Abstract
Muchos trastornos relacionados con el cerebro tienen la muerte celular neuronal implicado en su fisiopatología. Mejora en modelos in vitro para estudiar los efectos neuroprotectores o neurotóxicos de las drogas y las vías descendentes involucradas ayudaría a aumentar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares de neuroprotección / neurotoxicidad y potencialmente podría facilitar el desarrollo de fármacos. Sin embargo, muchos ensayos de toxicidad in vitro existentes tienen limitaciones importantes - más evaluar la neurotoxicidad y neuroprotección en un solo punto de tiempo, no permitiendo observar la evolución temporal y la cinética del efecto. Además, la oportunidad de recoger información sobre las vías de señalización corriente abajo implicados en la neuroprotección en tiempo real sería de gran importancia. En el protocolo actual se describe el uso de un tiempo real basados en la impedancia analizador de células para determinar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT 2A) agonistas del receptor en una línea celular neuronal menores de etiqueta libre y en tiempo real Conditiones utilizando mediciones de impedancia. Además, se demuestra que los inhibidores de las vías de segundo mensajero se pueden utilizar para delinear las moléculas de aguas abajo implicadas en el efecto neuroprotector. También se describe la utilidad de esta técnica para determinar si un efecto sobre la proliferación celular contribuye a un efecto neuroprotector observado. El sistema utiliza placas microelectrónicos especiales denominados E-planchas que contienen alternando microelectrodos de oro en la superficie inferior de los pozos, que sirven como sensores celulares. La lectura de impedancia se modifica por el número de células adherentes, la viabilidad celular, la morfología y la adhesión. Un parámetro adimensional llamado Índice de Células se deriva de las mediciones de impedancia eléctrica y se utiliza para representar el estado celular. En general, el tiempo real basados en la impedancia analizador de células permite en tiempo real, la evaluación de la etiqueta libre de la neuroprotección y la neurotoxicidad, y la evaluación de la implicación de las rutas segundo mensajero, contribuyendo a másevaluación detallada y de alto rendimiento de potenciales compuestos neuroprotectores in vitro, para la selección de candidatos terapéuticos.
Introduction
La muerte celular neuronal desempeña un papel fundamental en la fisiopatología de muchos trastornos relacionados con el cerebro 1. La disponibilidad de información confiable y de alto rendimiento en los ensayos de toxicidad in vitro es fundamental para tener un mejor conocimiento de los mecanismos de neurotoxicidad y para ayudar a seleccionar moléculas neuroprotectoras como candidatos terapéuticos en el desarrollo de fármacos 2. Sin embargo, hay muchas limitaciones a la mayoría ampliamente utilizado en assays.They neurotoxicidad vitro evaluar la neurotoxicidad / neuroprotección en un solo punto de tiempo no permitir la resolución cinética; a menudo utilizan etiquetas o sonda que puede interferir con las vías de señalización y limitar los estudios adicionales en la misma población de células, y son a menudo mano de obra, y en muchos casos no proporcionan una visión mecanicista. En el presente estudio se demuestra la utilidad de un tiempo real basados en la impedancia analizador de células para determinar la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal en tiempo real y bajo libre de etiquetascondiciones y para proporcionar información sobre los mecanismos descendentes a través del análisis de las vías de segundos mensajeros involucrados en el efecto.
Estudios previos han confirmado la validez del analizador de células en tiempo real para determinar la citotoxicidad así como los efectos sobre la proliferación celular en líneas celulares en comparación con las técnicas estándar 3,4,5,6. Por ejemplo, se observó una buena correlación entre las lecturas de la viabilidad celular WST-1 ensayo estándar y los valores de índice de células en varios puntos de tiempo bajo condiciones de proliferación basal y después de dos paradigmas diferentes tóxicos en células HeLa 3. En las células A549 y MDA-MB-231 proliferación y citotoxicidad provocado con el estabilizador de microtúbulos paclitaxel mostraron valores muy similares cuando evaluada por mediciones del índice de la célula y de la forma estándar utilizado sulforrodamina B (SRB) de ensayo 4. En la línea celular neuronal de las neuronas del hipocampo inmortalizadas HT-22 Cell mediciones de índice fueron validados por su capacidad to detectar la proliferación celular, la citotoxicidad glutamato y citoprotección contra el ampliamente utilizado de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 5. En el mismo estudio, los resultados del ensayo de MTT y las mediciones de índice de la célula también una buena correlación en la medición de la proliferación de las células progenitoras neuronales, citotoxicidad después de la privación de factores de crecimiento y de rescate de la citotoxicidad por el pan-caspasa inhibidor QVD 5. Inducida en células NIH 3T3 por vandetanib (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico) Citotoxicidad mostró resultados similares medidos con los valores de índice de la célula o ensayo de captación de rojo neutro 6.
