Abstract
多くの脳関連障害は、それらの病態生理に関与する神経細胞死を持っている。関連する薬剤や下流経路の神経保護または神経毒性作用を研究するためのin vitroモデルの改善は、神経保護/神経毒性の分子機構への洞察を得ることに役立つだろうと、潜在的に医薬品開発を容易にすることができる。しかし、多くの既存のインビトロ毒性アッセイは、主要な制限があります-ほとんどがいない時間経過や効果の動態を観察することができ、単一の時点での神経毒性および神経保護を評価します。また、リアルタイムで神経保護に関与する下流のシグナル伝達経路に関する情報を収集する機会が非常に重要であろう。現在のプロトコルでは、ラベルフリーかつリアルタイムコンディット下の神経細胞株におけるセロトニン2A（5-HT 2Aの）受容体アゴニストの神経保護効果を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の使用を記載インピーダンス測定を用いてイオン。さらに、本発明者らは、第二メッセンジャー経路の阻害剤は、神経保護効果に関与する下流の分子を記述するために使用できることを実証している。また、細胞増殖への影響が観察された神経保護効果に寄与するかどうかを決定するために、この技術の有用性を説明する。システムは、セルのセンサーとして、ウェルの底面上に金微小電極アレイを交互に含んでE-プレートと呼ばれる特殊なマイクロエレクトロニクスプレートを利用する。インピーダンス読み出しは、接着細胞、細胞生存率、形態、および接着の数によって修正される。細胞指数と呼ばれる無次元パラメータは、電気インピーダンス測定値から導出され、セルの状態を表すために使用される。全体的に、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置は、以上に寄与し、リアルタイム、ラベルフリー神経保護及び神経毒性の評価、および第二のメッセンジャー経路の関与の評価を可能にする治療候補を選択するためのin vitroでの潜在的な神経保護化合物の詳細かつ高スループット評価、。
Introduction
神経細胞死は、多くの脳関連障害1の病態生理学において重要な役割を果たしている。 体外毒性アッセイにおける信頼性と高スループットの利用可能性は、神経毒性のメカニズムにより良い洞察を得るために、薬剤開発の2中の治療候補としての神経保護分子を選択するのに役立つことが重要です。しかし、最も広く速度論的分割を可能としない単一の時点で神経毒性/神経保護を評価するin vitroで神経毒性assays.They で使用するには多くの制限があります。多くの場合、シグナル伝達経路に干渉し、同じ細胞集団においてさらなる研究を制限することができるラベルまたはプローブを使用し、多くの場合、労働集約的であり、多くの場合、機構的洞察を提供しない。本研究では、リアルタイムで及び下神経細胞株における神経毒性および神経保護を決定するために、リアルタイムのインピーダンスベースの細胞分析装置の有用性を実証無標識効果に関与してセカンドメッセンジャー経路の解析を通って下流のメカニズムへの洞察を提供するための条件や。
以前の研究は、細胞毒性、ならびに標準的な技術3,4,5,6と比較して細胞株における細胞増殖への影響を決定するために、リアルタイム細胞分析の妥当性を確認した。例えば、良好な相関が基礎的な増殖条件下で、HeLa細胞における3つの異なる毒性パラダイムの後いくつかの時点で、標準的な細胞生存率WST-1アッセイの読み出し及び細胞指数値の間で観察された。細胞指数の測定によって評価し、標準的に使用されるスルホローダミンB（SRB）アッセイ4時微小管安定化剤パクリタキセル誘発A549およびMDA-MB-231細胞の増殖および細胞毒性に非常に類似した値を示した。不死化海馬ニューロンの神経細胞株では、HT-22細胞指数測定は能力tの検証されたO広く使用3-（4,5 -ジメチルチアゾール2 -イル）2,5 -ジフェニル-ブロミド（MTT）アッセイ5に対する細胞増殖、グルタミン酸細胞毒性および細胞保護作用を検出する。同じ研究において、MTTアッセイの結果とセル·インデックス·測定も汎カスパーゼ阻害剤QVD 5によって成長因子欠乏および細胞毒性の救出後の神経前駆細胞の増殖、細胞毒性を測定する際によく相関していた。バンデタニブ（血管内皮成長因子受容体および上皮成長因子受容体阻害剤）をNIH 3T3細胞に誘導される細胞毒性は、細胞指数値またはニュートラルレッド取り込みアッセイ6で測定し、同様の結果を示した。
