) PBS til 1 pg / ml, tilsett 1 ml til én brønn på 6-brønners plater og inkuberes platene ved 37 ° C over natten.
- Aspirer laminin-løsning, vaskes platene tre ganger med sterilt vann og deretter lufttørke platene.
- Fortynn fibronektin stamløsning med kald (4 ° C) PBS til 2 ug / ml, tilsett 1 ml til en brønn av seks-brønners plater og inkuberes platene ved 37 ° C over natten.
- Tetningsplatene med Parafilm og plassere dem ved 4 ° C så lenge som to uker.
- Etter 20 dager med differensiering, replate cellene til poly-L-ornitin / Laminin / fibronectin platene. Aspirer differensiering medium, tilsett 1 ml varm (37 ° C) accutase til en brønn på 6-brønners plater og inkuberes cellene ved 37 ° C i 5 min.
- Under inkuberingen plassere Poly-L-ornitin / Laminin / fibronectin platene i inkubatoren.
- Etter 5-min inkubasjon eller når cellene har blitt semi-flytende, Forsiktig pipette celler opp og ned flere ganger tilgjøre dem til enkeltceller.
- Samle de enkelte celler til 15 ml koniske rør, og tilsett den passende mengde Neurobasal medium for celletelling, som vil variere avhengig av utvidelsen (etter 11 dager med differensiering, kan cellene ekspandere 15-20 ganger). Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuger cellene ved 258 x g i 3 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene med B27 differensieringsmedium, slik at cellekonsentrasjonen er 1 x 10 6 celler / ml medium.
- Aspirer fibronektin fra platene, vaskes to ganger med PBS, og tilsett 2 ml celler til en brønn av seks-brønners plater.
MERK: celletetthet for replating skal være 2 x 10 5 celler / cm 2 av overflateareal. - Endre medium 24 timer senere for å fjerne eventuelle fristilt døde celler.
- Endre medium annenhver dag frem til de ønskede tidspunkter for et gitt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over differensierings protokollen er vist i figur 1. Effektiviteten av differensiering protokoll er presentert her er avhengig av status for startceller. Derfor er det viktig å sørge for at, først en fjerner alle de differensierte kolonier før dissociating hPSCs i enkeltceller for differensiering, og andre, tapper en de fleste, om ikke alle, de MEF mateceller ved å inkubere cellene på gelatin-belagte plater i 30 min, og for det tredje en plates de hPSC enkeltceller ved passende densitet på Matrigel plate. Som illustrert i figur 2, replated hPSC enkeltceller vil ekspandere som klynger i løpet av 48 timer før differensiering, danner rundt 70% sammenløp i platene. Så etter differensiering, disse cellene nå full samløpet på så kort som 3-4 dager, og starter fra rundt D16-D17, disse konfluente celler begynner å gjøre noen mellomrom i platene, og noen axoner / neurites kunne alleredeholdes i disse mellomrom og under cellelagene. Etter å ha blitt replated på D20, de differensierte cellene festet og vokste som små klumper. Så i løpet av de neste 5 dagene, mye mer intensive og morfologisk intakte axoner / neurites kommer ut fra klumper, og axoner / neurites fra ulike klumper danne noen sammenhenger. Ved langtids kultur, nevroner i en klump generere flere utvidelser, få mer moden og har flere forbindelser med nevroner i nabo klumper.
Etter 11 dager med differensiering, kan hPSCs effektivt konvertert til FP forløpere, og som illustrert i figur 3, nesten alle cellene uttrykker FP forløper cellemarkører NESTIN og FOXA2, og over 90% av cellene uttrykker ytterligere tre markører CORIN, OTX2 , og LMX1a. Så etter flere dager med differensiering, er FP forløper celler spesifisert til DA nevroner som de uttrykker TUJ1 og TH (figur 4A). Disse DA nevroner er av A9 identitet som de Express GIRK2 samtidig er negativ for Calbindin (figur 4B). Immunostaining forsøk viser også at det ikke er noen GFAP + astrocytter og svært få gabaergic nevroner (Figur 4C), som indikerer at differensiering er utelukkende spesifisert mot DA neuron avstamning.
Figur 1. Oversikt over differensiering protokollen, med vekstfaktorer / små molekyler og kultur medium som brukes for hver dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. morfologiskeal endringer i løpet av differensieringen. H9 hESCs ble belagt som enkeltceller i passende celletetthet, som beskrevet, og 48 timer etter at disse cellene nå omtrent 70% sammenløp i platen som kolonier (D0). I løpet av de første få dagene av differensiering, cellene ekspandere raskt, og nådde over 90% etter 24 timer samløpet av differensiering (D1), og deretter bli sammenløpet etter 48 mer hr (D3). Men de fleste av disse cellene fremdeles oppviser typisk hESC morfologi med høy kjernen til cytoplasma-forhold (D3). Som differensiering går på, cellene utvide mer og gradvis mister hESC morfologi. Ved slutten av D11 av differensiering, er det mer enn en cellelagene i mange deler av platen, som vist ved mørkere farge av cellene i noen områder enn de andre (D11). Starter fra om D17 til D20, noen celler døde, etterlot noen områder i platen, og enkelte nevroner anslag kan allerede være observert i disse rommene ennd noen ganger under cellelaget (D20). Etter celle replating ved slutten av D20 til å gjøre flere områder for cellene til å vokse og differensiering, cellene samlet som små klynger, mye mer axoner / neurites ut av disse klynger, og aksoner / neurites fra forskjellige klynger danne noen forbindelser i så kort som 4-5 dager (D25). Scale bar, 200 mikrometer.
