Introduction
Dopaminerjik (DA) nöronlar midbrain, hipotalamus, retina ve bulbuslarında dahil olmak üzere birçok beyin bölgelerinde bulunabilir. Ön beyinde striatum projelendirme ve ekstrapiramidal motor sistemini oluşturarak substantia nigra pars compacta (SNpc) kontrol davranış ve hareket A9 DA nöronlar. A9 DA nöronların dejenerasyonu ikinci en yaygın insan nörodejeneratif bir hastalıktır ve şu anda çaresiz Parkinson hastalığı (PH) yol açar. Hücre replasman tedavisi PH 1 tedavisi için en umut verici stratejilerinden biridir, bu nedenle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve hem de dahil olmak üzere, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) den A9 DA nöronlar kaynaklanan büyük bir ilgi olmuştur Son insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs).
Pek çok araştırma, çeşitli yöntemler kullanarak hPSCs adlı A9 DA nöronları türetmek için çalıştı. Bir sinir yoluyla erken raporlar tüm oluşturulan DA nöronlarırozet ata sahne. Ile birlikte bir ya da 2-4 hafta, L. ve arkadaşları Studer'den ve başarılı bir şekilde sinir rozet üretmek için HESC uyarılan üç grup için dış büyüme faktörleri olmaksızın MS5 2 veya PA6 3-5 stromal hücreleri ile ortak-kültür. Daha sonra mekanik diseksiyon ya da daha fazla farklılaşması için enzimatik sindirim yoluyla bu rozetler zenginleştirilmiş. Diğer raporlarda, araştırmacılar kültür farklılaşmasını 6-9 yüzen embriyoit vücuda sinir rozetler (EB) oluşturulur. Daha sonra, araştırmacılar, ekstra hücresel matriks üzerinde HESC ve hiPSCs kaplama bir tek tabakalı göre ayırt etme yöntemini 10,11, in vivo oluşturulan embriyonik gelişme DA nöron taklit DA nöronlara hPSCs farklılaşmasını indüklemede kültür içinde değişik büyüme faktörleri ilave . Bütün bu çalışmalar, DA nöronlarının bazı özelliklere sahip tirosin hidroksilaz (TH) -expressing hücreleri elde edilmiş olmakla birlikte, bütün farklılaşma süreci, zaman ve iş gücü tüketengenellikle verimsiz ve daha da önemlisi, bu nöronların A9 kimlik LMX1a ektopik ifade 12 ile biri dışında en çalışmalarda gösterilmiştir değildi. Son zamanlarda, yeni bir taban plakası (FP) tabanlı protokol daha sonra DA nöron potansiyeli ile FP öncüleri ilk farklılaşma erken dönemde sonik kirpi ve doğal Wnt sinyal yollarının aktivasyonu tarafından oluşturulan edildiği 13-16, geliştirilen ve oldu Bu FP hücreler daha fazla DA nöronlarının için belirlenmiştir. Bu protokol daha verimli olmasına rağmen, hala bazı sorunlar var; Örneğin, tüm süreç farklılaşma uzun (en az 35 gün) sürer ve bağımlı besleyici hücre 15, ya da EB veya A9 kimliği 14 görülmemiştir 16 bağlıdır.