私たちは、最近、セロトニン2Aの神経保護効果を評価するために、リアルタイム細胞分析システムを使用した（5-HT 2A）受容体アゴニスト（±）-2,5 -ジメトキシ-4 -ヨードアンフェタミン塩酸塩神経細胞株における（DOI）（ SK-N-SH細胞）およびセコの関与についてスクリーニングNDメッセンジャー経路観察神経保護7上でそれらの化学的阻害の効果をモニタリングを通じて。興味深いことに、5-HT 2A受容体は一般的であり、明確な第二メッセンジャー経路8の両方を活性化することができる（DOIとリスリド、それぞれのような）幻覚やnonhallucinogenic両方アゴニストを持っています。
提示技術の利点は、それが、日の過程で細胞生存に対するリアルタイム情報を収集するために関与するセカンドメッセンジャー経路を描写するために、神経保護の増殖効果の寄与の可能性を評価するために、最適な時間を選択することを可能にすることである同じ細胞集団に対する追加のエンドポイント研究のため。現在のプロトコルでのワークフローの概略図が図1に示されている。
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Protocol
の調製
- 37℃に設定し、組織培養インキュベーター中、5％CO 2で、リアルタイム細胞分析装置のステーションを配置する。無菌条件下で組織培養フード内のすべての細胞培養処理および薬理学的治療を行う。
- 注：培養のための標準的な条件と比較して異なる温度設定を必要とする神経細胞株は、それに応じて調整されるべきである。弱い接着細胞株について、E-プレート96のウェルの底の金微小電極と細胞の相互作用を容易にするために、コーティング剤を使用する。
- 細胞培養治療のための薬理学的化合物の1,000倍ストック溶液（適切な溶媒中の神経保護剤または第二メッセンジャー経路阻害剤 - ジメチルスルホキシドまたは滅菌水）を準備し、-20℃で保管してください。以下の処理は、車両などの溶媒を使用してください。
- 培養ヒト神経芽細胞腫DMEM / F1におけるSK-N-SH細胞約75％の密度に175cm 2の表面を有する細胞培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）（増殖培地）を補充した2培地。細胞増殖および細胞毒性に対する応答速度の点で実験との整合性を確認するために、（約10継代の）範囲内の細胞継代数にしてください。低い継代数が好ましい。
- PBSで付着SK-N-SH細胞層を洗浄し、そして37℃で5分間、0.05％トリプシン-EDTA溶液でトリプシン処理。遠心トリプシンを除去し、5分間170×gで細胞。 10ミリリットルの増殖培地中で細胞を再懸濁。セプター細胞カウンターで細胞を計数し、増殖培地で細胞を希釈して300,000細胞/ mlに細胞数を調整する。
2めっき及びSK-N-SH細胞の増殖
- E-プレート96の各ウェルに100μlの増殖培地を追加し、平衡化し、室温で組織培養フード内で30分放置する。 E-PLAを挿入37℃のCO 2インキュベーター内でリアルタイム細胞分析装置局におけるテ96。
- リアルタイムの細胞分析装置のソフトウェアを起動します。レイアウトページで井戸が実験に含ま選択し、編集ボックスに、細胞型、細胞数、名称および細胞治療のために使用される化学化合物の濃度に関する情報を入力します。
注：このプロトコルの目的のためには、少なくとも4回の反復がそれぞれの治療のために推奨されている。 - スケジュールソフトウェア]ページでセルインデックスと各ステップのスイープ間の間隔を測定する掃引回数を選択することで、実験に含まれる「手順」を決定する。ステップ1バックグラウンド測定のために予め決められているので、セル·インデックスの96時間、15分ごとに測定し、設定してステップ2」ステップを追加します」を選択します。
注：治療のために、高速な反応速度と効果が期待されている、短い間隔でスイープを設定してください。 - 自動的に所定のステップ1を開始するために[スタート]ボタンをクリックとメディアのバックグラウンドインピーダンスを測定。細胞がウェルに添加されると、この値は自動的に各データポイントでのソフトウェアによって減算される。
- 増殖培地中300,000細胞/ mlの先にステップ1.5で調製した）細胞懸濁液を使用する。細胞毒性/神経保護研究および細胞増殖研究のために15,000細胞/ウェルに良く30,000細胞/。 E-プレートを取り出し、細胞毒性/神経保護研究のためにウェルあたり100μlの細胞懸濁液を追加し、50μlの細胞懸濁液及び細胞増殖研究のために、ウェルあたり50μlの増殖培地を追加します。ウェルあたりの細胞数は経験的に、各細胞株のために最適化される必要がある。
- 静かに、細胞のさえメッキ用のE-プレート96を旋回させる。細胞がウェルの底に均等に落ち着く可能にするために、室温で組織培養フード内で30分間、E-プレート96のままにしておきます。