Recientemente, hemos utilizado el sistema analizador de células en tiempo real para evaluar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT 2A) agonista del receptor de clorhidrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI) en una línea celular neuronal ( células SK-N-SH) y se seleccionaron para la participación de second vías de mensajería a través de monitorizar el efecto de la inhibición química de la neuroprotección observada 7. Curiosamente, el receptor 5-HT 2A tiene agonistas tanto alucinógenas y no alucinógeno (como DOI y lisurida, respectivamente), que pueden activar las dos vías de segundos mensajeros comunes y distintas 8.
Las ventajas de la técnica presentada son que permite recoger información en tiempo real sobre la supervivencia celular en el transcurso de días, para delinear las vías de segundos mensajeros implicados, para evaluar la posible contribución de los efectos de proliferación a la neuroprotección, y para seleccionar un tiempo óptimo para estudios de punto final adicionales en la misma población de células. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo en el protocolo actual se presenta en la Figura 1.
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Protocol
1. Preparación
- Coloque la estación del analizador de células en tiempo real en un incubador de cultivo de tejido fijado en 37 ° C y con 5% de CO 2. Llevar a cabo todas las manipulaciones de cultivo de células y tratamientos farmacológicos en una campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles.
- NOTA: Neuronal líneas celulares que requieren diferentes ajustes de temperatura en comparación con las condiciones estándar para la cultura, deben ajustarse en consecuencia. Para las líneas de células débilmente adherentes, utilizar agentes de revestimiento para facilitar la interacción de las células con los microelectrodos de oro en el fondo de los pocillos de la placa de E-96.
- Preparar soluciones 1,000x de stock de los compuestos farmacológicos para el tratamiento del cultivo celular (agentes neuroprotectores o inhibidores de la segunda vías mensajeras en el disolvente apropiado - dimetilsulfóxido o agua estéril) y almacenarlos a -20 ° C. Utilice el disolvente como vehículo en los siguientes tratamientos.
- Células de cultivo de neuroblastoma humano SK-N-SH en DMEM / F12 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (medio de proliferación) en matraces de cultivo celular con 175 cm 2 de superficie a una densidad de aproximadamente 75%. Mantenga el número de pases celulares dentro de un rango (de aproximadamente 10 pasajes) para determinar la coherencia entre los experimentos en términos de tasa de proliferación celular y la respuesta a la citotoxicidad. Se prefieren los números de pases bajos.
- Se lava la capa de células SK-N-SH adherente con PBS, y trypsinize con solución de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Centrifugar las células a 170 × g durante 5 min para eliminar la tripsina. Resuspender las células en 10 ml de medio de proliferación. Contar las células con contador de células Cetro y ajustar el número de células a 300.000 células / ml diluyendo las células con medio de proliferación.
2. Plating y proliferación de las células SK-N-SH
- Añadir medio de proliferación 100 l a cada pocillo de la placa de E-96 y se deja durante 30 minutos en la campana de cultivo de tejidos a RT se equilibre. Inserte el E-PlaTE 96 en el tiempo real estación analizador de células en el incubador de CO2 a 37 ° C.
- Iniciar el software analizador de células en tiempo real. En la página Layout seleccionar los pozos incluidos en el experimento y entran en los cuadros de edición de la información sobre el tipo de células, el número de células, los nombres y las concentraciones de los compuestos químicos utilizados para el tratamiento de células.
