Abstract
कई मस्तिष्क संबंधी विकार उनके pathophysiology में शामिल neuronal सेल मौत है. दवाओं और neuroprotection / न्यूरोटॉक्सिटी के आणविक तंत्र में जानकारी पाने और संभावित दवा के विकास की सुविधा सकता मदद मिलेगी शामिल बहाव के रास्ते में से न्यूरोप्रोटेक्टिव या neurotoxic प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सुधार हुआ. हालांकि, कई मौजूदा इन विट्रो विषाक्तता assays के प्रमुख सीमाएं हैं - सबसे नहीं समय पाठ्यक्रम और प्रभाव के कैनेटीक्स निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है, एक ही समय बिंदु पर न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection का आकलन करें. इसके अलावा, वास्तविक समय में neuroprotection में शामिल बहाव के संकेत दे रास्ते के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए अवसर बहुत महत्व का होगा. मौजूदा प्रोटोकॉल में हम लेबल से मुक्त और वास्तविक समय Condit के तहत एक neuronal सेल लाइन में सेरोटोनिन 2A (5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A) रिसेप्टर एगोनिस्ट के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक के उपयोग का वर्णनप्रतिबाधा माप का उपयोग कर आयनों. इसके अलावा, हम दूसरे के दूत रास्ते में से अवरोधकों न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव में शामिल बहाव के अणुओं को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. हम भी सेल प्रसार पर असर मनाया न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव में योगदान देता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस तकनीक की उपयोगिता का वर्णन है. प्रणाली, कुओं के नीचे की सतह पर सोना microelectrode सरणियों बारी सेल सेंसर के रूप में सेवारत होते हैं जो ई प्लेट्स के रूप में भेजा विशेष शास्त्रीय प्लेटों का इस्तेमाल करता. प्रतिबाधा readout पक्षपाती कोशिकाओं, सेल व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान, और आसंजन की संख्या से संशोधित किया गया है. सेल इंडेक्स कहा जाता है एक आयामरहित पैरामीटर विद्युत प्रतिबाधा माप से प्राप्त होता है और सेल स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुल मिलाकर, वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक अधिक योगदान करने के लिए, वास्तविक समय, neuroprotection और न्यूरोटॉक्सिटी के लेबल से मुक्त मूल्यांकन, और दूसरा दूत रास्ते भागीदारी के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता हैचिकित्सकीय उम्मीदवारों के चयन के लिए इन विट्रो में संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव यौगिकों की विस्तृत और उच्च throughput आकलन.
Introduction
Neuronal सेल मौत कई मस्तिष्क संबंधी विकार 1 के pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इन विट्रो विषाक्तता assays में विश्वसनीय और उच्च throughput की उपलब्धता न्यूरोटॉक्सिटी के तंत्र में बेहतर जानकारी हासिल करने और नशीली दवाओं के विकास 2 में चिकित्सीय उम्मीदवार के रूप में न्यूरोप्रोटेक्टिव अणुओं का चयन करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सबसे व्यापक रूप से गतिज संकल्प की अनुमति नहीं एक समय बिंदु पर न्यूरोटॉक्सिटी / neuroprotection आकलन इन विट्रो न्यूरोटॉक्सिटी assays.They में इस्तेमाल करने के लिए कई सीमाएं हैं; अक्सर संकेत दे रास्ते के साथ हस्तक्षेप और एक ही सेल की आबादी में अतिरिक्त पढ़ाई की सीमा, और अक्सर श्रम प्रधान हैं, और कई मामलों में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सकते हैं जो लेबल या जांच का उपयोग करें. वर्तमान अध्ययन में हम वास्तविक समय में और नीचे एक neuronal सेल लाइन में न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection निर्धारित करने के लिए एक वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक की उपयोगिता का प्रदर्शन लेबल से मुक्तस्थितियां प्रभाव में शामिल दूसरा दूत रास्ते के विश्लेषण के माध्यम से बहाव तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए और.
