Abstract
Molti disturbi cerebrali connesse sono morte delle cellule neuronali coinvolti nella loro fisiopatologia. Migliorata in modelli in vitro per studiare gli effetti neuroprotettivi o neurotossici di farmaci e vie a valle coinvolti aiuterebbe ottenere informazioni sui meccanismi molecolari di neuroprotezione / neurotossicità e potrebbe potenzialmente facilitare lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, molti saggi di tossicità esistenti in vitro hanno importanti limitazioni - più valutare neurotossicità e neuroprotezione in un unico punto di tempo, non permettendo di osservare il tempo-corso e cinetica dell'effetto. Inoltre, la possibilità di raccogliere informazioni sulle vie di segnalazione a valle coinvolti nella neuroprotezione in tempo reale sarebbe di grande importanza. Nel protocollo corrente viene descritto l'uso di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare gli effetti neuroprotettivi di serotonina 2A (5-HT 2A) agonisti dei recettori in una linea cellulare neuronale sotto senza etichetta e in tempo reale Conditioni che utilizzano misure di impedenza. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli inibitori di secondi messaggeri percorsi possono essere usate per delineare molecole a valle che l'effetto neuroprotettivo. Noi descriviamo anche l'utilità di questa tecnica per determinare se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisce ad un effetto neuroprotettivo osservato. Il sistema utilizza piastre microelettronici speciali denominati E-tavole che contengono alternati matrici di microelettrodi d'oro sulla superficie inferiore dei pozzetti, che servono come sensori cellulari. La lettura impedenza viene modificato dal numero delle cellule aderenti, la vitalità cellulare, morfologia e adesione. Un parametro adimensionale chiamato cella indice è derivato dalle misure di impedenza elettrica e viene utilizzato per rappresentare lo stato delle cellule. Nel complesso, l'analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale permette in tempo reale, la valutazione libero-label di neuroprotezione e neurotossicità, e la valutazione dei percorsi di coinvolgimento secondo messaggero, contribuendo a piùvalutazione dettagliata e high-throughput di potenziali composti neuroprotettivi in vitro, per la selezione dei candidati terapeutici.
Introduction
Morte cellulare neuronale svolge un ruolo critico nella fisiopatologia di molti disturbi cerebrali correlati 1. La disponibilità di throughput elevato e affidabile nelle prove di tossicità in vitro è fondamentale per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di neurotossicità e per contribuire a selezionare le molecole neuroprotettive come candidati terapeutici in sviluppo dei farmaci 2. Tuttavia, ci sono molte limitazioni per più utilizzato in vitro neurotossicità assays.They valutare neurotossicità / neuroprotezione in una sola volta punto di non consentire la risoluzione cinetica; spesso utilizzare l'etichetta o la sonda che può interferire con le vie di segnalazione e limitare ulteriori studi nella stessa popolazione di cellule, e sono spesso ad alta intensità di manodopera, e in molti casi non forniscono informazioni meccanicistica. Nel presente studio abbiamo dimostrato l'utilità di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale in tempo reale e sotto libero-labelcondizioni e forniscono informazioni sui meccanismi a valle attraverso l'analisi delle seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.
Precedenti studi hanno confermato la validità dell'analizzatore cella in tempo reale per determinare la citotossicità nonché effetti sulla proliferazione cellulare in linee cellulari in confronto con tecniche standard 3,4,5,6. Ad esempio, una buona correlazione è stata osservata tra le letture della norma vitalità cellulare WST-1 test e cellulari valori dell'Indice in diversi punti del tempo in condizioni di proliferazione basali e dopo due diversi paradigmi tossici nelle cellule HeLa 3. In A549 e MDA-MB-231 cellule proliferazione e citotossicità provocato con il paclitaxel stabilizzatore microtubuli hanno mostrato valori molto simili quando valutati da misurazioni dell'indice cellulare e il modo standard utilizzato solforodamina B (SRB) test 4. Nella linea cellulare neuronale dei neuroni dell'ippocampo immortalati HT-22 cellule Indice misurazioni sono stati convalidati per la loro capacità to rilevare la proliferazione cellulare, glutammato citotossicità e citoprotezione contro il diffuso 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromuro (MTT) 5. Nello stesso studio i risultati del test MTT e misurazioni Indice cellulare anche correlati bene in misura neuronale cellule progenitrici proliferazione, citotossicità dopo fattori di crescita deprivazione e salvataggio di citotossicità dal pan-caspasi inibitore QVD 5. Citotossicità indotta in cellule NIH 3T3 da Vandetanib (vascular endothelial growth factor recettore e inibitore del recettore del fattore di crescita epidermico) ha mostrato risultati simili misurati con i valori dell'Indice cellulare o neutro saggio di uptake rosso 6.
