Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Astrocytomas er den vanligste primære hjernesvulst og glioblastom (GBM), en klasse IV astrocytom, er den vanligste og aggressiv subtype med en median overlevelse på 12-15 måneder 1,2. Invasjonen av diffuse astrocytomas, særlig GBM, utelukker komplett kirurgisk reseksjon, begrenser effekten av adjuvant behandling, og fører uunngåelig til etter behandling tilbakefall tre. Pasienter utgangspunktet stede enten med de novo (primær) GBM eller med lavere klasse astrocytomas som uunngåelig utvikler seg til (sekundær) GBM fire. GBM er genomisk heterogen og preget av gjensidig utelukkende og co-forekommende mutasjoner i gener som styrer tre sentrale signalveier: G 1 / S (RB) cellesyklus sjekkpunkt, reseptor tyrosin kinase (RTK), og TP53 trasé 5-7. GBM består av fire genomiske undergrupper med distinkt uttrykk profiler som ligner forskjellige hjernecelletyper, noe som tyder på at GBM subtype er influenced av sin celle opprinnelses 6,8,9. Bedre astrocytom modeller er påkrevet for å definere rollen til spesifikke kombinasjoner av mutasjoner i bestemte celletyper under astrocytom patogenesen. Utnytte disse modellene for mer effektiv preklinisk utvikling av legemidler til slutt vil bidra til å forbedre pasientens utfall. Gjeldende astrocytom modellene er etablert humane cellelinjer, pasient avledet xenografts (PDX), genmodifiserte normale menneskelige astrocytter og nevrale stamceller (NSC), og genmanipulerte mus (GEM) 10-14. Vi utviklet en alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) modell 15 utnytte primære hjerneceller – kortikale astrocytter og NSC – høstet fra GEM husing ulike kombinasjoner av floxed onkogene alleler. Målet var å generere astrocytom modeller med genetisk definerte celler som kan være fenotypisk kjennetegnet både in vitro og in vivo, og eventuelt benyttes for preklinisk utvikling av legemidler i immune-kompetente mus.
Etablerte humane cellelinjer er den mest brukte modellen av astrocytom patogenesen og narkotika respons in vitro og in vivo. De er teknisk sett rett frem, allment tilgjengelig, og har definert kinetikk og tumorigenisitet ved orthotopic xenografting i immunodeficient mus 10,11,16-18 . Deres ulemper omfatte manglende evne til å generere etablerte cellelinjer fra lavgradige astrocytomas, begrense studien bare høygradig astrocytomas; Mangelen på en definert celle opprinnelse; tilstedeværelse av komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomisk profiler som avviker vesentlig fra den opprinnelige pasientprøve; og mottakelighet for fenotypisk og genotypisk drift under serie kultur i serum 11,17,19-22. De fenotypiske konsekvenser av enkelte onkogene mutasjoner i etablerte menneske GBM cellelinjer kan være maskert av de mange forandringer som faktisk er til stede, som ofte utelukker elucidation av direkte genotype-fenotype konsekvenser.
PDX er generert gjennom subkutan passasje av pasient isolert astrocytom celler i immundefekte mus eller gjennom deres kultur som ikke-adherente sfæroider i definert, serumfritt medium før det orthotopic injeksjon i hjernen hos mus immunodeficient 12,23. PDX mer nøyaktig opprettholde det genomiske landskap av humane astrocytomer, men ligner på etablerte humane cellelinjer, kan den fenotypiske effekten av individuelle onkogene mutasjoner bli maskert på grunn av deres genomiske kompleksitet 19,24. For å definere de fenotypiske konsekvenser av spesifikke onkogene mutasjoner, spesielt i respons mot nye behandlinger, blir paneler av etablerte humane cellelinjer eller PDX ofte benyttet for å etablere korrelasjoner genotype-fenotype, viser generalizability, og reduserer mulighetene for at cellelinjespesifikke effekter. Mens PDX nøyaktig rekapitulere de histopatologiske kjennetegnene ved menneskelig astrocytomas, incLuding invasjon, ortotopiske xenografts av etablerte humane cellelinjer generelt ikke 21,23,25. I tillegg normale menneskelige astrocytter og NSC har blitt genetisk konstruert med definerte onkogene mutasjoner å modellere astrocytom tumorigenesis in vitro og in vivo 13,14,26. Disse cellene mangler genomisk kompleksitet etablerte humane cellelinjer og PDX og nøyaktig rekapitulere menneskelig astrocytom histopatologi, men krever xenografting i immunsvikt gnagere in vivo. Fordi alle menneskelige cellemodeller krever immunsvikt gnager verter å hindre immunmediert xenograft avvisning, disse modellene ikke klarer å rekapitulere de innfødte tumor-Stroma interaksjoner av en syngene system og mangler et intakt immunforsvar, noe som begrenser preklinisk undersøkelse av stroma-målrettet og immun-moduler therapies 10,11.
