Abstract
Многие мозговые нарушения, связанные с есть гибель нейронов, участвующих в их патофизиологии. Улучшенная в моделях пробирке изучать нейропротекторные или нейротоксическое действие препаратов и вниз по течению путей, участвующих поможет разобраться в молекулярных механизмах нейропротекции / нейротоксичности и потенциально может способствовать развитию наркотиков. Тем не менее, многие существующие анализы токсичности в пробирке иметь серьезные ограничения - наиболее оценить нейротоксичность и нейропротекцию в одной точке времени, не позволяя наблюдать во времени процесса и кинетики эффекта. Кроме того, возможность для сбора информации о последующих сигнальных путей, участвующих в нейропротекции в реальном времени будет иметь большое значение. В текущем протоколе мы опишем использование в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить нейропротекторные эффекты серотонина 2А (5-HT 2A) агонистов рецепторов в нейронной клеточной линии под этикеткой без и в режиме реального времени Кондитионы с помощью измерения импеданса. Кроме того, показано, что ингибиторы второго путей мессенджеров может быть использован, чтобы очертить ниже по течению молекул, участвующих в нейропротекторного эффекта. Мы также описываем полезность этого метода, чтобы определить, способствует ли действие на пролиферацию клеток к наблюдаемому нейропротекторного эффекта. Система использует специальные микроэлектронных пластин, называемых Е-листы, содержащие чередующихся золото микроэлектродов массивы на нижней поверхности лунок, выступающей в качестве датчиков клеток. Импеданс считывания изменяется по количеству прикрепленных клеток, жизнеспособность клеток, морфологии и адгезии. Безразмерный параметр называется сотовый Индекс получают из измерения электрического сопротивления и используется для представления состояния клеток. В целом, в реальном времени сопротивление основе анализатор клеток позволяет в режиме реального времени, без наклеек оценки нейропротекции и нейротоксичности, и оценки второй участия посыльного путей, способствуя болееПодробное и высокой пропускной оценка потенциальных нейропротекторами в пробирке, для выбора терапевтических кандидатов.
Introduction
Гибели нейронов играет важную роль в патофизиологии многих мозга расстройств, связанных с 1. Наличие надежной и высокой пропускной в пробирке анализов токсичности имеет решающее значение для достичь лучшего понимания тонкостей механизмов нейротоксичности и помогут при выборе нейропротекторные молекулы в качестве терапевтических кандидатов в разработке лекарственных средств 2. Тем не менее, существует множество ограничений, чтобы наиболее широко используемые в пробирке нейротоксичности assays.They оценить поражение нервной / нейропротекцию в одной временной точке, не позволяя кинетическую разрешение; часто используют этикетку или зонд, который может вмешиваться в сигнальных путей и ограничить дополнительные исследования в той же популяции клеток, и часто трудоемкий, и во многих случаях не обеспечивают механистический понимание. В настоящем исследовании мы показали полезность в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить, нейротоксичность и нейропротекцию в нейронной клеточной линии в режиме реального времени и под этикеткой бесплатноусловия и обеспечить понимание последующих механизмов, с помощью анализа второго путей мессенджеров, участвующих в эффекте.
Предыдущие исследования подтвердили обоснованность анализатора в режиме реального времени клеток, чтобы определить цитотоксичность, а также воздействие на пролиферацию клеток в линии клеток по сравнению со стандартными методиками 3,4,5,6. Например, хорошая корреляция наблюдалась между показаниями стандартного жизнеспособность клеток WST-1 анализа и ценностей Сотовые Индекс в нескольких временных точках под базальных условиях распространения и после двух различных токсичных парадигм в HeLa клеток 3. В A549 и MDA-MB-231 клеток пролиферации и цитотоксичности, спровоцированной с микротрубочками стабилизатора паклитаксела показали очень близкие значения, когда оценивали путем измерения индекса клеток и стандартно используется сульфородамина В (SRB) анализ 4. В нейронной клеточной линии увековечены нейронов гиппокампа НТ-22 Сотовые измерения индекса были подтверждены на их способность тO обнаружить пролиферацию клеток, цитотоксичность и глутамата цитопротекцию против широко используемого 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразоли-бромид (МТТ) 5. В том же исследовании Результаты анализа МТТ и измерения Указатель Сотовый также хорошо коррелирует измерения нейронов пролиферацию клеток-предшественников, цитотоксичность после факторов роста лишения и спасения цитотоксичности по пан-ингибитор каспазы QVD 5. Цитотоксичность индуцированных в клетках NIH 3Т3 по Vandetanib (роста эндотелия сосудов рецептора фактора и ингибитора рецептора эпидермального фактора роста) показали сходные результаты измеренных значений индекса с клеткой или поглощение нейтрального красного анализа 6.