Abbiamo recentemente usato il sistema analizzatore di cellule in tempo reale per valutare gli effetti neuroprotettivi della 2A della serotonina (5-HT 2A) agonista del recettore cloridrato (±) -2,5-dimetossi-4-iodoamphetamine (DOI) in una linea cellulare neuronale ( cellule SK-N-SH) e screening per il coinvolgimento di second percorsi Messenger tramite il monitoraggio dell'effetto della loro inibizione chimica sulla neuroprotezione osservata 7. È interessante notare che il recettore 5-HT 2A ha agonisti sia allucinogeni e nonhallucinogenic (come il DOI e lisuride, rispettivamente), che possono attivare sia secondo percorsi comuni e distinte Messenger 8.
I vantaggi della tecnica sono presentati che permette di raccogliere informazioni in tempo reale sulla sopravvivenza cellulare nel corso dei giorni, per delineare percorsi di secondo messaggero coinvolti, per valutare il possibile contributo degli effetti proliferazione a neuroprotezione, e per selezionare un tempo ottimale per ulteriori studi end-point sulla stessa popolazione cellulare. Un diagramma schematico del flusso di lavoro nel protocollo attuale è presentato in figura 1.
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Protocol
1 Preparazione
- Posizionare la stazione analizzatore cella in tempo reale di un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e con il 5% di CO 2. Effettuare tutte movimentazione coltura cellulare e trattamenti farmacologici in una cappa coltura tissutale in condizioni sterili.
- NOTA: neuronale linee cellulari che richiedono diverse impostazioni di temperatura rispetto alle condizioni standard per la cultura, dovrebbero essere adeguati di conseguenza. Per le linee di cellule debolmente aderenti, usare agenti di rivestimento per facilitare l'interazione delle cellule con i microelettrodi d'oro nel fondo dei pozzetti della E-Plate 96.
- Preparare soluzioni 1,000X azionari dei composti farmacologici per il trattamento delle colture cellulari (agenti neuroprotettivi o inibitori di seconda percorsi messaggero nel solvente appropriato - dimetilsolfossido o acqua sterile) e conservarli a -20 ° C. Utilizzare il solvente come veicolo per i seguenti trattamenti.
- Cellule di neuroblastoma umano SK Cultura-N-SH in DMEM / F12 media integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) (media proliferazione) in fiasche di coltura cellulare con 175 centimetri 2 superficie densità di circa il 75%. Mantenere numero di cellulare di passaggio all'interno di un intervallo (di circa 10 passaggi) per verificare la coerenza tra le esperienze in termini di tasso di proliferazione cellulare e la risposta alla citotossicità. Numeri passaggio più bassi sono preferiti.
- Lavare lo strato di cellule SK-N-SH aderente con PBS, e trypsinize con soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per 5 min a 37 ° C. Centrifugare le cellule a 170 × g per 5 minuti per rimuovere tripsina. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzo proliferazione. Contare le cellule con contatore di cellule Scettro e regolare il numero di cellule a 300.000 cellule / ml diluendo cellule con terreno di proliferazione.
2 placcatura e la proliferazione delle cellule SK-N-SH
- Aggiungere 100 microlitri di media proliferazione a ciascun pozzetto della piastra E-96 e lasciarlo per 30 minuti nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per equilibrare. Inserire la E-PlaTE 96 nella stazione analizzatore cella in tempo reale in CO 2 incubatore a 37 ° C.
- Avviare il software analizzatore di cellule in tempo reale. Nella pagina di layout selezionare i pozzi inclusi nell'esperimento ed entrano nelle caselle di modifica delle informazioni sul tipo di cellule, numero di cellulare, i nomi e le concentrazioni di composti chimici utilizzati per il trattamento delle cellule.