- リアルタイムの細胞分析装置ステーションにおいて、E-プレート96を挿入し、[スケジュールp上のステップ2を開始時代。ソフトウェアのセル·インデックス·ページ上でプロットページにあるセルの曲線と生セル·インデックス·データを表示することによって、実験を通してセル·インデックス値を監視します。
3血清欠乏
- 24時間細胞をプレーティングした後、実験を一時停止、リアルタイム細胞分析装置ステーションからのE-プレート96を削除します。最終濃度×200に - DMEM / F12無血清培地で1,000倍ストックからセカンドメッセンジャー阻害剤を希釈する。それぞれの経路を阻害するため、細胞毒性を開始する前に、神経毒性/神経保護への関与で30分間、試験される第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤で細胞を処理する。ステーションに、E-プレート96を返し、実験細胞指数測定を再開します。
- 30分後、再び実験を一時停止します。ピペット（またはマルチチャンネルピペット）で、E-プレート96のウェルから完全増殖培地を慎重に除去し、接着細胞層を破壊しないように注意しながらウェルの隅にピペットチップのエッジを導くことができる。 200μl/ウェルの無血清DMEM / F12培地（血清欠乏培地）を追加します。細胞の機械的攪拌を最小限にするために細胞培養培地の迅速な交換を確実。
- 最終濃度×200無血清DMEM / F12培地で1,000倍ストックからそれらの神経保護効果について試験されるべき化合物を希釈する。実験計画に従って各ウェルに彼らの神経保護効果について試験する1μlの化合物および第二メッセンジャー経路1μlの阻害剤を追加します。
- 増殖研究のための細胞では培地を変更しないでください。ウェルあたり1μlの治療および増殖培地で培養を継続し、増殖培地中の最終濃度×200に1,000倍の在庫から、試験する化合物を希釈する。
- 以前に設定した96時間、細胞指数測定と15分ごとに継続して実験を再開します。
4。データAnalysis
- 神経毒性のために/神経保護データは、「正規化細胞指数」を選択することで、実験間のばらつきを低減し、プロットページの「時間を正規化」するために薬物治療や培地交換前の最後の時点に細胞指数を正常化。
- 興味のある実験条件のためにプロットページで井戸を強調表示し、正規化された細胞指数曲線をプロットする「追加」をクリックする。 、または時間の関数としての正規化されたセル·インデックス·曲線などのセカンドメッセンジャー阻害の神経毒性/神経保護効果の動態を観察します。
- 増殖に対する効果は神経保護/神経毒性作用に関与しているかどうかを評価するために、時間の関数として増殖培地中で試験薬物治療のための細胞指数曲線を観察します。
- 結果の統計的評価を開始するために、Excelファイルにセルインデックスソフトウェアのページからすべてのセルインデックス時点の実験情報をエクスポートします
- 特定の時点で異なる処理条件の下で細胞指数値の差の統計学的分析のために、エクスポートされたExcelファイルからの各時点での選択セルのインデックス値。統計ソフトウェアを使用してポストホックテストに続いて、分散の一方向または双方向の分析（ANOVA）を用いて選択された時点におけるセルインデックス値を分析する。
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Representative Results
血清枯渇は、リアルタイム細胞分析装置で連続的に監視することができる細胞指数値を、減少につながる
細胞への神経毒性刺激が提示された技術と、特定の神経毒性刺激と勉強細胞型に依存するのダイナミクスをリアルタイムで監視することができるセルインデックス値の減少につながる。 図2の増加を示しています細胞SK-N-SH細胞を、プラトー（緑色のライン）に達するまで増殖培地中で増殖させ、指数および細胞指数の低下が欠乏培地（赤線）の血清を細胞に切り替えた後、新たなより低いレベルで安定化させた。この低下は、血清の離脱による細胞接着の変化を表すことができる。
薬物治療の神経保護効果は、リアルタイム細胞分析装置で連続的に監視することができ
">（前処理）前に、添加化合物の神経保護効果を、同時に（同時処置）で、または神経毒性、刺激後（細胞の回復を示唆する）は、こうしてについての情報を提供する、リアルタイム細胞分析装置で連続的に追跡することができる。神経保護作用の速度と持続時間図3は、2つの5-HT 2Aアゴニストの神経保護のダイナミクスの代表的な結果を示して- 5μMのDOI（ 図3A）をし、20μMのリスリド（ 図3B）はへの細胞の切り替え時に追加された血清欠乏培地。リアルタイムの細胞分析装置は、細胞生存および細胞増殖に対する効果を区別することができ
