Introduction
ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון 1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs).
מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 2 או PA6 3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל 'Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות 6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול 10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a 12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה 13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי 15, או היא EB תלויה 16 או זהות A9 לא הפגינה 14.
כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו '. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin 17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת תרבות מדיה
- הכן פיברובלסטים עובריים בינוני עכבר (MEF) על ידי שילוב הבא: 445 מ"ל DMEM, פתרון מניות 5 מ"ל 100x פניצילין / אמפיצילין 50 מ"ל סרום שור העובר (FBS), ו. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ14 ימים.
- להכין מדיום תרבות hPSC על ידי שילוב הבא סרום המכיל: 385 מ"ל / F12, 5 מ"ל 100x פתרון פתרון מניות חומצת אמינו, 5 מ"ל 100x פניצילין / מניית אמפיצילין, 5 מ"ל 100x החלפת סרום נוקאאוט 100 מ"ל (KSR), DMEM שאינו חיוני -mercaptoethanol פתרון מניות, ו10 ng / ml bFGF. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
- להכין מדיום סרום ללא mTeSR1 על ידי שילוב הבא: 400 בינוני מ"ל mTeSR1 בסיסי, 100 מ"ל 5x תוספת, ו5 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
- הכן פתרון מניות IV 10x collagenase: לשקול את כוח IV collagenase 0.5 גרם, ולפזר אותו עם 50 מ"ל DMEM / F12 ולעקר מסנן. הפוך aliquots ומלאת אותם ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- הכן 0.1% פתרון ג'לטין: לשקול את 0.5 ג'לטין g (מעור שור, מהסוג B) כוח ולפזר אותו במים ללא יונים. שמור פתרון מעוקר החיטוי בטמפרטורת חדר למשך שבועות.
- להכין מדיום בידול KSR ידי שילוב הבא: 410 מ"ל DMEM, 75 מ"ל KSR, 5 מ"ל 100x פתרון שאינו חיוני מניית חומצת אמינו, 5 מ"ל 100x פניצילין / פתרון מניות אמפיצילין, 5 מ"ל 100X -mercaptoethanol פתרון מניות. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
הערה: KSR משתנה ממגרש למגרש, אשר עשוי להשפיע על יעילות הבידול. לכן זה טוב יותר כדי לבחון כמה קבוצות של KSR למצוא את הטוב ביותר עבור בידול. - להכין מדיום בידול N2 על ידי שילוב הבא: 98 מ"ל DMEM, תוספת 1 מ"ל 100x N2 ו1 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4° C עבור לא יותר מ 10 ימים.
- להכין מדיום בידול B27 על ידי שילוב הבא: בינוני neurobasal 480 מ"ל, 10 מ"ל 50x B27 תוספת, 5 מ"ל 100X GlutaMAX פתרון מניות, ו5 מ"ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים.
2 תרבות של hESCs וhiPSCs על תאי מזין MEF
HESCs H9 התקבל מWiCell מכון המחקר וhiPSCs הוקמו במעבדה Reijo Pera דרך התמרה בתיווך רטרווירוס של יאמאנאקה גורמי OCT3 / 4, Sox2, KLF4, וג-MYC 18.
- לפחות יום אחד לפני מעבר תא, להכין כמה צלחות ג'לטין על ידי הוספת ג'לטין 1 מ"ל 0.1% לגם 1 של 6 גם צלחות, ודגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 30.
- לאחר דגירה, ג'לטין לשאוב מצלחות, וזרע הקרנה מומת תאי MEF לצלחות בצפיפות של 1.6 x 10 5 תאים/ גם במדיום MEF באמצעות hemocytometer לספור את התאים.
הערה: לחלופין להכין מתקני האכלת MEF מוקדם ככל 3 ימים לפני מעבר תא. - תאי מעבר יום אחד לאחר ציפוי ניזונים MEF: בינוני לשאוב מhPSCs, להוסיף 1 מ"ג / IV collagenase מ"ל לתאים במ"ל 1 / טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- במהלך דגירה זה, לשטוף את מתקני האכלת MEF פעם עם PBS, ולאחר מכן להוסיף בינוני חם (37 ° C) המכיל סרום hPSC תרבות ב1.5 מ"ל / טוב.
- אחרי שעה 1, הקש על צלחת התרבות כמה פעמים, כך שרוב המושבות לא עברו התמיינות תנתק מהצלחות, ואילו המושבות מובחנות להישאר מחובר. לאסוף בזהירות את המושבות הצפות, ולהעביר אותם לתוך צינור 15 מ"ל.