NOTA: Ai fini del presente protocollo almeno 4 repliche sono raccomandati per ogni trattamento. - Nella pagina software Pianificazione determinare "Steps" inclusi nell'esperimento, selezionando il numero di passate cella di misura Index e l'intervallo fra le passate per ogni passo. Dal Passo 1 è predeterminato per la misurazione di sfondo, selezionare "Aggiungi un passo" e impostare Fase 2 per misurare l'Indice cellulare ogni 15 minuti per 96 ore.
NOTA: Per i trattamenti, in cui sono attesi effetti con cinetica rapida, impostare scansioni ad intervalli più brevi. - Fare clic su Start per avviare la Fase predeterminata automaticamente 1e misurare l'impedenza dei mezzi di sfondo. Questo valore viene sottratto automaticamente dal software in ciascun punto di dati una volta che le cellule vengono aggiunti ai pozzetti.
- Utilizzare il preparato in precedenza al punto 1.5) sospensione cellulare di 300.000 cellule / ml nel terreno di proliferazione. 30.000 cellule / pozzetto per tossicità cellulare / studi di neuroprotezione e 15.000 cellule / pozzetto per gli studi di proliferazione cellulare. Estrarre la E-piastra e aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare per bene per tossicità delle cellule / studi di neuroprotezione e aggiungere sospensione cellulare 50 ml e 50 ml di media per la proliferazione e per gli studi di proliferazione cellulare. Il numero di cellule piastrate per pozzetto deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare empiricamente.
- Agitare delicatamente la E-Plate 96 anche per la placcatura delle cellule. Lasciare la E-piastra 96 per 30 min nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per permettere alle cellule depositano uniformemente sul fondo dei pozzetti.
- Inserire la E-Plate 96 nella stazione di analizzatore di cellule in tempo reale e iniziare a passo 2 a Schedule petà. Monitorare i valori dell'Indice cellulare in tutto l'esperimento visualizzando le curve cellulari sulla pagina Plot ed i dati grezzi dell'Indice cellulare sull'Indice di pagina cella del software.
3 Siero Privazione
- 24 ore dopo la placcatura le cellule, mettere in pausa l'esperimento, e rimuovere la E-Plate 96 dalla stazione di analizzatore di cellule in tempo reale. Diluire inibitori secondi messaggeri provenienti dalle scorte 1,000X con / F12 terreno privo di siero DMEM - a 200 × la concentrazione finale. Trattare le cellule con 1 ml inibitori di seconde vie Messenger per essere testati per il loro coinvolgimento in neurotossicità / neuroprotezione 30 minuti prima di iniziare la citotossicità, per inibire i rispettivi percorsi. Riportare la E-piastra 96 alla stazione e riprendere le misure sperimentali Indice cellulare.
- Dopo 30 min di pausa di nuovo l'esperimento. Rimuovere con cautela medio proliferazione completamente da E-Piastra a 96 pozzetti con una pipetta (o pipetta multicanale), facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule aderentidirigendo il bordo della punta della pipetta all'angolo del pozzo. Aggiungere 200 ml / pozzetto di DMEM privo di siero / F12 (siero medio privazione). Garantire scambio rapido di mezzo di coltura cellulare per minimizzare agitazione meccanica delle cellule.
- Diluire composti da testare per i loro effetti neuroprotettivi di 1,000X magazzino con serum-free DMEM / F12 medio 200 × la concentrazione finale. Aggiungere 1 microlitri composti da testare per i loro effetti neuroprotettivi e 1 ml inibitori di secondi messaggeri percorsi nei singoli pozzetti secondo il piano sperimentale.
- Nelle cellule per studi di proliferazione non cambiare mezzo. Diluire composti da testare da 1,000X magazzino a 200 × la concentrazione finale nel medio proliferazione, il trattamento con 1 ml per pozzetto e continuare a cultura medio proliferazione.
- Riprendere l'esperimento per continuare con cellulare Indice misurazioni ogni 15 minuti per 96 ore come precedentemente impostato.
4 Dati AANALISI
- Per neurotossicità / dati neuroprotezione normalizzare cellulare Index per l'ultimo punto prima del trattamento farmacologico o medio modifica a ridurre le variazioni tra esperimenti selezionando "normalizzato Indice Cell" e "normalizzare Time" sulla pagina Plot.