Figur 3. Immunostaining for FP markører på tidlig stadium av differensiering. H9 hESCs ble differensiert i 11 dager ved hjelp av protokollen beskrevet her. Celler ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilized med Triton X-100, blokkert med esel serum og deretter farget for FP forløper cellemarkører. Som vist her, nesten alle celler uttrykker FOXA2 og NESTIN, og over 90% av cellene uttrykker LMX1a, CORIN, ogOTX2, som indikerer en svært høy virkningsgrad konvertering fra hESCs til FP celler. Scale bar, 200 mikrometer.
Figur 4. Immunostaining for DA neuron markører på sene stadier av differensiering. (A) H9 hESCs ble differensiert i 25 dager, og cellene ble utsatt for farging for den pan-nevron markør TUJ1 og brukte DA neuron markør TH. Som vist her, selv om det er mer TUJ1 positive celler enn TH positive celler, alle TH-uttrykke celler rester i TUJ1-uttrykke celler, og TH-uttrykke celler representerer minst halvparten av alle cellene. (B). H9 hESCs ble ytterligere differensiert i ytterligere 25 dager (totalt 50 dager) og deretter cellene ble utsatt for farging. Resultatene viste at det ikke er høyere prosentandel av TH-uttrykkende celler then at ved d25. Nesten alle disse Th-celler uttrykker også uttrykke GIRK2 mens de fleste av dem er negative for Calbindin indikerer A9 subtype identiteten av de genererte DA nevroner, som er den celletype som er tapt i PD. (C) farging for celler på D25 for differensiering viste at det ikke er noen celler som uttrykker GFAP, og svært få celler uttrykker GABA. Scale bar, 200 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humant pluripotent stamceller (inkludert både hESCs og hiPSCs) kan differensieres in vitro for å generere de fleste, om ikke alle, celletyper i kroppen vår inkludert DA nevroner, noe som er vist i tidligere studier 19. Her, basert på kunnskap fra embryonale dopaminerge nevroner utvikling 20 og publiserte protokoller fra andre laboratorier 14,15, vi optimalisert forholdene kultur for generering av DA nevroner fra hESCs og hiPSCs. Denne protokollen er effektiv, reproduserbar og vi har med hell brukt denne protokollen beskrevet her til H1 og H9 hESC linjer og til hiPSC linjer fra både PD pasienter og upåvirket kontroller.
I vår protokoll, er det tre viktige skritt for å oppnå den høye differensiering effektivitet: Først, det bør ikke være noen differensierte hPSC kolonier i cellene før rettet differensiering. Som spontan differensiering til alle tre bakterie lag er ofte sett i hPSC kultur, er det viktig å fjerne disse differensierte kolonier før dissosieres disse hPSCs inn i enkeltceller. For det andre bør MEF matere bli tømt fra dissosiert hPSCs, som tidligere rapporter har vist at MEF celler kan hemmelige faktorer som fremmer selvfornyelse og hemmer differensiering 21. For dette formål bør inkubere hPSC og MEF celleblandinger på gelatin-belagte plater i 30 minutter være tilstrekkelig til å fjerne nesten alle MEF-celler. For det tredje, bør de enkelte hPSCs bli belagt ved passende celletetthet for differensiering. Ved å øke celletettheten vil føre til døden av de fleste cellene til rundt D11 av differensiering, samtidig som man reduserer celletettheten vil føre til løsgjøring og død av celler i midten av platen i så kort som mindre enn 7 dager, selv om cellene kanten vil skille godt (data ikke vist). Hvis man tar hensyn til alle disse tre kriteriene, er det lett å effektivt få DA nevroner fra hPSCs med vår trinnvis protokollen.
Protokollen som presenteres her er hovedsakelig basert på en tidligere rapport fra L. Studer og kolleger 14 med noen modifikasjoner. Først ble differensiering her startet 48 timer etter en enkelt celle plating når cellene nå bare ca 70% samløpet, mens i sin rapport, ble differensiering startet da celler nå full samløpet (tre eller flere dager med kultur etter en enkelt celle plating). I vår erfaring, starter differensiering fra konfluente celler uten celle passasje frem til dag 20 fører til alvorlig celledød under differensiering prosessen. Sekund, erstatter vi den dyre SHH protein i sin studie med SAG, en chlorobenzothiophene holdig lite molekyl agonist for HH pathway 22. Derfor, sammenlignet med tidligere publiserte protokoller, dette er beskrevet her er mater celle og nevrale rosett uavhengig, og basert hovedsakelig på små molekyler for FP spesifikasjon; det er således mindre kostbare og mindre tid-og arbeidskrevende. Selvfølgelig, libegrensning, av denne protokollen er bruken av KSR for de første dager med differensiering. KSR varierer fra parti til parti, noe som kan påvirke differensiering effektivitet. Derfor bør man teste ulike grupper av KSR å få den som fungerer best i å indusere FP forløpere etter 11 dager med differensiering.
I sammendraget, bør differensiering protokollen descried her rette for: (1) generering av DA nevroner fra hESCs eller hiPSCs av normale personer for celle erstatning terapi for PD; (2) generering av DA nevroner fra PD pasient iPSCs for in vitro modellering og testing av potensielle terapeutiske legemidler for PD; (3) studiet av genene / signalveier som regulerer human DA neuron utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