NOTA: Para los fines de este protocolo se recomiendan al menos 4 réplicas para cada tratamiento. - En la página de software Horario determinar "Pasos" incluida en el experimento, seleccionando el número de barridos de medición Índice de Células y el intervalo entre barridos para cada paso. Desde el paso 1 está predeterminado para la medida de fondo, seleccione "Agregar un paso" y establecer el paso 2 para medir el Índice de Células cada 15 minutos durante 96 horas.
NOTA: Para los tratamientos, en los que se espera que los efectos con cinética rápida, establecen barridos a intervalos más cortos. - Haga clic en Iniciar para iniciar el paso predeterminado de forma automática 1y medir la impedancia de fondo de los medios de comunicación. Este valor se resta automáticamente por el software en cada punto de datos una vez que se añadieron las células a los pocillos.
- Utilice el previamente preparado en el paso 1.5) suspensión celular de 300.000 células / ml en medio de proliferación. 30.000 células / pocillo para la toxicidad celular / estudios de neuroprotección y 15.000 células / pocillo para estudios de proliferación celular. Saque el E-Plate y añadir 100 l de suspensión celular por pocillo durante toxicidad celular / estudios de neuroprotección y añadir 50 l de suspensión celular y medio de proliferación de 50 l por pocillo de estudios de proliferación celular. El número de células sembradas por pocillo debe ser optimizado para cada línea celular empíricamente.
- Remover con suavidad la E-Plate 96, incluso para chapado de las células. Deje el E-Plate 96 durante 30 min en la campana de cultivo de tejido a temperatura ambiente para permitir que las células se asientan de manera uniforme a la parte inferior de los pocillos.
- Inserte el E-Plate 96 en la estación de analizador de células en tiempo real y comenzar el paso 2 de la Lista pla edad. Monitorear los valores del Índice Cell largo del experimento al ver las curvas de células en la página Terreno y los datos del índice de la célula primas en la página Índice de Células del software.
3. Suero privación
- 24 horas después de la siembra de las células, una pausa en el experimento, y quitar la E-96 Placa de la estación de analizador de células en tiempo real. Diluir inhibidores de segundo mensajero de las existencias 1,000x con medio libre de suero / DMEM F12 - a 200 veces la concentración final. Tratar las células con 1 mu l inhibidores de las vías de segundos mensajeros que se realizarán las pruebas de su participación en la neurotoxicidad / neuroprotección 30 minutos antes de iniciar la citotoxicidad, de inhibir las respectivas vías. Devuelva el E-Placa 96 a la estación y reanudar mediciones experimentales Índice Cell.
- Después de 30 minutos en pausa el experimento de nuevo. Retire con cuidado medio de proliferación plenamente de la E-Placa 96 pocillos con una pipeta (o una pipeta multicanal), teniendo cuidado de no perturbar la capa de células adherentesdirigiendo el borde de la punta de la pipeta a la esquina del pozo. Añadir 200 l / pocillo de DMEM libre de suero / F12 (medio de privación de suero). Asegúrese de intercambio rápido de medio de cultivo celular para reducir al mínimo la agitación mecánica de las células.
- Diluir compuestos a ensayar por sus efectos neuroprotectores de 1.000X de stock con medio DMEM / F12 libre de suero a 200 veces la concentración final. Añadir 1 mu l compuestos a ensayar por sus efectos neuroprotectores y 1 mu l inhibidores de las vías de segundos mensajeros en los pocillos individuales de acuerdo con el plan experimental.
- En las células para estudios de proliferación no cambie medio. Diluir compuestos a ensayar desde 1,000X de stock a 200 veces la concentración final en el medio de proliferación, el tratamiento con 1 l por pocillo y continuar a la cultura en medio de proliferación.
- Reanudar el experimento para continuar con Cell mediciones de índice cada 15 minutos durante 96 horas según lo establecido previamente.
4. datos Análisis
- Para neurotoxicidad / datos neuroprotección normalizan Índice de Células hasta el último punto de tiempo antes del tratamiento farmacológico o cambio de medio para reducir la variación entre los experimentos seleccionando "normalizado Índice de Células" y "normalizar la hora" en la página Mapa.