- Evidenziare i pozzi nella pagina della trama per le condizioni sperimentali di interesse e cliccare su "Aggiungi" per tracciare le curve normalizzate Indice cellulare. Osservare la cinetica di effetto neurotossico / neuroprotettivo, o di seconda messaggeri inibizione come curve normalizzate Index cellulare in funzione del tempo.
- Osservare le curve Indice cellulare per i trattamenti farmacologici testati in media la proliferazione in funzione del tempo per valutare se un effetto sulla proliferazione è coinvolta nell'effetto neuroprotettivo / neurotossico.
- Esportare le informazioni sperimentale per tutti i punti di cellulare temporali Indice dalla pagina del software Indice cellulare in un file di Excel per avviare la valutazione statistica dei risultati
- Per l'analisi statistica delle differenze di cella Valori indice sotto diverse condizioni di trattamento in punti temporali specifici, selezionare i valori dell'Indice cellulare a rispettivi punti di tempo dal file Excel esportato. Analizzare i valori dell'Indice cellulare per i punti di tempo selezionati con unidirezionale o bidirezionale analisi della varianza (ANOVA) seguita da un test post-hoc utilizzando il software statistico.
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Representative Results
Deprivazione di siero porta a diminuire in cella i valori dell'Indice, che possono essere monitorati continuamente con l'analizzatore di cellule in tempo reale
Stimoli neurotossici verso le cellule portano ad una diminuzione della cella i valori dell'Indice, che può essere monitorato in tempo reale con la tecnica presentata e la cui dinamica dipende dallo stimolo neurotossico specifica e il tipo di cella studiata. Figura 2 illustra l'aumento Indice cellulare quando le cellule SK-N-SH sono coltivate in terreno di proliferazione fino a raggiungere un plateau (linea verde) e il calo dell'indice cellulare seguito da una stabilizzazione ai nuovi livelli inferiori dopo il passaggio alle cellule di siero deprivazione medio (linea rossa). Questo calo può rappresentare un cambiamento di adesione cellulare a causa ritiro del siero.
Effetti neuroprotettivi del trattamento farmacologico possono essere monitorati continuamente con l'analizzatore di cellule in tempo reale
"> L'effetto neuroprotettivo dei composti aggiunti prima (pre-trattamento), allo stesso tempo (co-trattamento) o dopo stimolo neurotossico (suggerendo recupero di cellule) può anche essere seguito continuamente con l'analizzatore cella in tempo reale, fornendo quindi informazioni relative . la velocità e la durata dell'effetto neuroprotettivo figura 3 mostra i risultati rappresentativi delle dinamiche di neuroprotezione di due 2A agonisti 5-HT - 5 mM DOI (Figura 3A) e 20 mM lisuride (Figura 3B) aggiunti al momento del passaggio in cellule media deprivazione di siero.L'analizzatore di cellule in tempo reale permette di distinguere tra effetti sulla sopravvivenza cellulare e la proliferazione cellulare
Una questione importante negli studi neuroprotezione in linee cellulari neuronali è se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisce all'effetto composto osservato sulla sopravvivenza cellulare. Con la cella anale tempo realeYzer l'effetto sulla proliferazione può essere testato nella stessa E-Plate 96 valutazione neurotossicità. Figura 4 mostra la mancanza di effetto di 5 mM trattamento DOI sulle cellule SK-N-SH proliferazione, suggerendo un effetto sulla proliferazione non contribuisce alla osservato effetto neuroprotettivo.
L'analizzatore di cellule in tempo reale permette di determinare quali seconde vie messaggeri sono coinvolti in effetti neuroprotettivi / neurotossici
Attivazione del recettore avvia una cascata di secondi messaggeri effetti. Il protocollo attuale permette di screening per il coinvolgimento di un certo numero di secondi messaggeri in un effetto neuroprotettivo / neurotossico in tempo reale attraverso il pretrattamento con loro inibitori. Poiché l'effetto di secondi messaggeri inibitori sulla sopravvivenza cellulare può essere pronunciati, ed è in molti casi non lineare nel tempo, dopo la sua cinetica è molto informativo. Figura 5 presenta l'effetto di 10 mM fosfatophatidylinositol 3-chinasi (PI3-K) inibitore LY294002 sulla sopravvivenza delle cellule e DOI neuroprotezione in cellule SK-N-SH siero-privato. Nel grafico presentato, 10 mM LY294002 impedito l'effetto neuroprotettivo del DOI in deprivazione di siero, ma anche avuto un certo effetto tossico propria.