Burada, in vivo embriyonik DA nöron gelişimi ve diğer araştırmacıların yayınlanan sonuçlarına bilgiye dayalı, biz eff için kültür koşullarını optimizeHESC ve hiPSCs hem DA nöronların icient üretimi. Biz ilk olarak küçük molekül CHIR99021 ve küçük moleküller SAG ve purmorphamine ile sinyalizasyon sonik kirpi ile kanonik Wnt sinyal aktivasyonu ile FP öncül hücreleri üretilir. Bu FP hücreler FOXA2, LMX1a, Corin, OTX2 ve Nestin ifade eder. Biz sonra vb BDNF, GDNF'nin içeren büyüme faktörleri ile DA nöronlarının bu FP hücreleri belirtildi. Bunlar kalbindin 17 için ise negatif GIRK2 pozitif olarak üretilen DA nöronları hücre A9 tiptedir. Bu protokol, yüksek verimli ve yeniden üretilebilir bir besleyici hücre veya EB bağımsız vardır. Bu protokolü kullanarak, bir, ya da in vitro PH modelleme veya PH için potansiyel terapötik ajanların test için PD hastalarının hiPSCs gelen HESC veya hücre nakli çalışma için normal insanların hiPSCs daha az 4 hafta DA nöronları elde edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kültür Medya 1. Hazırlık
- Aşağıdaki birleştirerek fare embriyonik akciğer fibroblast (MEF) orta hazırlayın: 445 mi DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok solüsyonu. En fazla 14 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
- Hazırlama serum ihtiva eden, aşağıdaki birleştirerek hPSC kültür ortamı: 385 ml DMEM / F12 100 mi nakavt serum değiştirme (KSR), 5 mi 100x esansiyel olmayan amino asit stok çözeltisi, 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 5 ml 100x stok çözeltisi p-merkaptoetanol, ve 10 ng / ml bFGF. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
- Aşağıdaki birleştirerek mTeSR1 serumsuz ortam hazırlayın: 400 mi mTeSR1 bazal ortam, 5x 100 mi ek, ve 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de orta tutun.
- 10x kollajenaz IV stok çözeltisi hazırlayın: 0.5 gr kollajenaz IV gücünü tartmak ve50 mi DMEM / F12 ve filtre ile sterilize çözülür. Hacimde yapın ve ay boyunca -20 ° C'de stok onları.
- % 0.1 jelatin solüsyonu hazırlayın: güç (sığır derisi, tip B'den) 0.5 gr jelatin tartılır ve deiyonize su ile çözülür. Hafta boyunca oda sıcaklığında bir otoklav sterilize edilmiş bir çözeltisinin tutun.
- Aşağıdaki birleştirerek KSR farklılaştırma ortamının hazırlanması: 410 ml DMEM, 75 mi KSR, 5 ml stok çözeltisi merkaptoetanol 100 x esansiyel olmayan amino asit stok çözeltisi, 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 5 ml 100x. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
NOT: KSR farklılaşma verimliliğini etkileyebilecek sürü sürü, değişir. Bu farklılaşma için en iyisini bulmak için ksr birkaç toplu test etmek daha iyidir. - Aşağıdaki birleştirerek, N2 farklılaşma ortamı hazırlayın: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 takviyesi ve 1 ml 100x penisilin / ampisilin stok solüsyonu. 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutunEn fazla 10 gün ° C.
- 10 mi 50x B27 takviyesi, 5 ml stok çözeltisi Glutamax 100x, 100x ve 5 ml penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 480 mi, Neuro temelli vasat: Aşağıdaki birleştirerek B27 farklılaştırma ortamı hazırlayın. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
MEF besleyici hücreler HESC ve hiPSCs 2. Kültür
H9 HESC WiCell Research Institute elde edilmiş ve hiPSCs Yamanaka retrovirüs aracılı iletimi yoluyla Reijo Pera laboratuarda kurulmuş faktörleri Zeiss OCT3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc 18.
- En az bir günlük hücre geçmeden önce, 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 mi,% 0.1 jelatin ilave edilerek bir jelatin hazırlık plakası ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Inkübasyon plakalardan aspire jelatin ve tohum sonra ışınlama 1,6 x 10 5 hücre yoğunluğunda plakaları üzerine MEF hücreleri inaktive/ Iyi MEF ortamda hücreleri saymak için Hemasitometre kullanarak.
NOT: İsteğe bağlı olarak erken 3 gün gibi hücre geçiş önce MEF besleyiciler hazırlamak. - Geçiş hücreler MEF besleyiciler kaplama bir gün sonra: hPSCs aspire orta, iyi / 1 ml hücreleri 1 mg / ml kollajenaz IV ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın.