- לשטוף בעדינות את הצלחת פעם אחת עם חם (37 ° C) DMEM / F12 ולהעביר DMEM / F12 לתוך צינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגה הצינורות ב179 XG במשך 3 דקות.
- בינוני לשאוב מהצינורות, נזהר שלא להפריע את הכדור. הוספת מלחמהמדיום התרבות מ 'hPSC, פיפטה התאים מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור אותם בצבירים קטנים ומערבבים אותם היטב.
- העבר את התאים על גבי מתקני האכלת MEF חדשים ב1: 3-1: 6 יחס.
- לשנות את המדיום כל יום והמעבר התאים כל 5-6 ימים.
.3 הכנת התאים לדיפרנציאציה
- ביום אחד לפחות לפני ההכנה של תאים, להכין כמה צלחות Matrigel (3 בארות בדרך הכלל של צלחת 6 היטב). לדלל את Matrigel עם קר (4 ° C) DMEM / F12 ב1:40 ולהוסיף 1 מ"ל Matrigel לכל טוב של 6 גם צלחות. דגירה צלחות Matrigel בלילה 4 ° C.. הערה: אפשר לאטום צלחות Matrigel עם Parafilm ומלאה אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל אחד בשבוע.
- להשתמש בתאים (ראה שלב 2) 4 ימים לאחר המעבר. הסר את כל המושבות מובחנות מהצלחות. בינוניים לשאוב מצלחת התרבות, להוסיף 1 מ"ל Accutase לכל טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- במהלך הדגירה, להכין כמה ג'לatin צלחות על ידי הוספת 1 מ"ל ג'לטין ל1 גם של 6 גם צלחות. הנח צלחות אלה וMatrigel-הצלחות שהוכנו יום לפני בחממה.
- לאחר הדגירה של 5 דק ', או כאשר תאים הפכו חצי צף, תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להפוך אותם לתאים בודדים.
- איסוף תאים בודדים לתוך 15 צינורות מ"ל, ו צנטריפוגות ב XG 258 במשך 3 דקות.
- תאי Resuspend עם כמות מתאימה של סרום המכיל מדיום תרבות hPSC, ולהוסיף Thiazovivin לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר.
- העברת תאים לצלחות ג'לטין מצופה ב1: 1, ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר מתקני האכלת MEF.
- להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף סרום מתאים המכיל בינוני hPSC ולספור את התאים עם hemocytometer.
- צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות.
- במהלך צנטריפוגות, להוסיף Thiazovivin לנכס בינוני mTeSR1 לעשות ריכוז של 2 מיקרומטר.
- לאחר צנטריפוגה,spirate הבינוני ומוסיף בינוני mTeSR1 מתאים עם Thiazovivin כך שיש 1.8 x 10 5 תאים / בינוני מ"ל.
- קח את צלחות Matrigel מן החממה, לשאוב Matrigel ולהוסיף 2 מ"ל של התאים המעורבים על גם 1 של 6 גם הצלחות.
הערה: צפיפות התאים צריכה להיות 3.6 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. - החזר את הצלחות בחזרה לחממה, ולתת לתאים לצרף ל24 שעות.
- 24 שעות לאחר ציפוי התאים, לשאוב מדיום ישן ולהוסיף 2 מ"ל בינוני mTeSR1 חדש לכל טוב ולתת תאים לגדול במשך שעה 24 אחרת לפני שמתחיל את הבידול.
התמיינות תאים
- התחל בידול 48 שעות לאחר replating התאים על גבי צלחות Matrigel.
- מדיום התרבות לשאוב מן הצלחת, לשטוף תאי פעם עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום הבידול הבא בכל טוב: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו100 ננומטר LDN-193189. מארק היום הזה כD0 של בידול.
- שנה בינונית בכל יום מD0 לD20.
הערה: אפשר להכין מדיום לשימוש לא יותר מ 2 ימים בכל פעם. - השתמש במדיום הבא לD1 וD2: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, ו50 ng / ml FGF8b.
- השתמש במדיום הבא לD3 וD4: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 CHIR99021 מיקרומטר.
- להשתמש במדיום לD5 וD6 הבא: 75% בינוניים KSR בידול תוספת 25% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, purmorphamine 2 מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 מיקרומטר CHIR99021.