Недавно мы использовали систему анализатора клеток в реальном времени для оценки нейропротекторное действие серотонина 2A агонист рецептора (2A 5-НТ) (±) -2,5-диметокси-4-iodoamphetamine гидрохлорид (DOI) в нейрональной клеточной линии ( SK-N-SH клетки) и скрининг для вовлечения СЕКОой посыльного пути через контроль эффективности их химического ингибирования на наблюдаемой нейропротекции 7. Интересно, что 5-HT 2A рецепторов имеет как галлюциногенные и nonhallucinogenic агонистов (как DOI и лизурид, соответственно), которые могут активировать как общие и различные вторичного мессенджера пути 8.
Преимущества представленной техники в том, что она позволяет собирать информацию о выживаемости клеток в реальном времени в ходе дней, чтобы очертить участие второго посыльного пути, чтобы оценить возможный вклад распространения эффектов нейропротекции, и выбрать оптимальное время Для дополнительных конечных точек исследований по той же клеточной популяции. Принципиальная схема рабочего процесса в текущем протоколе представлена на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка
- Поместите станцию в реальном времени анализатора клетки в культуре ткани инкубатор при 37 ° С и 5% СО 2. Выполняйте все обращения для культивирования клеток и фармакологические методы лечения в капот культуры ткани в стерильных условиях.
- ПРИМЕЧАНИЕ: нейронов клеточные линии, требующие различные настройки температуры по сравнению со стандартными условиями для культуры, должны быть соответствующим образом скорректированы. Для слабо прилипшие клеточных линий, использовать покрывающие агенты, чтобы облегчить взаимодействие клеток с золотыми микроэлектродов в нижней части лунки Е-плиты 96.
- Подготовка 1,000X исходные растворы фармакологических соединений для лечения клеточной культуры (нейропротекторов и второй ингибиторы мессенджеров путей в соответствующем растворителе - диметилсульфоксид или стерильной воды) и хранить их при -20 ° С. Используйте растворитель, как автомобиль в следующих процедур.
- Культура человеческого нейробластомы SK-N-SH клетки в DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (среда) пролиферацию клеток в культуральных колбах с 175 см 2 поверхности с плотностью около 75%. Держите количество проход клеток в диапазоне (около 10 проходов), чтобы установить соответствие между экспериментов с точки зрения скорости пролиферации клеток и ответ на цитотоксичность. Предпочтительны низкие значения прохождение.
- Промыть клейкий слой SK-N-SH клеток с PBS, и Trypsinize с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Центрифуга клетки при 170 × г в течение 5 мин для удаления трипсин. Ресуспендируют клеток в 10 мл пролиферации среды. Граф клеток с прилавка скипетр клеток и регулировать количество клеток в 300 000 клеток / мл, разбавляя клетки с распространением среды.
2 Покрытие и размножение SK-N-SH клеток
- Добавить 100 мкл распространения среды в каждую лунку по E-плиты 96 и оставить его на 30 минут в капот культуры ткани при комнатной температуре, чтобы уравновесить. Вставьте E-PLAТе 96 в режиме реального времени анализатора клеток станции в СО 2-инкубаторе при 37 ° С.