पिछले अध्ययनों मानक तकनीक 3,4,5,6 के साथ तुलना में cytotoxicity के साथ ही सेल लाइनों में सेल प्रसार पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक की वैधता की पुष्टि की है. उदाहरण के लिए, एक अच्छे संबंध बेसल प्रसार परिस्थितियों में और HELA कोशिकाओं 3 में दो अलग विषाक्त मानदंड के बाद कई समय बिंदुओं पर मानक सेल व्यवहार्यता WST-1 परख की readouts और सेल इंडेक्स वैल्यू के बीच मनाया गया. सेल सूचकांक माप द्वारा मूल्यांकन और standardly इस्तेमाल किया sulforhodamine बी (SRB) परख 4 जब microtubule स्थिरता प्राप्त Paclitaxel साथ उकसाया A549 और एमडीए MB-231 कोशिकाओं के प्रसार और cytotoxicity में बहुत समान मूल्यों दिखाया. अमर hippocampal न्यूरॉन्स के neuronal सेल लाइन में एचटी -22 सेल सूचकांक माप उनकी क्षमता टी के लिए मान्य किया गयाओ व्यापक रूप से इस्तेमाल 3 (4,5-dimethylthiazol-2-YL) के खिलाफ सेल प्रसार, ग्लूटामेट cytotoxicity और cytoprotection 2,5-diphenyltetrazolium-ब्रोमाइड (MTT) परख 5 का पता लगाने. इसी अध्ययन में MTT परख परिणाम और सेल सूचकांक माप भी अखिल कस्पासे अवरोध QVD 5 से वृद्धि कारकों के अभाव और cytotoxicity के बचाव के बाद neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रसार, cytotoxicity मापने में अच्छी तरह से सहसंबद्ध. Vandetanib (संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर और epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर अवरोध) द्वारा एनआईएच 3T3 कोशिकाओं में प्रेरित cytotoxicity सेल इंडेक्स वैल्यू या तटस्थ लाल तेज परख 6 से मापा इसी तरह के परिणाम से पता चला है.
हमने हाल ही में सेरोटोनिन 2A के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का आकलन करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली का इस्तेमाल किया है (5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A) रिसेप्टर agonist (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine हाइड्रोक्लोराइड एक neuronal सेल लाइन में (DOI) ( एस एन एसएच कोशिकाओं) और SECO की भागीदारी के लिए जांचमनाया neuroprotection 7 पर उनकी रासायनिक निषेध के प्रभाव की निगरानी के माध्यम से एन डी दूत रास्ते. दिलचस्प है, 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर आम और विशिष्ट दूसरा दूत रास्ते 8 दोनों को सक्रिय कर सकते हैं जो (DOI और lisuride, क्रमशः) की तरह hallucinogenic और nonhallucinogenic दोनों एगोनिस्ट है.
प्रस्तुत तकनीक का लाभ यह दिन के कोर्स में सेल अस्तित्व पर वास्तविक समय की जानकारी एकत्र करने के लिए neuroprotection के लिए प्रसार प्रभाव के संभावित योगदान का आकलन करने के लिए, और एक इष्टतम समय का चयन करने के लिए, दूसरी दूत रास्ते शामिल चित्रित करने के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं एक ही सेल की आबादी पर अतिरिक्त अंत बिंदु के अध्ययन के लिए. मौजूदा प्रोटोकॉल में कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.
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Protocol
1 तैयारी
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के साथ सेट एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वास्तविक समय सेल विश्लेषक के स्टेशन रखें. बाँझ शर्तों के तहत एक टिशू कल्चर हुड में सभी सेल संस्कृति से निपटने और औषधीय उपचार के लिए बाहर ले.
- नोट: संस्कृति के लिए मानक स्थितियों की तुलना में अलग तापमान जमाव की आवश्यकता neuronal सेल लाइनों, उसके अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. कमजोर पक्षपाती सेल लाइनों के लिए, ई प्लेट 96 के कुओं के तल में सोने microelectrodes के साथ कोशिकाओं की बातचीत की सुविधा के लिए कोटिंग एजेंट का उपयोग करें.