- להשתמש במדיום לD7 וD8 הבא: 50% בינוניים KSR בידול תוספת 50% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189 ו3 מיקרומטר CHIR99021.
- השתמש במדיום הבא לD9 וD10: 25% בינוני בידול KSR תוספת 75% בינוני בידול N2 בתוספת 100 LDN-193,189 ו3 CHIR99021 מיקרומטר ננומטר.
- השתמש במדיום הבא לD11 וD12: בינוני בידול B27 בתוספת 3 מיקרומטר CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ"ל TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ"מ ו0.1 מ"מ cAMP.
- השתמש במדיום הבא לשאר בידול: בינוני בידול B27 בתוספת 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ"ל TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ"מ ו0.1 מ"מ cAMP.
- בסביבות D16 של בידול, להכין כמה / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. לדלל פולי-L-ornithine פתרון מניות עם (4 ° C) הקר PBS ל15 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשאוב את פתרון פולי-L-ornithine, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות.
- לדלל סול מניית lamininution עם קר (4 ° C) PBS עד 1 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל לגם אחד 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשאוב את פתרון laminin, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות.
- לדלל פתרון מניות פיברונקטין עם קר (4 ° C) PBS ל2 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 1 מ"ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- צלחות חותם עם Parafilm ומניח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל שבועיים.
- לאחר 20 ימים של בידול, replate תאים ל/ צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. בינוני בידול לשאוב, להוסיף 1 מ"ל Accutase החם (37 ° C) ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- במהלך הדגירה, למקם את / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine בחממה.
- לאחר הדגירה של 5 דק ', או כאשר תאים הפכו חצי צף, בעדינות תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדילהפוך אותם לתאים בודדים.
- לאסוף את התאים בודדים לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל, ולהוסיף את הכמות המתאימה של מדיום neurobasal לספירת תאים, אשר תשתנה בהתאם להרחבה (לאחר 11 ימים של בידול, תאים עשויים להרחיב 15-20 קיפול). ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. לשאוב supernatant, וresuspend תאים עם מדיום בידול B27, כך שריכוז התא הוא 1 x 10 6 תאים / מ"ל בינוני.
- פיברונקטין לשאוב מהצלחות, לשטוף פעמיים עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל תאים גם 1 של 6 גם צלחות.
הערה: צפיפות התאים לreplating צריכה להיות 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. - שנה בינונית 24 שעות מאוחר יותר כדי להסיר את כל תאים מתים שאינם מחוברים.
- שנה בינונית בכל יום אחר עד נקודות הזמן הרצויות לניסוי נתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה כללית של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 1. היעילות של פרוטוקול הבידול מוצג כאן מסתמכת על מעמדם של התאים מתחילים. לכן, זה קריטי לוודא כי, ראשון מסיר את כל המושבות מובחנות לפני מתנער hPSCs לתוך תאים בודדים לבידול, ושנייה, אחד מכלה את רוב, אם לא כולם, תאים מזינים MEF ידי דוגרים התאים על צלחות מצופים ג'לטין ל30 דקות, ושלישית, אחד לוחות התאים בודדים hPSC בצפיפות המתאימה לצלחת Matrigel. כפי שמודגם באיור 2, replated תאים בודדים hPSC ירחיבו כאשכולות במהלך שעות 48 לפני ההתמיינות, ויוצרים מפגש סביב 70% בצלחות. ואז אחרי הבידול, תאים אלה מגיעים למפגש מלא בקצר ככל 3-4 ימים, ומתחילים מרחבי D16-D17, תאים ומחוברות אלה להתחיל לעשות קצת רווחים בצלחות, וכמה אקסונים / neurites כבר יכלהניתן לצפות במרחבים אלה ותחת שכבות התאים. לאחר שreplated בD20, התאים המובחנים מצורפים וגדלו גושים קטנים כ. לאחר מכן במהלך 5 הימים הבאים, האקסונים הרבה יותר אינטנסיביים ומורפולוגית שלמים / neurites לצאת מהגושים, ואקסונים / neurites מגושים שונים יוצרים כמה חיבורים. במהלך התרבות לטווח ארוך, תאי עצב בגוש אחד ליצור יותר הרחבות, לקבל יותר בוגר ויש להם יותר קשרים עם תאי עצב בגושים הסמוכות.