神経細胞株における神経保護研究における重要な問題は、細胞増殖に対する効果は、細胞生存に対する化合物の観察された効果に寄与するかどうかである。リアルタイムの細胞肛門を持つ増殖に対する効果は、神経毒性を評価する同じE-プレート96で試験することができるyzer。 図4は、増殖に対する効果を示唆することが観察さに寄与しない、SK-N-SH細胞の増殖に対する5μMDOI処理の効果の欠如を示す神経保護効果。
リアルタイムの細胞分析装置は、第二メッセンジャー経路が神経保護/神経毒性作用に関与しているかを決定することができます
受容体の活性化は、セカンドメッセンジャー効果のカスケードを開始する。現在のプロトコルは、それらの阻害剤による前処理を通じてリアルタイムで神経保護/神経毒性作用におけるセカンドメッセンジャーの数の関与をスクリーニングすることができます。二次メッセンジャーの効果細胞生存に対する阻害剤が発音されることができ、多くの場合、時間とともに線形ではないので、その速度を次のは非常に有益である。 図5は、10μMのPHOSの効果を提示するホスファチジルイノシトール3 - キナーゼ（PI3-K）阻害剤LY294002血清欠乏SK-N-SH細胞における細胞生存およびDOIの神経保護に関する。提示されたグラフでは、10μMのLY294002は、血清欠乏にDOIの神経保護効果を防止するだけでなく、それ自身のいくつかの毒性効果を持っていた。
それぞれについて、関連する第二メッセンジャー経路と阻害剤濃度は、化合物が、文献検索により決定することができるテスト。セカンドメッセンジャー阻害剤の濃度は適性が確認されなければならない、必要な場合は、実験的に最適化された。最適化の目標は、依然として効果的にそれぞれの二次メッセンジャーを抑制しつつ、それ自体による細胞指数値に対して最小の効果を有する濃度を選択することである。例として、5-HT 2A受容体に関連することができるいくつかの第二メッセンジャー経路阻害剤は、表1に提示されているこれらの阻害剤は、以前に内線のセロトニン作動性の増大に関与する下流の標的を評価するために使用されているracellularシグナル調節キナーゼリン9。私たちは確認した後、私たちの実験的パラダイム7のためのそれらの濃度を最適化するいくつかのケースでは5-HT 2A受容体アゴニストによる神経保護に関与する下流の経路を評価するためにそれらの有用性を示している。
図1に、現在のプロトコルで提示ワークフローの模式図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セルインデックス。血清剥奪上の血清欠乏の図2。影響 （赤い線）、増殖培地中の細胞指数値の緩やかな増加（緑の線）と比較して、細胞指数の急激な減少を誘導する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞保護薬（この実験での5-HT 2Aアゴニスト DOI（5μM）（A）（マゼンタの線）とリスリド（20μM）（Bは血清枯渇後のセルインデックス上の5-HT 2Aアゴニストの図3。効果。治療（）濃マゼンタライン）部分的に血清欠乏（赤線）減少し、細胞指数値を復元します。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
細胞増殖の過程で、図4セルのインデックス値。（現在の実験5μMのDOIでの）増殖培地中の薬を用いた治療（マゼンタライン）は、車両処理（緑色の線）と比較して、増殖への影響を評価することができます。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
図5に第二のメッセンジャー阻害剤は、それ自体で細胞の生存に影響を及ぼし得るとOBSE上の第2のメッセンジャー経路の効果をスクリーニングするために使用することができ神経保護をrved。この実験では、細胞を10μMのPI3-K阻害剤LY294002で前処理し、1μMのDOI（青線）で処理または前処理し、1μMのDOI（マゼンタライン）、車両（赤線）で治療されて剥奪血清を行った10μMのLY294002で、車両（黒線）で処理した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：リアルタイム細胞分析実験で私たちが使用する5-HT 2A受容体下流の経路およびその濃度に関連することができるセカンドメッセンジャー阻害剤の例は、。
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Discussion
現在のプロトコルは、連続してラベルを含まない条件下で神経細胞株における化合物の神経保護/神経毒性作用を評価し、効果に関与するセカンドメッセンジャー経路への洞察を得るために、リアルタイム細胞分析装置の有用性を示す。