- Bu kuluçka sırasında, bir kez PBS ile yıkayın, MEF besleyiciler, iyice 1,5 ml / sıcak (37 ° C), serum ihtiva eden kültür ortamı hPSC ekleyin.
- Farklılaşmamış kolonilerinin en plakalarından ayırmak böylece farklı koloniler bağlı olarak kaldığı, 1 saat sonra, kültür plakasının bir kaç kez dokunun. Dikkatlice yüzen koloniler toplamak ve 15 ml tüp içine aktarabilirsiniz.
- Yavaşça sıcak (37 ° C) DMEM / F12 ile bir kez, plakayı yıkayın ve aynı 15 ml'lik bir tüp içine DMEM / F12 aktarın.
- 3 dakika boyunca 179 x g'de santrifüje tüpler.
- Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak tüpleri, orta aspire. Savaş Eklem hPSC kültür ortamı, küçük kümeler halinde onları kırmak ve onları karıştırın ve birkaç kez aşağı hücreleri pipetle.
- 1 yeni MEF besleyiciler üzerine hücreleri aktarın: 3-1: 6 oranı.
- Her 5-6 gün her gün ve geçit hücreleri orta değiştirin.
Farklılaşma için Hücrelerin 3. hazırlanması
- Hücre işlemınden önce en az bir gün, bir Matrigel plakaları (6 çukurlu bir levha, tipik olarak 3 kuyu) maddesinin hazırlanması. 1:40, soğuk (4 ° C) DMEM / F12 ile Matrigel seyreltin ve 6 oyuklu plakalar, oyuk başına 1 mi Matrigel ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca Matrıgel inkübe edin. NOT: Bir Parafilm ile Matrıgel plakaları mühür ve sürece bir sürede hafta boyunca 4 ° C'de onları stok olabilir.
- 4 gün geçit sonra hücrelerin (Adım 2) kullanın. Plakalardan tüm farklı koloniler çıkarın. Kültür plakası orta aspire, 5 dakika boyunca 37 ° C'de hücreler 1 mi Accutase başına ekleyin ve inkübe edilir.
- İnkübasyon sırasında, bir jel hazırlamak6-delikli plakalar 1 ml jelatin ile 1 ilave ederek plakaları atin. Bu tabak ve inkübatör bir gün önce hazırlanan Matrigel tabak yerleştirin.
- Hücreler hale geldiğinde yan-yüzer 5 dakikalık inkübasyondan sonra ya da pipet hücreler yukarı ve aşağı birkaç kez tek bir hücre içine bunları yapmak.
- 3 dakika boyunca 258 x g hızında tek bir 15 ml'lik tüplere hücreleri ve santrifüj toplayın.
- Yeniden süspanse hPSC kültür ortamı içeren serum, uygun miktarda hücreleri ve 2 uM nihai konsantrasyona kadar Thiazovivin ekleyin.
- 1 de, jelatin kaplı plakalar üzerine hücreleri aktarın: 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 1 oranında ve MEF hücreleri inkübe besleyiciler kaldırın.
- 15 ml konik tüp hücreleri aktarın, hPSC ortamı içeren uygun serumu ekleyin ve hemositometre ile hücreleri saymak.
- 3 dakika boyunca 258 xg'de hücreleri santrifüj.
- Santrifüj sırasında, 2 uM'lik bir konsantrasyona yapmak için uygun bir ortam için mTeSR1 Thiazovivin ekleyin.
- Santrifüj, a sonraorta spirate ve / ml orta 1,8 x 10 5 hücre vardır, böylece Thiazovivin ile uygun mTeSR1 orta ekleyin.
- , Inkübatör Matrigel plakalarını çıkartın Matrigel aspire ve 6 oyuklu plakaların 1 oyuk üzerine karışık hücre 2 ml ilave ediniz.
Not: Hücre yoğunluğu 3.6 x 10 4 hücre / yüzey alanının cm2 olmalıdır. - Geri inkübatör plakaları dönmek ve hücreler 24 saat takmak edelim.