- (उपयुक्त विलायक में न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंट या दूसरा दूत रास्ते इनहिबिटर्स - dimethylsulfoxide या बाँझ पानी) 1,000X शेयर सेल संस्कृति के इलाज के लिए औषधीय यौगिकों का समाधान तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान. निम्नलिखित उपचार में वाहन के रूप में विलायक का प्रयोग करें.
- DMEM / F1 में संस्कृति मानव neuroblastoma एस एन एसएच कोशिकाओं2 मध्यम बारे में 75% का घनत्व 175 सेमी 2 सतह के साथ सेल संस्कृति बोतल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (प्रसार माध्यम) के साथ पूरक. सेल प्रसार और cytotoxicity के जवाब की दर के मामले में प्रयोगों के बीच स्थिरता का पता लगाने के लिए (लगभग 10 अंश की) एक सीमा के भीतर सेल बीतने संख्या रखें. लोअर बीतने संख्या पसंद कर रहे हैं.
- पीबीएस के साथ पक्षपाती एस एन एसएच सेल परत धो लें, और 37 सी में 5 मिनट के लिए 0.05% trypsin EDTA समाधान के साथ trypsinize. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 170 × जी पर कोशिकाओं trypsin दूर करने के लिए. 10 मिलीलीटर प्रसार माध्यम में कोशिकाओं Resuspend. राजाधिकार सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना और प्रसार मध्यम के साथ कोशिकाओं गिराए द्वारा 300,000 कोशिकाओं / एमएल सेल नंबर समायोजित.
2 चढ़ाना और एस एन एसएच कोशिकाओं के प्रसार
- ई प्लेट 96 में से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl प्रसार मध्यम जोड़ें और संतुलित करने के लिए आरटी पर टिशू कल्चर हुड में 30 मिनट के लिए छोड़ दें. ई पीएलए डालें37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में वास्तविक समय सेल विश्लेषक स्टेशन में ते 96.
- वास्तविक समय सेल विश्लेषक सॉफ्टवेयर शुरू करो. लेआउट पृष्ठ पर कुओं प्रयोग में शामिल चुनें और संपादन बक्से में सेल प्रकार, सेल नंबर, नाम और सेल उपचार के लिए इस्तेमाल किया रासायनिक यौगिकों की सांद्रता के बारे में जानकारी दर्ज करें.
नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए कम से कम 4 replicates प्रत्येक उपचार के लिए सिफारिश कर रहे हैं. - अनुसूची सॉफ्टवेयर पृष्ठ पर प्रयोग में, सेल सूचकांक और प्रत्येक चरण के लिए sweeps के बीच अंतराल को मापने sweeps की संख्या का चयन करके शामिल "कदम" का निर्धारण. चरण 1 पृष्ठभूमि माप के लिए पूर्व निर्धारित है, सेल सूचकांक 96 घंटे के लिए हर 15 मिनट मापने के लिए और निर्धारित चरण 2 "एक कदम जोड़ें" का चयन करें.
नोट: उपचार के लिए, जिसमें तेजी से कैनेटीक्स के साथ प्रभाव, उम्मीद कर रहे हैं कम अंतराल पर sweeps निर्धारित किया है. - स्वचालित रूप से पूर्व निर्धारित चरण शुरू करने के लिए प्रारंभ क्लिक करें 1और मीडिया की पृष्ठभूमि प्रतिबाधा उपाय. कोशिकाओं वेल्स को जोड़ रहे हैं एक बार यह मान स्वचालित रूप से प्रत्येक डेटा बिंदु पर सॉफ्टवेयर से घटाया जाता है.