細胞毒性及び細胞増殖に対する薬物の効果を研究するためのリアルタイム細胞分析の効用が一般的に認識されていても、唯一のいくつかの研究は、神経関連細胞型においてそれを使用している。ガラントらは 、示されているが、私たちは、以前はそれが神経毒性を評価するために使用できる、ヒト神経芽細胞腫SK-N-SH細胞での5-HT 2A受容体アゴニストの神経保護を監視するリアルタイムの細胞分析装置の有用性を示しているヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞7,10におけるβ-アミロイドペプチド。最近の研究は、リアルタイム細胞分析装置は、測定されつつ確実に増殖および細胞死、細胞ことを示唆しているeuronal細胞株および神経前駆細胞は、一次ニューロンにおける細胞死を評価する上で、その精度は5発作の重症度に依存する。重要なことは、リアルタイム細胞分析装置システムに用いられる交流電流は、マイクロアンペアの電流を生成する、非常に低い大きさである。これらの電流はよくニューロンなどの興奮性細胞の閾値電位以下である。リアルタイムセルアナライザーシステムは、したがって、細胞接着の程度は非常に重要である、E-プレート96のウェルの底面からのインピーダンス測定値に依存している。これは、よりよい遵守のための細胞外マトリックスタンパク質とE-プレートウェルのコーティングのさらなる最適化は、一次ニューロンを用いて得られた結果を改善する可能性がある。
現在の原稿は、神経保護にかかわる第二メッセンジャー経路を描写するために、リアルタイム細胞分析システムを使用しての新しいアプローチを示しています。私たちのプロトコルは、第二メッセの化学的阻害に依存しているngersは神経保護剤の作用に関与していると仮説を立てた。提示された実験パラダイムに適し表1は、一例として5-HT 2A受容体に関連することができるいくつかの一般的に使用される第二メッセンジャー経路阻害剤、およびそれらの濃度。この実験的なデザインは、相補的なアプローチを通じて、より詳細な研究のための下流の標的を選択するために、潜在的に関連第二メッセンジャー経路の迅速なスクリーニングを可能にします。
リアルタイム細胞分析装置の重要な利点はまた、増殖に対する影響が観察された神経保護効果の一部であるかどうかを評価する能力である。代わりに毒性アッセイにおける一次ニューロンの神経細胞株を使用することで、低コスト、簡単にアクセスし、動物実験の必要がないように、いくつかの利点を提供しています。しかし、一次ニューロンとは対照的に、神経細胞株が増殖するという事実に起因し、増殖に対する潜在的な影響は、中に制御される必要がある神経毒性アッセイ。リアルタイムの細胞分析装置は、同じ実験E-プレート96は、この制御を行うことを提供する機会が、実験設計を容易にする。
いくつかの技術的パラメータは、リアルタイム細胞分析装置を用いた実験において考慮される必要がある。ウェル当たりめっきされるべき細胞の数は、各試験された細胞型について滴定実験を通して経験的に決定されるべきである。細胞毒性及び増殖治療は、全ての細胞の完全な接着を可能にするために、細胞培養の開始の24時間後に開始される。細胞毒性実験において最適の結果、細胞が65から70パーセントの集密度に達したときに開始するが、現在のプロトコルで得られた。増殖実験のために低い細胞コンフルエンス、増殖曲線上の薬物の効果を追跡する（20-30％）が好ましい。
現在のプロトコル血清欠乏神経毒性パラダイムを近づけるために、その堅牢性、使用、およびユーティリティの容易に提供されるには栄養欠乏は、開発、急性脳や神経外傷および神経変性11の間には重要である神経細胞死を媒介する。しかし、神経毒性パラダイムの広い範囲は、リアルタイム細胞分析装置システムと共に使用することができる。ここでは、細胞毒性の時点で細胞保護剤との同時治療が提供される。しかし、毒性事象（細胞回復を評価する）の後に前処理または治療はまた、試験される化合物に応じて使用することができる。
全体として、現在のプロトコルは、連続してラベルフリー神経細胞株における神経毒性および神経保護を評価し、これらの効果に関与する下流の経路についての洞察を得るために、リアルタイム細胞分析システムの有用性を示唆する。
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Disclosures
現在のビデオ·記事の出版費用は、「ACEA Biosciences社」が主催した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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