- 24 saat hücreleri kaplama sonra, eski orta aspire ve kuyu başına 2 ml Yeni mTeSR1 orta ekleyin ve farklılaşmasını başlamadan önce hücreleri bir 24 saat boyunca büyümesine izin.
Hücre Farklılaşma
- Matrıgel plakalar üzerine hücreleri replating sonra farklılaşma 48 saat başlatın.
- Levhasından kültür ortamı aspire, hücreler bir kez PBS ile yıkayın ve oyuk başına aşağıdaki farklılaştırma ortamının 2 ml ekleyin: 10 uM SB431542 ve 100 nM LDN-193 ile takviye KSR farklılaştırma ortamının189. Mark farklılaşma D0 olarak bu gün.
- D20 D0 her gün orta değiştirin.
NOT: Bir seferde 2 günden fazla kullanım için orta hazırlayabilirsiniz. - 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine ve 50 ng / ml ile takviye edilmiş FGF8b KSR farklılaştırma ortamı: D1 ve D2 aşağıdaki ortamı kullanın.
- 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml arasında FGF8b ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş bir ortam KSR farklılaşması: D3 ve D4 aşağıdaki ortamı kullanın.
- 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml arasında FGF8b ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş% 75 KSR farklılaştırma ortamı artı% 25 N2 farklılaştırma ortamının: D5 ve D6 aşağıdaki ortamı kullanın.
- 100 nM LDN-193189 ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş% 50 KSR farklılaştırma ortamı artı% 50 N2 farklılaştırma ortamının: D7 ve D8 aşağıdaki ortamı kullanın.
- 100 nM LDN-193189 ve 3 mcM CHIR99021 ile desteklenmiş% 25 KSR farklılaşma ortamı artı 75% N2 farklılaşması orta: Aşağıdaki D9 için orta ve D10 kullanın.
- 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0.2 mM askorbik asit ve 0.1 mM cAMP ile desteklenmiş B27 farklılaştırma ortamının D11 ve D12 için aşağıdaki ortamı kullanın.
- 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0.2 mM askorbik asit ve 0.1 mM cAMP ile desteklenmiş B27 farklılaştırma ortamının farklılaştırma geri kalanı için aşağıdaki ortamı kullanın.
- Farklılaşma yaklaşık D16, bazı Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin hazırlık plakası. Poli-L-ornitin, soğuk (4 ° C) stok çözeltisi, 15 ug / ml PBS, gece boyunca 37 ° C'de plakaları 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml ilave edilir, ve inkübe seyreltin.
- , Poli-L-ornitin çözüm aspire Plakalar steril su ile 3 kez yıkanır ve bundan sonra da hava plakaları kurutunuz.
- Laminin stok sol sulandırmak1 ug / ml soğuk (4 ° C) ilave edilmiştir Katkı, 6 oyuklu plakaların bir oyuğuna 1 ml ilave edilir ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- , Laminin çözüm aspire Plakalar steril su ile 3 kez yıkanır ve bundan sonra da hava plakaları kurutunuz.
- , 2 ug / ml soğuk (4 ° C) ilave edilmiştir fibronektin stok çözelti seyreltik 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml ilave edilir ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Parafilm ile sızdırmaz plakalar ve sürece iki hafta gibi kısa boyunca 4 ° C 'de koyun.
- Farklılaşma 20 gün sonra, Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin plakalara hücreleri Replate. Aspire farklılaştırma ortamı, 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml sıcak (37 ° C) Accutase ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın.
- İnkübasyon sırasında, kuluçka makinesi içindeki Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin plaka yerleştirin.
- 5 dakikalık inkübasyondan sonra hücreler, ya da hale yukan ve aşağı doğru, birkaç kez pipet yavaşça hücreler yan-yüzertek hücre içine bunları yapmak.