לאחר 11 ימים של בידול, hPSCs יכול להיות מומר ביעילות למבשרי FP, וכפי שמודגם באיור 3, כמעט כל התאים מבטאים את Nestin וFOXA2 סמני תא מבשר FP, ומעל 90% מהתאים להביע עוד שלושה סמנים קורין, OTX2 , וLMX1a. ואז אחרי עוד יומיים של בידול, תאי מבשר FP מצוינים לתאי עצב DA כפי שהם מביעים Tuj1 וTH (איור 4 א). נוירונים DA אלה של זהות A9 כפי שהם Expresבעוד של GIRK2 הם שליליים עבור Calbindin (איור 4). ניסויי Immunostaining גם להראות שאין GFAP האסטרוציטים + ומעט מאוד נוירונים GABAergic (איור 4C), מצביעים על כך שהבידול מצוין באופן בלעדי כלפי שושלת תא עצב DA.
איור 1 סקירה כללית של פרוטוקול הבידול, עם גורמי גדילה / מולקולות קטנות ובינוני תרבות המשמשת לכל יום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מורפולוגיים 2 איוראל משתנה במהלך התמיינות. hESCs H9 היו מצופה כתאים בודדים בצפיפות התאים המתאימה כפי שתואר, ו48 שעות לאחר ש, תאים אלה מגיעים למפגש% על 70 בצלחת כמושבות (D0). במהלך הימים הראשונים של בידול, התאים להתרחב במהירות, והגיעו למפגש מעל 90% לאחר 24 שעות של בידול (D1), ולאחר מכן הפכו למפגש לאחר 48 שעות נוספות (D3). עם זאת, רובם של תאים אלה עדיין תערוכת מורפולוגיה hESC טיפוסית עם גבוה גרעין ליחס ציטופלסמה (D3). כבידול ממשיך, התאים להרחיב יותר ולאבד את מורפולוגיה hESC בהדרגה. בסופו של D11 של בידול, יש שכבות תאים יותר מפעם אחת בחלקים רבים של הצלחת, כפי שמעידים על ידי צבע כהה יותר של תאים באזורים מסוימים יותר מהאחרים (D11). החל מ על D17 לD20, כמה תאים מתו, והותירו חלק מרווחים בצלחת, וכמה תחזיות נוירון כבר יכולות להיבחן בחללים אלהnd לפעמים מתחת לשכבת התא (D20). לאחר replating התא בסוף D20 כדי להרוויח יותר רווחים לתאים לגדול ובידול, תאים לצבור אשכולות קטנים כ, הרבה יותר אקסונים / neurites לצאת מהצבירים הללו, ואקסונים / neurites מאשכולות שונים יוצרים כמה קשרים בקצרים ככל 4-5 ימים (D25). סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר.
איור Immunostaining .3 לסמני FP בשלב המוקדם של hESCs בידול. H9 הובדל ל11 ימים באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. תאים אז תוקנו עם paraformaldehyde 4%, permeabilized עם טריטון X-100, חסם עם חמור בדם ולאחר מכן מוכתמת עבור סמני תא מבשר FP. כפי שניתן לראות כאן, כמעט כל התאים לבטא FOXA2 וNestin, ומעל 90% מהתאים להביע LMX1a, קורין, וOTX2, המצביע על המרת יעילות גבוהה מאוד מhESCs לתאי FP. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר.
איור Immunostaining .4 לסמני נוירון DA בשלבים מאוחרים של בידול. () HESCs H9 הובדל ל25 ימים, ותאים היו נתונים לimmunostaining לTuj1 סמן הפאן נוירון וTH סמן נוירון הנפוץ DA. כפי שניתן לראות כאן, אם כי יש תאים חיוביים יותר Tuj1 מאשר תאים חיוביים TH, כל תאי TH-להביע שאריות בתאים המבטאים-Tuj1, ותאי TH-להביע מייצגים לפחות מחצית מכל התאים. (B). HESCs H9 הובדל נוסף לעוד 25 ימים (50 לחלוטין ימים) ולאחר מכן תאים היו נתונים לimmunostaining. התוצאות הראו כי יש אחוז גבוה יותר של ה תאי TH-להביעכי בD25. כמעט כל תאים המבטאים-TH אלה גם להביע GIRK2 בעוד רובם שליליים לCalbindin, המציין את זהות A9 תת סוג של תאי עצב DA שנוצר, שהיא הסוג של התאים שאבד בפ"ד. (C) Immunostaining לתאים בD25 של בידול הראה שאין תאים לבטא GFAP, ומעט מאוד תאים להביע GABA. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי גזע pluripotent אדם (כולל שני hESCs וhiPSCs) יכולים להיות מובחנים במבחנה כדי לייצר רוב, אם לא כולם, סוגי תאים של הגוף שלנו, כולל תאי עצב DA, שהודגם במחקרים קודמים 19. כאן, המבוסס על ידע מפיתוח נוירון דופאמין העוברי 20 ופרוטוקולים שפורסמו ממעבדות אחרות 14,15, אנחנו מותאמים תנאי התרבות עבור הדור של תאי עצב DA מhESCs וhiPSCs. פרוטוקול זה הוא יעיל, לשחזור ויש לנו ליישם פרוטוקול זה שתואר כאן לקווי H1 וH9 hESC ולקווי hiPSC משני חולי פרקינסון ובקרות מושפעות בהצלחה.