- प्रसार माध्यम में 300,000 कोशिकाओं / एमएल के पहले कदम 1.5 में तैयार) सेल निलंबन का प्रयोग करें. / अच्छी तरह से सेल विषाक्तता / neuroprotection पढ़ाई और अच्छी तरह से सेल प्रसार के अध्ययन के लिए 15,000 कोशिकाओं / के लिए 30,000 कोशिकाओं. ई प्लेट बाहर ले जाओ और सेल विषाक्तता / neuroprotection पढ़ाई के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl सेल निलंबन जोड़ने और सेल प्रसार के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से प्रति 50 μl सेल निलंबन और 50 μl प्रसार मध्यम जोड़ें. अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या अनुभव से प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- धीरे कोशिकाओं का भी चढ़ाना के लिए ई प्लेट 96 ज़ुल्फ़. कोशिकाओं कुओं की तह तक समान रूप से बसने की अनुमति के लिए आरटी पर टिशू कल्चर हुड में 30 मिनट के लिए ई प्लेट 96 छोड़ें.
- वास्तविक समय सेल विश्लेषक स्टेशन में ई प्लेट 96 डालें और अनुसूची पी पर चरण 2 शुरूउम्र. प्लॉट पेज और सॉफ्टवेयर की सेल सूचकांक पृष्ठ पर कच्चे सेल सूचकांक के आंकड़ों पर सेल घटता देखने के द्वारा प्रयोग भर में सेल इंडेक्स वैल्यू मॉनिटर.
3 सीरम अभाव
- 24 घंटा कोशिकाओं चढ़ाना के बाद, प्रयोग रोक, और वास्तविक समय सेल विश्लेषक स्टेशन से ई प्लेट 96 को हटा दें. DMEM / F12 सीरम मुक्त मध्यम साथ 1,000X शेयरों से दूसरे दूत अवरोधकों पतला - 200 के लिए अंतिम एकाग्रता ×. संबंधित रास्ते को बाधित करने के लिए, दूसरा दूत रास्ते में से 1 μl अवरोधकों 30 मिनट cytotoxicity की शुरुआत से पहले न्यूरोटॉक्सिटी / neuroprotection में उनकी भागीदारी के लिए परीक्षण किया जा के साथ कोशिकाओं को समझो. स्टेशन के लिए ई प्लेट 96 लौटें और प्रयोगात्मक सेल सूचकांक माप फिर से शुरू.
- 30 मिनट के बाद फिर से प्रयोग रोक. ध्यान से पक्षपाती सेल परत को बाधित करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, एक पिपेट (या मल्टी चैनल पिपेट) के साथ ई प्लेट से पूरी तरह से 96 कुओं प्रसार मध्यम हटानेअच्छी तरह से कोने में पिपेट टिप के किनारे निर्देशन द्वारा. 200 μl / सीरम मुक्त DMEM / F12 मध्यम (सीरम अभाव मध्यम) की अच्छी तरह से जोड़ें. कोशिकाओं के यांत्रिक आंदोलन को कम करने के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से तेजी से आदान प्रदान किया जाता है.
- यौगिकों पतला अंतिम एकाग्रता × 200 के लिए सीरम मुक्त DMEM / F12 माध्यम के साथ 1,000X स्टॉक से उनके न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव के लिए परीक्षण किया जाना है. 1 μl यौगिकों जोड़ें अपने न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव और प्रायोगिक योजना के अनुसार व्यक्तिगत कुओं में दूसरा दूत रास्ते में से 1 μl अवरोधकों के लिए परीक्षण किया जाना है.
- प्रसार के अध्ययन के लिए कोशिकाओं में मध्यम बदल नहीं है. अच्छी तरह से प्रति 1 μl के साथ इलाज के लिए और प्रसार माध्यम में संस्कृति के लिए जारी, प्रसार माध्यम में अंतिम एकाग्रता × 200 को 1,000X स्टॉक से परीक्षण किया जाना यौगिकों पतला.
- पहले सेट के रूप में 96 घंटे के लिए सेल सूचकांक माप के साथ हर 15 मिनट के लिए जारी करने के लिए प्रयोग जारी रखें.
4 डेटाnalysis
- न्यूरोटॉक्सिटी पर / neuroprotection डेटा प्लॉट पेज पर "समय मानक के अनुसार" "सामान्यीकृत सेल सूचकांक" का चयन करके प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए और औषधीय उपचार या मध्यम परिवर्तन से पहले आखिरी बार बात करने के लिए सेल सूचकांक मानक के अनुसार.