- 15 ml konik tüp içine tek hücreleri toplamak ve genişlemeye bağlı olarak değişecektir hücre sayımı için Neurobasal orta uygun miktarda ekleme, (farklılaşma 11 gün sonra, hücreler 15-20 kat genişletebilir). Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 3 dakika boyunca 258 xg'de hücreleri santrifüj. B27 farklılaşma ortamı ile aspire süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri hücre / ml konsantrasyonlarda ortamı 1 x 10 6 hücre olacak şekilde.
- Plakalardan aspire fibronektin, PBS ile iki kez yıkanır ve 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 2 mi hücreleri ekleyin.
Not: şarjı için hücre yoğunluğu 2 x 10 5 hücre / yüzey alanı cm2 olmalıdır. - Birleşmeyen ölü hücreleri çıkarmak için 24 saat sonra orta değiştirin.
- Belirli bir deney için istenilen zaman noktalarında kadar her gün orta değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklılaşma protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada yer alan farklılaşma protokolünün verimi başlangıç hücrelerin durumuna dayanır. Bu nedenle, ilk ayrıştırma için tek bir hücre içine hPSCs ayrıştırma önce tüm farklı koloniler kaldırır, ve ikinci olarak, bir bütün halinde, MEF besleyici hücreler, jelatin kaplı plakalar üzerinde hücrelerin inkübe edilmesi ile, çoğu tüketir olduğundan emin olmak için önemlidir 30 dakika ve üçüncü, Matrigel plakası üzerine uygun bir yoğunlukta tek plakalar hPSC tek hücre. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tek hücreler hPSC plakalarında yaklaşık% 70 izdiham oluşturan, farklılaşması önce 48 saat boyunca kümeleri olarak genişleyecektir kaplandı. Sonra farklılaşmadan sonra, bu hücreler kısa 3-4 gün gibi tam izdiham ulaşmak ve D16-D17 çevresinde başlayarak, bu birleşen hücreler plakalarında bazı boşluklar yapmak için başlangıç ve bazı aksonlar / nevrotiler zaten olabilirbu alanlarda ve hücre tabakalarının altında görülebilir. D20 yeniden plakalanmış sonra, farklılaşmış hücreler birleştirilmiş ve benzeri gibi küçük kümeleri büyüdü. Sonra önümüzdeki 5 gün boyunca, çok daha yoğun ve morfolojik olarak bozulmamış aksonlar / nevrotiler yığınlarından çıkıp, aksonlar / farklı yığınlarından nevrotiler bazı bağlantıları oluşturur. Uzun süreli kültür sırasında, bir parçada nöronlar, daha uzantıları oluşturmak daha olgun almak ve komşu kümeleri nöronların daha bağlantıları var.
Farklılaşma 11 gün sonra, AP hPSCs etkili öncüler haline dönüştürülebilir, ve Şekil 3 de gösterildiği gibi, hemen hemen tüm hücrelerin AP öncü hücre işaretleyicileri Nestin ve FOXA2 ifade eder ve hücrelerin% 90 üzerinde bir üç işaretleyicilerin CORIN, OTX2 ekspres ve LMX1a. Onlar Tuj1 ve TH (Şekil 4A) ifade Sonra farklılaşma daha fazla gün sonra, FP öncü hücreler DA nöronlarının üzere belirtilir. Bunlar kolaylıkla ifade gibi bu nöronlar, DA, A9 kimlik vardırs GIRK2 ise kalbindin (Şekil 4B) için negatiftir. Immüno-deneyler farklılaşmanın sadece DA nöron nesline doğru belirtildiğini gösteren bir GFAP + astrositler ve çok az GABAerjik nöronlar (Şekil 4C), olduğunu göstermektedir.