- Запустите программу анализатора клеток в реальном времени. На странице Макет выберите скважины включены в эксперименте и введите в поля ввода информации о типе клеток, количества клеток, имен и концентраций химических соединений, используемых для лечения клеток.
Примечание: Для целей данного протокола по крайней мере, 4 повтора рекомендуются для каждой обработки. - На странице программного Расписание определить «Шаги», включенный в эксперименте, выбрав количество зачисток измерительной ячейки Index и интервал между рабочими циклами для каждого шага. Поскольку Шаг 1 предопределено для измерения фона, выберите "Добавить шаг" и установите Шаг 2 для измерения индекса ячейки каждые 15 мин в течение 96 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения, в котором, как ожидается, эффекты с быстрой кинетики, установить зачисток на более короткие промежутки времени. - Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать автоматически заданную Шаг 1и измерить фоновый импеданс СМИ. Это значение автоматически вычитают с помощью программного обеспечения в каждой точке данных, как только клетки добавляли в лунки.
- С помощью ранее полученного на стадии 1.5) клеточной суспензии из 300000 клеток / мл в среде распространения. 30000 клеток / лунку для клеточной токсичности / нейропротекция исследований и 15000 клеток / лунку для исследований клеточной пролиферации. Выньте E-Plate и добавить 100 мкл клеточной суспензии на лунку для клеток токсичности / нейропротекция исследований и добавить клеточной суспензии 50 мкл и 50 мкл распространения среду на лунку для исследований клеточной пролиферации. Количество посеянных клеток на лунку должно быть оптимизировано для каждой клеточной линии эмпирически.
- Аккуратно вихревой E-Plate 96 даже для обшивки клеток. Оставьте E-Пластина 96 в течение 30 мин в капот культуры ткани при комнатной температуре, чтобы позволить решить эти клетки равномерно на дне лунки.
- Вставьте E-Plate 96 в режиме реального времени анализатора клеток станции и начать Шаг 2 на графике рвозраст. Монитор величины индекса сотовый в течение всего эксперимента, просмотрев кривые клеток на странице участка и исходных данных индекса сотовый на Cell Index странице программного обеспечения.
3 Сыворотка Лишение
- 24 часа в сутки после посева клеток, приостановить эксперимент, и снимите E-Plate 96 от реального времени анализатора клеток станции. Развести второй ингибиторы посланник запасов 1,000X с DMEM / F12 сыворотки среде - до 200 × конечной концентрации. Лечить клетки с 1 мкл ингибиторы второго путей мессенджеров для проверки на их участии в нейротоксичности / нейропротекции 30 мин до начала цитотоксичность, ингибирует соответствующие пути. Верните E-Plate 96 на станцию и возобновить экспериментальные измерения Индекса сотовый.
- Через 30 мин пауза эксперимент снова. Осторожно снимите распространения среду полностью от E-Plate 96 лунок с пипеткой (или многоканального пипетки), стараясь не нарушить клейкий слой клетокнаправляя край пипетки в угол скважины. Добавить 200 мкл / лунку бессывороточной DMEM / F12 среду (лишение среднего сыворотки). Обеспечить быстрый обмен клеточной культуральной среде, чтобы свести к минимуму механическое перемешивание клеток.
- Развести соединения должны быть проверены на их нейропротективных эффектов от 1,000X складе с бессывороточной DMEM / F12, до 200 × конечной концентрации. Добавить 1 мкл соединения должны быть проверены на их нейропротективных эффектов и 1 мкл ингибиторов второй путей мессенджеров в отдельных скважин в соответствии с экспериментальной плана.
- В клетках для исследований распространения не изменить среду. Развести тестируемых соединений с 1,000X складе 200 × конечной концентрации в среде распространения, лечения с 1 мкл на лунку и продолжают культуры в среде распространения.
- Резюме эксперимент продолжать Сотовые измерений индекса каждые 15 мин в течение 96 ч, как ранее установлено.