- ब्याज की प्रयोगात्मक शर्तों के लिए प्लॉट पेज पर कुओं को हाइलाइट करें और सामान्यीकृत सेल सूचकांक घटता साजिश करने के लिए "जोड़ें" पर क्लिक करें. , या समय के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत सेल सूचकांक घटता के रूप में दूसरा दूत निषेध की neurotoxic / न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव के कैनेटीक्स का निरीक्षण करें.
- प्रसार पर असर न्यूरोप्रोटेक्टिव / neurotoxic प्रभाव में शामिल है कि क्या आकलन करने के लिए समय के एक समारोह के रूप में प्रसार माध्यम में जांच की दवा उपचार के लिए सेल सूचकांक घटता निरीक्षण.
- परिणामों के सांख्यिकीय मूल्यांकन आरंभ करने के लिए एक एक्सेल फाइल में सेल सूचकांक सॉफ्टवेयर पेज से सभी सेल सूचकांक समय बिंदुओं के लिए प्रयोगात्मक जानकारी निर्यात
- विशिष्ट समय बिंदुओं पर अलग उपचार शर्तों के तहत सेल सूचकांक मूल्यों में मतभेद के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, निर्यात एक्सेल फाइल से संबंधित समय बिंदुओं पर कक्ष का चयन करें इंडेक्स वैल्यू. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक के बाद अस्थायी परीक्षण के बाद विचरण का एक तरह से या दो तरह से विश्लेषण (एनोवा) के साथ चयनित समय बिंदुओं के लिए सेल सूचकांक मूल्यों का विश्लेषण करें.
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Representative Results
सीरम अभाव वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ लगातार नजर रखी जा सकती है, जो सेल इंडेक्स वैल्यू में कमी की ओर जाता है
कोशिकाओं को neurotoxic उत्तेजनाओं प्रस्तुत तकनीक और विशिष्ट न्यूरोटौक्सिक प्रोत्साहन और अध्ययन सेल प्रकार पर निर्भर है जो की गतिशीलता के साथ वास्तविक समय में नजर रखी जा सकती है, जो सेल इंडेक्स वैल्यू में कमी करने के लिए नेतृत्व. चित्रा 2 में वृद्धि दर्शाता है एस एन एसएच कोशिकाओं एक पठार (ग्रीन लाइन) और अभाव मध्यम (लाल रेखा) सीरम कोशिकाओं स्विचन के बाद नए निचले स्तर पर एक स्थिरीकरण द्वारा पीछा सेल सूचकांक की बूंद तक पहुँचने तक प्रसार माध्यम में बड़े हो रहे हैं जब सेल सूचकांक. यह ड्रॉप कारण सीरम की वापसी के लिए सेलुलर आसंजन में बदलाव का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
दवा इलाज के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ लगातार नजर रखी जा सकती
"> एक ही समय (सह उपचार) या न्यूरोटौक्सिक प्रोत्साहन के बाद (सेल वसूली सुझाव) पर (पूर्व उपचार) से पहले जोड़ा यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव भी इस प्रकार के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने, वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ लगातार पीछा किया जा सकता . दर और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव की अवधि 3 चित्रा दो 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A एगोनिस्ट के neuroprotection की गतिशीलता के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है - 5 माइक्रोन डीओआई (चित्रा 3 ए) और 20 माइक्रोन lisuride (3B चित्रा) में कोशिकाओं स्विचिंग के समय में जोड़ा सीरम अभाव मध्यम.वास्तविक समय सेल विश्लेषक सेल अस्तित्व और सेल प्रसार पर प्रभाव के बीच अंतर करने के लिए अनुमति देता है
Neuronal सेल लाइनों में neuroprotection अध्ययन में एक महत्वपूर्ण सवाल सेल प्रसार पर असर सेल अस्तित्व पर मनाया मिश्रित प्रभाव के लिए योगदान देता है कि क्या है. वास्तविक समय सेल गुदा के साथyzer प्रसार पर प्रभाव एक ही ई प्लेट में परीक्षण किया जा सकता है 96 का आकलन न्यूरोटॉक्सिटी. चित्रा 4 मनाया में योगदान नहीं है प्रसार पर असर सुझाव, एस एन एसएच कोशिकाओं के प्रसार पर 5 माइक्रोन डीओआई उपचार के प्रभाव की कमी को दर्शाता है न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव.