בפרוטוקול שלנו, יש שלושה שלבים עיקריים כדי להשיג את יעילות בידול הגבוהה: ראשית, לא צריך להיות שום מושבות hPSC מבודלות בהבחנה לפני מופנה תאים. בידול כספונטני לכל שלוש השכבות הנבט נתפס לעתים קרובות בשעותתרבות PSC, זה חשוב להסיר מושבות מובחנות אלה לפני מתנער hPSCs אלה לתוך תאים בודדים. שנית, צריכים להיות ריקות ניזונים MEF מhPSCs ניתק, כמו דיווחים קודמים הראו כי תאי MEF גורמים חשאיים יכול שמקדמים התחדשות עצמית ומעכבים בידול 21. לצורך כך, דוגרים תערובות hPSC ותא MEF על צלחות ג'לטין המצופה ל30 דקות צריכה להיות מספיק כדי להסיר כמעט את כל תאי MEF. שלישית, צריך להיות מצופה hPSCs הבודד בצפיפות התאים המתאימה לבידול. הגדלת צפיפות התאים תביא למותם של רוב התאים בסביבות D11 של בידול, תוך הפחתת צפיפות התאים תביא לניתוק והמוות של תאים במרכז הצלחת בקצר ככל פחות מ -7 ימים, אם כי תאים על הקצה יבדיל היטב (מידע לא מוצג). אם אחד מקיים את כל שלושת הקריטריונים האלה, זה קל להשיג תאי עצב DA ביעילות מhPSCs עם הפרוטוקול בשלבים שלנו.
הפרוטוקול המובא כאן מתבסס בעיקר על דוח קודם על ידי ל 'Studer ועמיתים 14 עם כמה שינויים. ראשית, ההבחנה כאן החלה 48 שעות לאחר ציפוי תא בודד כאשר תאים מגיעים רק כ -70 מפגש%, ואילו בדו"ח שלהם, בידול החל כאשר תאים מגיעים למפגש מלא (3 או יותר ימים של התרבות לאחר תא בודד ציפוי). מניסיוננו, מתחיל התמיינות של תאים ומחוברות ללא מעבר תא עד שהיום 20 מוביל למוות של תאים כבדים במהלך תהליך ההתמיינות. שנית, אנו מחליפים את החלבון שהשש היקר במחקרם עם SAG, אגוניסט מולקולה קטן המכיל chlorobenzothiophene למסלול HH 22. לכן, בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר, זה אחד שתואר כאן הוא תא מזין ושושנה עצבית עצמאי, ומתבסס בעיקר על מולקולות קטנות למפרט FP; זה ובכך פחות יקר ופחות זמן וגוזל עבודה. כמובן, limitation של פרוטוקול זה הוא השימוש בKSR לימים הראשונים של בידול. KSR משתנה ממגרש למגרש, אשר עשוי להשפיע על יעילות הבידול. לכן, יש לבחון את קבוצות שונות של KSR כדי לקבל את זה שעובד הכי טוב בגרימת מבשרי FP לאחר 11 ימים של בידול.
לסיכום, פרוטוקול בידול descried כאן צריך להקל: (1) הדור של תאי עצב DA מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים לטיפול בתחליפי תא לפ"ד; (2) את הדור של תאי עצב DA מiPSCs מטופל פ"ד לדוגמנות במבחנה ובדיקת תרופות טיפוליות פוטנציאליות לפ"ד; (3) המחקר של גנים / מסלולי איתות ויסות התפתחות תא עצב DA אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