4 Данныенализ
- Для нейротоксичности / данные Нейропротекция нормализовать Cell Index к последней точке времени до медикаментозного лечения или смены среды для уменьшения различия между экспериментами, выбрав "нормализованное Cell Index" и "нормализовать Время" на странице участка.
- Выделите скважин на странице участка для экспериментальных условиях интерес и нажмите кнопку "Добавить", чтобы построить нормированные кривые Индекс сотовый. Обратите внимание на кинетику нейротоксического / нейропротекторного эффекта или вторичных мессенджеров торможения в виде нормализованных кривых Индекс клетки как функцию времени.
- Заметим, кривые Индекс ячейка для тестируемых лекарственной терапии в среде распространения в зависимости от времени, чтобы оценить, насколько действие на пролиферацию участвует в нейропротекторного / нейротоксического эффекта.
- Экспорт экспериментальную информацию для всех форумов сотовый временных точках из клетки странице программного Index в файл Excel, чтобы начать статистическую оценку результатов
- Для статистического анализа различий в значениях Сотовые Индекс в различных условиях лечения в определенные моменты времени, выберите значения индекса сотовый в соответствующих временных точках из экспортированного файла Excel. Анализ значений индекса сотовый для выбранных временных точках с односторонним или двусторонним анализа дисперсии (ANOVA) с последующим тестом после специальной использованием статистического программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сыворотка лишение приводит к снижению значений Сотовые индекс, который можно контролировать непрерывно с анализатором в режиме реального времени мобильный
Нейротоксические стимулы к клеткам привести к снижению значений Сотовые индекс, который можно контролировать в режиме реального времени с представленной техникой и динамики которого зависит от конкретного нейротоксической стимулом и типа клеток учился. Рисунок 2 демонстрирует увеличение Список сотовый, когда SK-N-SH клетки не растут в пролиферации среды до достижения плато (зеленая линия) и падение индекса клеток с последующим стабилизации на новых более низких уровнях после включения клеток в сыворотке лишения среды (красная линия). Это падение может представлять изменение в клеточной адгезии за счет вывода сыворотке.
Нейропротекторные эффекты лекарственной терапии можно контролировать непрерывно с анализатором в режиме реального времени мобильный
"> Нейропротекторный эффект соединений, добавляемых перед (предварительной обработки), в то же время (сопутствующее лечение) или после нейротоксической стимула (предполагая восстановление клеток) также может следовать непрерывно с анализатором в режиме реального времени клеток, таким образом, предоставляя информацию о . скорость и продолжительность нейропротекторного эффекта Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты динамики нейропротекции двух 5-HT 2A - агонистов 5 мкМ DOI (фиг.3А) и 20 мкМ Лизурид (фиг.3В) добавили в момент переключения клетки в сыворотки лишение среднего.Анализатор реального времени клеток позволяет дифференцировать воздействие на выживаемость клеток и пролиферации клеток
Важный вопрос в нейропротекция исследований в нейронных клеточных линий является способствует ли эффект на пролиферацию клеток к наблюдаемому совокупным эффектом на выживаемость клеток. С анальным реального времени мобильныйYzer эффект на пролиферацию могут быть проверены в той же E-Plate 96 оценки нейротоксичности. Рисунок 4 показывает отсутствие эффекта 5 мкМ DOI лечения на SK-N-SH клеток пролиферации, предлагая действие на пролиферацию не способствует наблюдаемая нейрозащитное действие.
Анализатор реального времени клетки позволяет определить, какие втором пути посыльного участвуют в нейропротективных / нейротоксических эффектов
Активация рецепторов инициирует каскад вторичных мессенджеров эффектов. Текущий протокол позволяет для выявления причастности ряда вторичных мессенджеров в нейропротективного / нейротоксической эффекта в реальном времени через предварительной обработки их ингибиторов. Поскольку влияние вторичных мессенджеров ингибиторов на выживание клеток могут произноситься, и во многих случаях не является линейным со временем, следуя своим кинетики очень информативен. Рисунок 5 представляет эффект 10 мкМ фосphatidylinositol 3-киназа (PI3-K), ингибитор LY294002 на выживание клеток и DOI нейропротекции в сыворотке лишенных SK-N-SH клеток. В представленном графике, 10 мкМ LY294002 предотвратить нейропротекторный эффект DOI в сыворотке лишения, но и имели определенное токсическое воздействие своих собственных.