वास्तविक समय सेल विश्लेषक दूसरा दूत रास्ते न्यूरोप्रोटेक्टिव / neurotoxic प्रभाव में शामिल किया जाता है जो निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है
रिसेप्टर सक्रियण दूसरा दूत प्रभाव का एक झरना शुरू की. मौजूदा प्रोटोकॉल उनके inhibitors के साथ pretreatment के माध्यम से वास्तविक समय में एक न्यूरोप्रोटेक्टिव / neurotoxic प्रभाव में दूसरे दूतों की एक संख्या की भागीदारी के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है. समय के साथ रैखिक नहीं दूसरा दूत के प्रभाव के बाद सेल अस्तित्व पर अवरोधकों स्पष्ट किया जा सकता है, और कई मामलों में है, इसकी कैनेटीक्स निम्नलिखित 5 चित्रा. बहुत जानकारीपूर्ण है 10 माइक्रोन फॉसफोरस के प्रभाव को प्रस्तुत करता हैसीरम वंचित एस एन एसएच कोशिकाओं में सेल अस्तित्व और डीओआई neuroprotection पर phatidylinositol 3 kinase (PI3 कश्मीर) अवरोध LY294002. प्रस्तुत ग्राफ में 10 माइक्रोन LY294002 सीरम अभाव में डीओआई की न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव को रोका, लेकिन यह भी अपने स्वयं के कुछ विषाक्त प्रभाव नहीं पड़ा.
प्रासंगिक दूसरा दूत रास्ते और प्रत्येक परीक्षण परिसर के लिए सांद्रता साहित्य खोज के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता अवरोध करनेवाला. दूसरा दूत अवरोधकों की सांद्रता उपयुक्तता सत्यापित हो गया है, और अगर जरूरत प्रयोगात्मक अनुकूलित. अनुकूलन के लक्ष्य अभी भी प्रभावी ढंग से संबंधित दूसरा दूत बाधा है, जबकि अपने आप में सेल इंडेक्स वैल्यू के एक न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, जो एक एकाग्रता, का चयन करने के लिए है. एक उदाहरण के रूप में, 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर के लिए प्रासंगिक हो सकता है जो कुछ दूसरा दूत रास्ते inhibitors, तालिका 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं इन अवरोधकों पहले ext की serotonergic वृद्धि में शामिल बहाव के लक्ष्यों का आकलन किया गया हैracellular संकेत विनियमित काइनेज फास्फारिलीकरण 9. हम इस बात की पुष्टि के बाद और हमारे प्रयोगात्मक प्रतिमान 7 के लिए उनके सांद्रता के अनुकूलन कुछ मामलों में 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर एगोनिस्ट द्वारा neuroprotection में शामिल बहाव के रास्ते का आकलन करने के लिए उनकी उपयोगिता से पता चला है.