Rilevanti percorsi secondo messaggero ed inibitore concentrazioni per ciascun composto testato può essere determinato attraverso la ricerca della letteratura. Concentrazioni idoneità degli inibitori secondi messaggeri deve essere verificato e, se necessario ottimizzato sperimentalmente. L'obiettivo dell'ottimizzazione è quello di selezionare una concentrazione, che ha un effetto minimo sui valori dell'Indice cellulare di per sé, pur inibendo efficacemente il rispettivo secondo messaggero. A titolo di esempio, alcuni inibitori percorsi secondo messaggero, che possono essere rilevanti per il recettore 5-HT 2A, sono presentati nella Tabella 1 Questi inibitori sono stati precedentemente utilizzati per valutare gli obiettivi a valle coinvolti in aumento serotoninergica della extracellular fosforilazione della chinasi segnale-regolata 9. Abbiamo dimostrato la loro utilità per valutare i percorsi a valle coinvolti nella neuroprotezione da 5-HT agonisti del recettore 2A dopo aver confermato e, in alcuni casi, ottimizzando le loro concentrazioni per il nostro paradigma sperimentale 7.
Figura 1 Schema del flusso di lavoro presentato nel protocollo corrente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Effetto della deprivazione di siero su Cell Index. Deprivazione di siero (linea rossa) induce una rapida diminuzione delle cellule Index, rispetto al progressivo aumento della cella Valori Indice di proliferazione media (linea verde). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Effetto della 5-HT 2A agonisti sul cellulare Indice dopo deprivazione di siero. Trattamento con farmaci citoprotettivi (in questo esperimento 5-HT 2A agonisti DOI (5 mM) (A) (linea magenta) e lisuride (20 mM) (B ) (linea magenta scuro) ripristina parzialmente valori dell'Indice cellulare diminuiscono di deprivazione di siero (linea rossa). Cliccarequi per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 celle valori dell'Indice nel corso della proliferazione cellulare. Trattamento con farmaci a medio proliferazione (nel corso dell'esperimento 5 micron DOI) (linea magenta) permette di valutare l'effetto sulla proliferazione rispetto al trattamento di veicolo (linea verde). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 inibitori secondo messaggero possono influenzare la sopravvivenza delle cellule in proprio e possono essere utilizzati per schermo per l'effetto di secondi percorsi messaggero su obseneuroprotezione rved. In questo esperimento le cellule sono state sottoposte a deprivazione di siero trattati con veicolo (linea rossa), 1 mM DOI (linea magenta), pretrattati con 10 mM PI3-K inibitore LY294002 e trattati con 1 mM DOI (linea blu) o pretrattati con 10 mM LY294002 e trattati con veicolo (linea nera). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Esempi di inibitori di secondo messaggero, che possono essere rilevanti per il recettore 5-HT 2A vie a valle e le loro concentrazioni utilizzate da noi in tempo reale esperimenti analizzatore cellulare.
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Discussion
Il protocollo attuale presenta l'utilità di un analizzatore di cellule in tempo reale per valutare in modo continuo e in condizioni di libera-label / gli effetti neurotossici neuroprotettivi dei composti in linee cellulari neuronali e al fine di conoscere le seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.