Соответствующие пути вторичного мессенджера и концентрации ингибитора для каждого тестируемого соединения могут быть определены с помощью поиска литературы. Концентрации пригодность ингибиторов вторичных посредников должна быть проверена и, при необходимости оптимизировать экспериментально. Целью оптимизации является выбор концентрации, которая имеет минимальное влияние на значений индекса сотовый сам по себе, в то время как все еще ингибирования эффективно соответствующий вторичного мессенджера. В качестве примера, некоторые ингибиторы второй мессенджер дорожки, которые могут иметь отношение к 5-HT 2A-рецептора, представлены в табл.1 Эти ингибиторы были ранее использованы для оценки ниже по течению целей, связанных с серотонинергической увеличением добracellular сигнал-регулируемой киназы фосфорилирования 9. Мы показали свою полезность для оценки ниже по течению путей, участвующих в нейропротекции агонистами 2A рецепторов 5-НТ после подтверждения, и в некоторых случаях оптимизации их концентраций в нашей экспериментальной парадигмы 7.
Рис.1 Принципиальная схема процесса представлена в нынешнем протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Влияние сыворотки лишения на мобильный индекса. Serum лишения (красная линия) вызывает быстрое снижение Cell Index, по сравнению с постепенным увеличением Сотовые значений индекса в пролиферации среды (зеленая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Влияние 5-HT агонистов 2А на мобильный индекса после сыворотки лишения. Лечение цитопротекторных препаратов (в этом эксперименте 5-HT агонистов 2А DOI (5 мкМ) () (красная линия) и лизурид (20 мкМ) (B ) (темно-красная линия) частично восстанавливает величины индекса клеток уменьшается сыворотки лишения (красная линия). Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 4 Сотовые значения индексов в ходе пролиферации клеток. Лечение лекарственными препаратами в пролиферации среды (в текущем эксперимент 5 мкМ DOI) (пурпурная линия) позволяет оценить влияние на пролиферацию по сравнению с обработкой транспортных средств (зеленая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис.5 Второй ингибиторы посыльного может влиять на выживаемость клеток самостоятельно и может быть использован для экрана для эффекта второго путей курьером по OBSErved нейропротекции. В этом эксперименте клетки подвергали сыворотки лишения лечат транспортного средства (красная линия), 1 мкМ (DOI линии пурпурного цвета), предварительно обрабатывали 10 мкМ PI3-K ингибитора LY294002 и обрабатывали 1 мкМ DOI (синяя линия) или предварительно с 10 мкМ LY294002 и обрабатывают автомобиля (черная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Примеры второго ингибиторов мессенджеров, которые могут иметь отношение к 5-HT 2A рецепторов вниз по течению путей и их концентрациях, используемых нами в экспериментах анализатора клеток в реальном времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий протокол представляет утилиту анализатора в реальном времени клеток для оценки непрерывно и под этикеток без условий Нейрозащитные / нейротоксическое действие соединений в нервных клеточных линий и, чтобы получить представление о втором пути мессенджеров, участвующих в эффекте.