चित्रा 1 मौजूदा प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध आरेख. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
सेल सूचकांक. सीरम अभाव पर सीरम अभाव के चित्रा 2 प्रभाव (लाल रेखा) प्रसार माध्यम (ग्रीन लाइन) में सेल इंडेक्स वैल्यू में क्रमिक वृद्धि की तुलना में सेल सूचकांक में तेजी से कमी लाती है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 इस प्रयोग 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A एगोनिस्ट डीओआई में cytoprotective दवाओं के साथ सीरम अभाव के बाद सेल सूचकांक पर 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A एगोनिस्ट का प्रभाव. उपचार ((5 माइक्रोन) (ए) (मैजंटा लाइन) और lisuride (20 माइक्रोन) (बी ) (अंधेरे मैजंटा लाइन) को आंशिक रूप से सीरम अभाव (लाल रेखा) की कमी हुई सेल इंडेक्स वैल्यू पुनर्स्थापित करता है. क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
(वर्तमान प्रयोग 5 माइक्रोन डीओआई में) प्रसार माध्यम में दवाओं के साथ सेल प्रसार बेशक. उपचार में चित्रा 4 सेल इंडेक्स वैल्यू (मैजंटा लाइन) वाहन उपचार (ग्रीन लाइन) की तुलना में प्रसार पर प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुमति देता है. क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्रा 5 दूसरा दूत अवरोधकों को अपने दम पर सेल अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है और obse पर दूसरा दूत रास्ते के प्रभाव के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैrved neuroprotection. कोशिकाओं सीरम अभाव का शिकार हुए इस प्रयोग में 10 माइक्रोन PI3 कश्मीर अवरोध LY294002 साथ pretreated और 1 माइक्रोन डीओआई (ब्लू लाइन) या pretreated के साथ व्यवहार, वाहन (लाल रेखा), 1 माइक्रोन डीओआई (मैजंटा लाइन) के साथ इलाज किया जा रहा है 10 माइक्रोन LY294002 साथ और वाहन (काला लाइन) के साथ इलाज किया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
तालिका 1: वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रयोगों में हमारे द्वारा इस्तेमाल किया 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर बहाव के रास्ते और उनकी सांद्रता के लिए प्रासंगिक हो सकता है जो दूसरे के दूत inhibitors, के उदाहरण.
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Discussion
मौजूदा प्रोटोकॉल लगातार और लेबल से मुक्त परिस्थितियों में neuronal सेल लाइनों में यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव / neurotoxic प्रभाव का आकलन करने के लिए और प्रभाव में शामिल दूसरा दूत रास्ते में जानकारी हासिल करने के लिए एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक की उपयोगिता प्रस्तुत करता है.
Cytotoxicity और सेल प्रसार पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक की उपयोगिता आम तौर पर मान्यता प्राप्त है, भले ही कुछ अध्ययनों न्यूरोनल संबंधित प्रकार की कोशिकाओं में इसे इस्तेमाल किया है. Galante एट अल., पता चला है, जबकि हम पहले इसके बारे में न्यूरोटॉक्सिटी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मानव neuroblastoma एस एन एसएच कोशिकाओं में एक 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर agonist के neuroprotection नजर रखने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक की उपयोगिता से पता चला है मानव neuroblastoma एसएच SY5Y कोशिकाओं 7,10 में बीटा amyloid पेप्टाइड्स. एक ताजा अध्ययन में वास्तविक समय सेल विश्लेषक मापा जबकि मज़बूती से एक में प्रसार और सेल कोशिका मृत्यु का सुझाव दिया गया हैeuronal सेल लाइन और neuronal अग्रदूत साबित कोशिकाओं, प्राथमिक न्यूरॉन्स में कोशिका मृत्यु का आकलन करने में अपनी सटीक अपमान 5 की गंभीरता पर निर्भर करता था. महत्वपूर्ण बात है, वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली के लिए इस्तेमाल बारी वर्तमान microampere धाराओं पैदा करने, बहुत कम परिमाण की है. इन धाराओं में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स के रूप में उत्तेजनीय कोशिकाओं की दहलीज क्षमता से काफी कम हैं. वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली इसलिए सेल पालन की डिग्री महत्व का है, ई प्लेट 96 कुओं के नीचे की सतह से प्रतिबाधा माप पर निर्भर करता है. यह बेहतर पालन के लिए बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ ई प्लेट कुओं की कोटिंग के आगे अनुकूलन प्राथमिक न्यूरॉन्स के साथ प्राप्त परिणामों में सुधार हो सकता है कि संभव है.