- Destacar los pozos en la página Parcela en las condiciones experimentales de interés y haga clic en "Añadir" para trazar las curvas de índice de células normalizadas. Observar la cinética del efecto neurotóxico / neuroprotector, o la inhibición de segundo mensajeros como curvas de índice de células normalizado como una función del tiempo.
- Tenga en cuenta las curvas de índice de la célula para los tratamientos con fármacos ensayados en medio de proliferación como una función de tiempo para evaluar si un efecto sobre la proliferación está implicado en el efecto neuroprotector / neurotóxico.
- Exportar la información experimental para todos los puntos de la célula de tiempo Índice de la página de software Índice de Células en un archivo de Excel para iniciar la evaluación estadística de los resultados
- Para el análisis estadístico de las diferencias en los valores de índice de células en diferentes condiciones de tratamiento en puntos específicos de tiempo, seleccione los valores de índice de la célula en respectivos puntos de tiempo desde el archivo exportado Excel. Analizar los valores del índice de la célula de los puntos de tiempo seleccionados con una sola vía o de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba post-hoc utilizando el software estadístico.
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Representative Results
Suero privación conduce a una disminución en los valores de índice de células, que pueden ser monitoreados continuamente con el analizador de células en tiempo real
Estímulos neurotóxicos a las células conducen a una disminución en los valores de índice de células, que puede ser monitoreado en tiempo real con la técnica presentada y la dinámica de los cuales depende de los estímulos neurotóxicos específico y el tipo de célula estudiado. Figura 2 demuestra el aumento en Índice de Células cuando las células SK-N-SH se cultivan en medio de proliferación hasta alcanzar una meseta (línea verde) y la caída del índice de la célula seguido por una estabilización en los nuevos niveles más bajos después de cambiar las células a la privación de medio de suero (línea roja). Esta caída puede representar un cambio en la adhesión celular debido a la retirada del suero.
Efectos neuroprotectores de tratamiento de drogas pueden ser monitorizados continuamente con el analizador de células en tiempo real
"> El efecto neuroprotector de los compuestos añadidos antes (pre-tratamiento), al mismo tiempo (co-tratamiento) o después de estímulos neurotóxicos (lo que sugiere la recuperación celular) también se puede seguir continuamente con el analizador de células en tiempo real, proporcionando así información sobre . la velocidad y duración del efecto neuroprotector La Figura 3 muestra resultados representativos de la dinámica de la neuroprotección de dos agonistas 5-HT 2A - 5 M DOI (Figura 3A) y 20 lisurida mu M (Figura 3B) que se añade en el momento de conmutación de células en medio de privación de suero.El analizador de células en tiempo real permite diferenciar entre los efectos sobre la supervivencia celular y la proliferación celular
Una cuestión importante en los estudios de neuroprotección en líneas de células neuronales es si un efecto sobre la proliferación celular contribuye al efecto compuesto observada en la supervivencia celular. Con el anal de células en tiempo realYzer el efecto sobre la proliferación se puede probar en la misma E-Plate 96 neurotoxicidad evaluar. Figura 4 muestra la falta de efecto de 5 mM tratamiento DOI sobre la proliferación de células SK-N-SH, lo que sugiere un efecto sobre la proliferación no contribuye a la observada efecto neuroprotector.
El analizador de células en tiempo real permite determinar qué vías de segundos mensajeros están implicados en efectos neuroprotectores / neurotóxicos
La activación del receptor inicia una cascada de segundos mensajeros efectos. El protocolo actual permite detectar la implicación de un número de segundos mensajeros en un efecto neuroprotector / neurotóxico en tiempo real a través de pretratamiento con sus inhibidores. Dado que el efecto de los inhibidores de segundos mensajeros en la supervivencia de células pueden ser pronunciadas, y es en muchos casos no lineal con el tiempo, a raíz de su cinética es muy informativo. Figura 5 presenta el efecto de phos 10 Mphatidylinositol 3-quinasa (PI3-K) inhibidor LY294002 sobre la supervivencia celular y el DOI neuroprotección en las células SK-N-SH privadas de suero. En el gráfico presentado, 10 M LY294002 impedido el efecto neuroprotector de DOI en la privación de suero, pero también tenía algún efecto tóxico de su propia.