Даже при том, что утилита в режиме реального времени анализатора клетки для изучения цитотоксичности и эффекты препаратов на пролиферацию клеток, как правило, признается, только несколько исследований использовали его в нейронных связанных типов клеток. Ранее мы показали полезность анализатора в режиме реального времени для контроля клеточной нейропротекции агониста 2A-рецептора 5-НТ в человеческой нейробластомы SK-N-SH клеток, в то время как Галанте и соавт., Показали, он может быть использован для оценки нейротоксичности бета-амилоидных пептидов в нейробластомы человека SH-SY5Y клеток 7,10. Недавнее исследование предположило, что в то время как анализатор в режиме реального времени клетка надежно измерена пролиферации клеток и гибель клеток вeuronal клеточной линии и нейрональные клетки-предшественники, его точность оценки гибели клеток в первичных нейронах зависит от тяжести инсульта 5. Важно отметить, что переменный ток используется для системы анализатора клеток в реальном времени является очень низкой величины, генерации микроампер токи. Эти токи значительно ниже порогового потенциала возбудимых клеток как нейроны. Система анализатор клеток в реальном времени опирается на измерения импеданса от нижней поверхности Е-Plate 96 лунок, поэтому степень клеточной приверженности имеет решающее значение. Вполне возможно, что дальнейшая оптимизация покрытия из E-планшетов с белками внеклеточного матрикса для лучшего сцепления может улучшить результаты, полученные с первичных нейронах.
Нынешняя рукопись демонстрирует новый подход использования системы анализатора клеток в реальном времени, чтобы очертить второе пути посыльного, участвующих в нейропротекции. Наш протокол основан на ингибировании химических второй Messengers гипотетических принимать участие в действии нейропротекторного агента. В таблице 1 приведены некоторые часто используемые второй ингибиторы посыльного дорожки, которые могут иметь отношение к 5-HT 2A рецепторов в качестве примера, и их концентрации, пригодные для представленной экспериментальной парадигмы. Этот экспериментальный проект позволяет быстро скрининга потенциально соответствующих второму пути мессенджеров, чтобы выбрать нижестоящих мишеней для более детальных исследований через взаимодополняющих подходов.
Важным преимуществом анализатора в режиме реального времени клеток также возможность оценить действие на пролиферацию, является ли часть наблюдаемого нейропротекторного эффекта. Использование нейронных клеточных линий вместо первичных нейронов в токсичности анализов дает некоторые преимущества, как более низкой стоимости, легкий доступ, и нет необходимости для экспериментов на животных. Тем не менее, в связи с тем, что нейронные клеточные линии, в отличие от первичных нейронов пролиферируют, потенциальный эффект на пролиферацию необходимо контролировать в течение внейротоксичность анализы. Возможность анализатор в режиме реального времени сотовый предлагает выполнить этот контроль в той же экспериментальной E-пластины 96, облегчает планирование эксперимента.
Несколько технические параметры должны быть рассмотрены в экспериментах с анализатора в реальном времени клеток. Число клеток, чтобы быть покрыты на лунку должны быть определены эмпирически путем титрования эксперимента для каждого испытанного типа клеток. Цитотоксичность и лечение пролиферацию все началось через 24 ч после начала культивирования клеток, чтобы позволить полное прилипание клеток. Оптимальные результаты в экспериментах на цитотоксичность, начинающиеся, когда клетки достигли 65-70% слияния были получены в текущем протокола. Для экспериментов распространения ниже, слияние клеток является предпочтительным (20-30%), чтобы проследить влияние препарата на кривой распространения.
В текущем сыворотке протокола лишение нейротоксичность парадигма представлена в связи с его надежностью, простотой использования и полезности для аппроксимациитрофическая лишение опосредованной гибели нейронов, что очень важно при разработке, острой мозга или нерва травмы, и нейродегенеративные 11. Тем не менее, широкий диапазон нейротоксичности парадигм может быть использован с системой анализатора клеток в реальном времени. Здесь, сопутствующее лечение цитозащитного агента в момент представлена цитотоксичность. Тем не менее, для предварительной обработки или обработки после токсичными событие (оценки восстановления клеток) также могут быть использованы в зависимости от соединения проходят испытания.
В целом, текущий протокол предполагает полезность системы анализатора клеток в реальном времени для оценки нейротоксичности и нейропротекцию в нейронных клеточных линий непрерывно и без наклеек и, чтобы разобраться в последующих путей, участвующих в этих эффектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Расходов на публикацию для текущего видео-статьи спонсировали "ACEA Biosciences".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