Şekil büyüme faktörleri / küçük moleküller ve her gün için kullanılan kültür ortamı ile farklılaşma protokol 1. Genel. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Morfolojikark tarif edildiği gibi H9 HESC uygun hücre yoğunluğunda tek bir hücre olarak kaplandı. farklılaşması sırasında değiştirmekte ve 48 saat sonra, bu hücrelerin koloni (D0) gibi bir plaka içerisinde% 70 kaynaşmaya eriştikten. Farklılaşma ilk birkaç gün boyunca, hücrelerin farklılaşması 24 saat (D1) sonra% 90'ın üzerinde izdiham ulaşan, hızla genişletmek ve daha sonra 48 daha saat (D3) sonra izdiham olur. Bununla birlikte, bu hücrelerin çoğu hala sitoplazma oranı (D3), yüksek çekirdeğin, tipik HESC morfolojisi sergiler. Farklılaşma geçtikçe, hücreleri daha fazla genişletmek ve yavaş yavaş HESC morfolojisi kaybedersiniz. Diğerleri (D 11) den, bazı alanlarda hücrelerin koyu renk ile belirlendiği üzere farklılaşması D11 sonunda plaka birçok bölgesinde birden fazla hücre tabakaları vardır. D20 D17 yaklaşık başlayarak, bazı hücreler plaka bazı boşluklar bırakarak öldü ve bazı nöron projeksiyonları şimdiden bu alanlarda gözlenebilir birnd bazen hücre tabakası (D20) altında. Büyümeye hücreleri ve farklılaşması için daha fazla boşluk yapmak için D20 sonunda hücre şarjı sonra, hücreler gibi küçük kümeleri bir araya, daha bir çok akson / nevrotiler bu kümelerin ortaya, ve aksonlar / farklı küme nevrotiler gibi kısa bazı bağlantılar kurma 4-5 gün (D25). Ölçek bar, 200 mikron.
Farklılaşma. H9 hESC erken aşamada FP belirteçleri için Şekil 3. immün burada açıklanan protokolünü kullanarak 11 gün boyunca ayırt edildi. Hücreler daha sonra, Triton X-100 ^ ile geçirgenleştirildi% 4 paraformaldehid, eşek serumu ile bloke edildi ve ardından AP öncü hücre markörleri için boyanmıştır ile tespit edildi. Burada gösterildiği gibi, hemen hemen tüm hücrelerin FOXA2 ve Nestin ifade ve hücrelerin% 90'ından fazlası LMX1a, Corin ifade eder veOTX2 FP hücrelere hESC çok yüksek bir verim dönüşüm göstermektedir. Ölçek bar, 200 mikron.
Farklılaşma geç safhalarında DA nöron işaretleri için Şekil 4. immün. (A) H9 HESC 25 gün boyunca farklılaşmış ve hücreler pan-nöron işaretleyici Tuj1 ve yaygın olarak kullanılan DA nöron işaret TH için immün tabi idi. TH pozitif hücrelerden daha fazla Tuj1 pozitif hücreler olmasına rağmen, burada gösterildiği üzere, TH-eksprese eden hücreler Tuj1-ifade eden hücrelerde kalıntısı ve TH-ifade eden hücreler, tüm hücrelerin en az yarısını temsil eder. (B). H9 hESC daha hücreleri immün tabiydi sonra bir 25 gün (toplam 50 gün) ve için ayırt edildi. Sonuçlar, TH-ifade eden hücreler th daha yüksek bir yüzdesi olduğunu göstermiştirBir ki D25 değiştirilmiştir. Çoğu kalbindin için negatiftir Hemen hemen bütün bu TH-salgılayan hücrelerin, aynı zamanda PD kaybolur hücre tipi olan üretilen DA nöronların A9 alt tipi kimlik gösteren, GIRK2 ifade eder. Farklılaşma D25 hücrelere için immüno-(C) GFAP ifade eden hücre yok olan ve çok az sayıda hücre GABA ifade olduğunu göstermiştir. Ölçek bar, 200 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
(HESC ve hiPSCs her ikisi de dahil olmak üzere), insan kök hücreleri en oluşturmak için in vitro olarak ayırt edilebilir, hepsi değilse de, daha önceki çalışmalarda 19'da gösterilmiştir DA nöronlarının da dahil olmak üzere vücut, hücre türleri. Burada, diğer laboratuarlar 14,15 embriyonik dopaminerjik nöron gelişiminde 20 den bilgi ve yayınlanmış protokollere dayalı, biz hESC ve hiPSCs DA nöronların nesil için kültür koşullarını optimize. Bu protokol tekrarlanabilir, verimli ve başarılı H1 ve H9 HESC hatları ve PD hastalarının ve etkilenmemiş kontroller hem hiPSC hatları için burada açıklanan bu protokolü uyguladık.