Vías y de segundo mensajero relevantes concentraciones de inhibidor para cada compuesto ensayado se pueden determinar a través de búsqueda bibliográfica. Concentraciones idoneidad de los inhibidores de segundos mensajeros que se ha verificado, y si es necesario optimizada experimentalmente. El objetivo de la optimización es seleccionar una concentración, que tiene un efecto mínimo en los valores de índice de células por sí mismo, mientras que todavía inhibir eficazmente el respectivo segundo mensajero. A modo de ejemplo, algunos inhibidores de vías de segundos mensajeros, que pueden ser de interés para el receptor 5-HT 2A, se presentan en la Tabla 1 Estos inhibidores se han utilizado previamente para evaluar objetivos de abajo implicados en incremento serotoninérgico del extracellular quinasa regulada por señal de fosforilación 9. Hemos demostrado su utilidad para evaluar las vías aguas abajo implicados en la neuroprotección por 5-HT agonistas de los receptores 2A después de confirmar y en algunos casos la optimización de sus concentraciones para nuestro paradigma experimental 7.
Figura 1 Diagrama esquemático del flujo de trabajo presentado en el protocolo actual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 Efecto de la privación de suero en el Índice de la célula. Privación de suero (línea roja) induce una rápida disminución en el Índice de Células, en comparación con el aumento gradual de los valores de índice de células en medio de proliferación (línea verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 Efecto de los agonistas de 5-HT 2A en el Índice de Células después de la privación de suero. Tratamiento con fármacos citoprotectores (en este experimento agonistas 5-HT 2A DOI (5 M) (A) (línea magenta) y lisurida (20 M) (B ) (línea de color magenta oscuro) restaura parcialmente los valores de índice de la célula disminuyó en la privación de suero (línea roja). Por favor, haga clic enaquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. celulares valores del índice en el curso de la proliferación celular. Tratamiento con fármacos en medio de proliferación (en el actual experimento 5 M DOI) (línea magenta) permite evaluar el efecto sobre la proliferación en comparación con el tratamiento con vehículo (línea verde). Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. inhibidores de segundos mensajeros pueden afectar la supervivencia celular por su cuenta y se puede utilizar para detectar el efecto de las vías de segundos mensajeros en OBSEneuroprotección rved. En este experimento las células fueron sometidas a privación de suero que está siendo tratado con vehículo (línea roja), 1 M DOI (línea magenta), pretratado con 10 mM inhibidor de PI3-K LY294002 y se trató con 1 M DOI (línea azul) o pretratada con 10 M LY294002 y tratados con vehículo (línea de color negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Ejemplos de inhibidores de segundo mensajero, que pueden ser de interés para los receptores 5-HT 2A vías descendentes y sus concentraciones utilizadas por nosotros en tiempo real los experimentos analizador de células.
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Discussion
El protocolo actual presenta la utilidad de un analizador de células en tiempo real para evaluar de manera continua y en condiciones de etiqueta libre de los efectos neuroprotectores / neurotóxicos de compuestos en líneas de células neuronales y para profundizar en los segundos mensajeros vías implicadas en el efecto.