Anche se l'utilità analizzatore di cellule in tempo reale di studiare la citotossicità e gli effetti dei farmaci sulla proliferazione cellulare è generalmente riconosciuto, solo pochi studi hanno utilizzato in tipi di cellule neuronali correlati. Abbiamo precedentemente dimostrato l'utilità dell'analizzatore cella in tempo reale per monitorare neuroprotezione di un 5-HT 2A agonisti del recettore in cellule di neuroblastoma umano SK-N-SH, mentre Galante et al., Hanno dimostrato che può essere utilizzato per valutare la neurotossicità di peptidi beta-amiloide in cellule neuroblastoma umano SH-SY5Y 7,10. Uno studio recente ha suggerito che, mentre l'analizzatore di cellule in tempo reale attendibilmente misurata la proliferazione cellulare e la morte cellulare in unlinea cellulare euronal e le cellule precursori neuronali, la sua precisione nel valutare la morte cellulare nei neuroni primari dipendeva dalla gravità dell'insulto 5. È importante sottolineare che la corrente alternata utilizzata per il sistema di analizzatore di cellule in tempo reale è molto bassa magnitudo, generando microampere correnti. Queste correnti sono ben al di sotto della soglia di potenziale delle cellule eccitabili, come i neuroni. Il sistema analizzatore cella in tempo reale si basa su misure di impedenza dalla superficie inferiore dei pozzetti 96 E-Plate, quindi il grado di aderenza delle cellule è di importanza critica. È possibile che l'ulteriore ottimizzazione di rivestimento dei pozzi e-piastra con proteine della matrice extracellulare per una migliore aderenza può migliorare i risultati ottenuti con i neuroni primari.
Il manoscritto attuale dimostra un nuovo approccio di utilizzare il sistema di analizzatore di cellule in tempo reale per delineare secondo percorsi messaggeri coinvolti nella neuroprotezione. Il nostro protocollo si basa sulla inibizione chimica del secondo messedita ipotizzate per essere coinvolti nella azione di un agente neuroprotettivo. La Tabella 1 elenca alcuni secondi inibitori percorsi messaggero di uso comune, che possono essere rilevanti per il recettore 5-HT 2A come esempio, e le loro concentrazioni adatte per il paradigma sperimentale presentato. Questo disegno sperimentale permette per un rapido screening potenzialmente rilevanti secondo percorsi messaggero, per selezionare gli obiettivi a valle per studi più dettagliati attraverso approcci complementari.
Un importante vantaggio dell'analizzatore cella in tempo reale è anche la capacità di valutare se un effetto sulla proliferazione è una parte di un effetto neuroprotettivo osservato. Utilizzo di linee cellulari neuronali, invece di neuroni primari in saggi di tossicità offre alcuni vantaggi, come minor costo, di facile accesso e senza necessità di sperimentazione animale. Tuttavia, a causa del fatto che le linee cellulari neuronali in contrasto con neuroni primari proliferano potenziale effetto sulla proliferazione deve essere controllato dalsaggi di neurotossicità. L'opportunità dell'analizzatore cella in tempo reale consente di effettuare questo controllo nella stessa sperimentale E-piastra 96, facilita il disegno sperimentale.
Devono essere considerati in esperimenti con l'analizzatore cella in tempo reale Diversi parametri tecnici. Il numero di cellule per essere placcato per pozzetto dovrebbe essere determinata empiricamente mediante esperimento di titolazione per ciascun tipo di cellula testato. Citotossicità e il trattamento della proliferazione sono tutti avviati dopo 24 ore dall'inizio della coltura cellulare, per consentire la piena adesione delle cellule. I risultati ottimali in esperimenti di citotossicità iniziano quando le cellule hanno raggiunto il 65-70% di confluenza sono stati ottenuti nel protocollo corrente. Per gli esperimenti di proliferazione confluenza cella inferiore è preferito (20-30%) per seguire l'effetto di un farmaco su una curva di proliferazione.
Nel siero protocollo attuale paradigma privazione neurotossicità viene presentato per la sua robustezza, facilità d'uso e l'utilità, sul ravvicinamentodeprivazione trofica mediata morte neuronale, che è importante durante lo sviluppo, cerebrale acuto o traumi dei nervi, e neurodegenerazione 11. Tuttavia, una vasta gamma di paradigmi neurotossicità può essere utilizzato con il sistema analizzatore cella in tempo reale. Qui, co-trattamento con un agente citoprotettivo al momento della citotossicità è presentato. Tuttavia, pretrattamento o trattamento dopo l'evento tossico (valutare il recupero delle cellule) possono anche essere impiegati a seconda dei composti testati.
Nel complesso, l'attuale protocollo suggerisce l'utilità di un sistema analizzatore di cellule in tempo reale per valutare neurotossicità e neuroprotezione in linee cellulari neuronali continuamente e senza etichetta e per conoscere le vie a valle coinvolti in questi effetti.
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Disclosures
Spese di pubblicazione per i video articolo sono stati sponsorizzati da "ACEA Biosciences".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
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