Protokolde, yüksek farklılaşma verim elde etmek üç temel adım vardır: Birincisi, hücreler önce yönettiği farklılaşması hiçbir farklılaştırılmış hPSC koloniler olmalıdır. Her üç germ olarak spontan farklılaşma genellikle saat görülürPSC kültürü, bu tek tek hücreler içine bu hPSCs ayrıştırma önce, bu farklılaşmış koloniler kaldırmak için önemlidir. Önceki raporlar göstermiştir İkinci olarak, MEF besleyiciler, ayrışmış hPSCs tükenmiş gerektiğini MEF hücreler, kendini yenileme teşvik ve farklılaşmasını 21 inhibe can gizli faktörler. Bu amaç için, 30 dakika boyunca, jelatin kaplı plakalar üzerinde hPSC ve MEF hücre karışımları inkübe hemen hemen tüm MEF hücreleri çıkarmak için yeterli olmalıdır. Üçüncü olarak, tek hPSCs farklılaşması için uygun hücre yoğunluğunda kaplama olmalıdır. Ilgili hücreler de, en az 7 gün gibi kısa plakanın merkezinde dekolmanı ve hücre ölümüne neden olur, hücre yoğunluğu azalınca da hücre yoğunluğu, farklılaşma yaklaşık D11 en fazla hücre ölümüne yol açar artırılması kenar iyi ayırt edecek (veriler gösterilmemiştir). Insan bütün bu üç kriter gözlemler, bu verimli bizim aşamalı protokol ile hPSCs DA nöronları elde etmek kolaydır.
Burada sunulan protokol esas olarak bazı değişikliklerle L. Studer ve arkadaşları 14 tarafından bir önceki rapora dayanmaktadır. Hücreleri sadece yaklaşık% 70 izdiham ulaştığınızda hücreleri tam izdiham (tek hücreli sonra kaplama kültürünün 3 veya daha fazla gün) ulaştığınızda kendi raporunda, farklılaşma başladı iken Öncelikle, burada farklılaşma, tek hücreli sonra kaplama 48 saat başlamıştır. Gün 20 farklılaşma sürecinde ciddi hücre ölümüne yol açmaktadır kadar bizim deneyim, bir hücre geçiş olmadan Konfluent hücrelerinden farklılaşma başlayarak. İkincisi, SAG, HH yolunun 22 için bir klorobenzotiofen içeren küçük moleküllü agonisti ile yaptıkları çalışmada pahalı SHH proteini değiştirin. Dolayısıyla, daha önce yayınlanmış protokollere ile karşılaştırıldığında, burada tarif edilen bu besleyici hücre ve nöral rozet bağımsız ve özellikle AP tarifnamede, küçük molekül göre olduğu; böylece daha az pahalı ve daha az zaman ve emek alıcıdır. Tabii ki, LiBu protokolün mitation farklılaşma ilk gün KSR kullanılmasıdır. KSR farklılaşma verimliliğini etkileyebilecek, partiden partiye değişir. Bu nedenle, bir farklılaşma, 11 gün sonra FP öncülerini uyarmada en uygun olanı almak için ksr farklı toplu test etmelidir.
Özet olarak, burada anlatıldığı farklılaşma protokolü kolaylaştırmalıdır: HESC ya da PH için hücre replasman tedavisi için normal insanların hiPSCs DA nöronların (1) oluşturma; (2) in vitro modelleme ve PH için potansiyel terapötik ilaçları test PD hasta iPSCs DA nöronların nesil; (3) genlerin çalışma / insan DA nöron gelişimini düzenleyen sinyal yolları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