A pesar de que la utilidad del analizador de células en tiempo real para estudiar la citotoxicidad y efectos de las drogas sobre la proliferación celular es generalmente reconocido, sólo unos pocos estudios han utilizado en tipos de células neuronales relacionados. Hemos demostrado anteriormente la utilidad del analizador de células en tiempo real para supervisar la neuroprotección de un agonista del receptor 5-HT2A en células de neuroblastoma humano SK-N-SH, mientras que Galante et al., Han demostrado que puede usarse para evaluar la neurotoxicidad de péptidos beta-amiloides en el neuroblastoma humano SH-SY5Y células 7,10. Un estudio reciente ha sugerido que mientras midió el analizador de células en tiempo real célula de forma fiable la proliferación y la muerte celular en unlínea celular euronal y las células precursoras neuronales, su precisión en la evaluación de la muerte celular en las neuronas primarias dependían de la gravedad de la agresión 5. Es importante destacar que la corriente alterna utilizado para el sistema analizador de células en tiempo real es de magnitud muy baja, generando corrientes de microamperios. Estas corrientes son muy por debajo del potencial umbral de las células excitables como las neuronas. El sistema analizador de células en tiempo real se basa en mediciones de impedancia desde la superficie inferior de los 96 pocillos E-Plate, por lo tanto el grado de adherencia de las células es de importancia crítica. Es posible que una mayor optimización de recubrimiento de los pocillos E-Plate con proteínas de la matriz extracelular para una mejor adherencia puede mejorar los resultados obtenidos con las neuronas primarias.
El manuscrito actual demuestra un novedoso enfoque de utilizar el sistema analizador de células en tiempo real para delinear las vías de segundos mensajeros implicados en la neuroprotección. Nuestro protocolo se basa en la inhibición química de segundo messededos hipótesis de participar en la acción de un agente neuroprotector. La Tabla 1 enumera algunos segundos inhibidores de vías de mensajería comúnmente utilizados, que pueden ser relevantes para el receptor 5-HT 2A como un ejemplo, y sus concentraciones adecuadas para el paradigma experimental presentado. Este diseño experimental permite la detección rápida de las vías de segundo mensajero potencialmente pertinentes, para seleccionar objetivos de abajo para estudios más detallados a través de enfoques complementarios.
Una ventaja importante del analizador de células en tiempo real es también la capacidad de evaluar si un efecto sobre la proliferación es una parte de un efecto neuroprotector observado. El uso de líneas de células neuronales en lugar de las neuronas primarias en los ensayos de toxicidad ofrece algunas ventajas, como menor costo, fácil acceso y sin necesidad de experimentación animal. Sin embargo, debido al hecho de que las líneas de células neuronales en contraste con las neuronas primarias proliferan, efecto potencial sobre la proliferación necesita ser controlado en elensayos de neurotoxicidad. La oportunidad que el analizador de células en tiempo real ofrece para llevar a cabo este control en el mismo E-placa experimental 96, facilita el diseño experimental.
Varios parámetros técnicos necesitan ser considerados en los experimentos con el analizador de células en tiempo real. El número de células a ser plateado por pocillo debe ser determinada empíricamente mediante la experimentación de titulación para cada tipo de célula probado. La citotoxicidad y proliferación de tratamiento son todos comenzaron después de 24 h de inicio del cultivo celular, para permitir la adherencia completa de las células. Los resultados óptimos en experimentos de citotoxicidad a partir cuando las células han alcanzado el 65-70% de confluencia fueron obtenidos en el protocolo actual. Para los experimentos de proliferación se prefiere inferior confluencia celular (20-30%) para seguir el efecto de un fármaco en una curva de proliferación.
En el suero protocolo actual paradigma neurotoxicidad privación se presenta debido a su robustez, facilidad de uso y utilidad a la aproximaciónprivación trófica mediada la muerte neuronal, lo cual es importante durante el desarrollo, cerebral agudo o trauma del nervio, y la neurodegeneración 11. Sin embargo, una amplia gama de paradigmas de neurotoxicidad se puede utilizar con el sistema analizador de células en tiempo real. Aquí, se presenta co-tratamiento con un agente citoprotector en el momento de la citotoxicidad. Sin embargo, el pretratamiento o tratamiento después de que el (la evaluación de la recuperación de células) de eventos tóxicos también se pueden emplear dependiendo de los compuestos que se probaron.
En general, el protocolo actual sugiere la utilidad de un sistema analizador de células en tiempo real para evaluar la neurotoxicidad y neuroprotección en líneas de células neuronales de forma continua y libre de etiquetas y para ganar la penetración en las vías aguas abajo implicados en estos efectos.
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Disclosures
Costos de publicación para el video-artículo actual fueron patrocinados por "ACEA Biosciences".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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