वर्तमान पांडुलिपि neuroprotection में शामिल दूसरा दूत रास्ते चित्रित करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली का उपयोग करने का एक उपन्यास दृष्टिकोण को दर्शाता है. हमारी प्रोटोकॉल दूसरा मेसी के रासायनिक निषेध पर निर्भर करता हैधारणा ngers एक न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंट की कार्रवाई में शामिल होने के लिए. प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रतिमान के लिए उपयुक्त तालिका 1 सूचियों एक उदाहरण के रूप में 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर के लिए प्रासंगिक हो सकता है जो कुछ आमतौर पर इस्तेमाल दूसरा दूत रास्ते inhibitors,, और उनके सांद्रता. इस प्रयोगात्मक डिजाइन पूरक दृष्टिकोण के माध्यम से और अधिक विस्तृत अध्ययन के लिए नीचे की ओर लक्ष्य का चयन करने, संभावित प्रासंगिक दूसरा दूत रास्ते की तेजी से जांच के लिए अनुमति देता है.
वास्तविक समय सेल विश्लेषक का एक महत्वपूर्ण लाभ यह भी प्रसार पर असर एक मनाया न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का एक हिस्सा है कि क्या आकलन करने की क्षमता है. बजाय विषाक्तता assays में प्राथमिक न्यूरॉन्स के neuronal सेल लाइनों का प्रयोग कम लागत, आसान उपयोग और पशु प्रयोगों के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, कुछ लाभ प्रदान करता है. हालांकि, प्राथमिक न्यूरॉन्स के विपरीत neuronal सेल लाइनों पैदा तथ्य यह है कि, प्रसार पर संभावित प्रभाव के लिए नियंत्रित करने की जरूरत हैन्यूरोटॉक्सिटी assays. वास्तविक समय सेल विश्लेषक एक ही प्रयोगात्मक ई प्लेट 96 में इस पर नियंत्रण करने के लिए प्रदर्शन प्रदान करता अवसर, प्रयोगात्मक डिजाइन की सुविधा.
कई तकनीकी मानकों वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ प्रयोगों में विचार किया जाना चाहिए. अच्छी तरह से प्रत्येक का परीक्षण सेल प्रकार के लिए अनुमापन प्रयोग के माध्यम से अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए प्रति कोशिकाओं की संख्या चढ़ाया जाए. Cytotoxicity और प्रसार उपचार सभी कोशिकाओं का पूरा पालन अनुमति देने के लिए, सेल संस्कृति की दीक्षा के 24 घंटे बाद शुरू कर रहे हैं. कोशिकाओं तक पहुंच गए हैं, जब 65-70% संगम शुरू कर cytotoxicity प्रयोगों में इष्टतम परिणाम मौजूदा प्रोटोकॉल में प्राप्त किया गया. प्रसार प्रयोगों के लिए कम सेल संगम प्रसार वक्र पर एक दवा के प्रभाव का पालन करने के लिए (20-30%) पसंद किया जाता है.
मौजूदा प्रोटोकॉल सीरम में अभाव न्यूरोटॉक्सिटी प्रतिमान के कारण इसकी मजबूती के लिए प्रस्तुत किया जाता है, उपयोग और उपयोगिता की आसानी लगभगपौष्टिकता के अभाव विकास, तीव्र मस्तिष्क या तंत्रिका आघात, और neurodegeneration 11 के दौरान महत्वपूर्ण है जो neuronal मौत, मध्यस्थता. हालांकि, न्यूरोटॉक्सिटी मानदंड की एक विस्तृत श्रृंखला के वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली के साथ प्रयोग किया जा सकता है. इधर, cytotoxicity के समय में एक cytoprotective एजेंट के साथ सह उपचार प्रस्तुत किया है. हालांकि, विषाक्त घटना (आकलन सेल वसूली) के बाद pretreatment या उपचार भी यौगिकों का परीक्षण किया जा रहा है के आधार पर नियोजित किया जा सकता.
कुल मिलाकर, मौजूदा प्रोटोकॉल लगातार और लेबल से मुक्त neuronal सेल लाइनों में न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection का आकलन करने के लिए और इन प्रभावों में शामिल बहाव के रास्ते में जानकारी हासिल करने के लिए एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली की उपयोगिता पता चलता है.
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Disclosures
वर्तमान वीडियो लेख के लिए प्रकाशन लागत "ACEA बायोसाइंसेज" द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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