GEM tillatelse undersøkelse av fenotypiske konsekvensene av forhåndsbestemte kombinasjoner av onkogene mutasjoner i vivo under in situ tumorigenesis. Mens ikke-betinget GEM har mutasjoner i alle vev i hele utvikling, har betinget GEM floxed onkogene alleler som muliggjør målretting av mutasjoner ved å begrense Cre-mediert rekombinasjon til bestemte celletyper ved bruk av celletypespesifikke arrangører 10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM har blitt benyttet til å belyse de funksjonelle roller av onkogene mutasjoner i forskjellige celletyper innen et intakt hjernen 11. Den prekliniske nytten av in situ ved å bruke betinget gliomagenesis GEM er begrenset av en rekke faktorer, inkludert 1) mangel på en in vitro korrelerer, 2) vanskeligheter med å generere store kullene av mus med komplekse genotyper, 3) lang ventetid for in situ tumorutvikling , 4) og stokastisk tumorprogresjon. Fordi in situ tumorigenesis mangler en tilsvarende in vitro-modell, kan stoffet testing in vitro ikke utføres wed konvensjonelle betingede GEM modeller. I motsetning til andre kreftformer, er betinget GEM modeller av astrocytomer sjelden indusert av enkle onkogene mutasjoner 11. Således er komplekse avl ordninger som kreves for å generere betinget GEM med flere onkogene mutasjoner. Videre oppstår astrocytom initiering med variabel pene etter en lang latenstid i disse modellene, mens progresjon til høyverdige astrocytomer vanligvis forekommer i et ikke-uniformt, stokastisk måte og til slutt gir opphav til svulster med komplekse genomiske landskap og hurtige vekstkinetikk 27, 28. Den variable pene og stokastisk natur ondartet progresjon i betingede GEM-modeller krever at enkelt mus bli skjermet av radiografisk å påvise tilstedeværelse og plassering av høy klasse astrocytomas før deres innmelding i prekliniske legemiddelutprøvninger. Samlet utgjør disse begrensninger hindre generering og testing av de store årskull av betinget GEM kreves for preclinical narkotika testing.
Den RCAs-TVA GEM system, som benytter avian retrovirale (RCAs) vektorer å infisere GEM konstruert for å uttrykke viral reseptor (TVA) på bestemte nervecelletyper, har blitt grundig brukt til å modellere astrocytom tumorigenesis 11. I motsetning til betinget GEM, muliggjør dette modellsystem innføring av multiple onkogene mutasjoner i spesifikke typer celler uten behov for kompliserte avl ordninger. Det er imidlertid begrenset av variabel penetrans, kravet for aktivt delende celler for å oppnå viral integrering, og tilfeldig innsetting av transgener i vertsgenomet 29.
Non-germline GEM (nGEM) modeller, som utnytter celler høstet fra GEM, blir stadig viktigere fordi de overvinne mange av begrensningene i modell andre systemer 15. Rollen initiere celletype og co-forekommende mutasjoner i astrocytom patogenesen er vanskelig å avskrekkemin ved anvendelse av etablerte humane cellelinjer eller GBM PDX fordi de er utledet fra utgangen av scene tumorer som har akkumulert omfattende genetiske mutasjoner i udefinerte celletyper i løpet av malign progresjon. I kontrast, kan alle graderinger av astrocytomas modelleres ved hjelp nGEM ved å fremkalle definert genetiske mutasjoner innenfor bestemte rensede hjernecelletyper 11,30. Således kan påvirkningen av spesifikke genetiske mutasjoner og celletype på cellulære og molekylære fenotyper bestemmes in vitro og in vivo. I likhet med etablerte humane GBM cellelinjer, kan begynnende in vitro medikamenttesting ved hjelp nGEM brukes til å prioritere legemidler for in vivo tester som benytter de samme cellene. Tumorigenesis in vivo kan da bli bestemt av allografting nGEM celler orthotopically inn i hjernen til immunkompetente syngene kullsøsken 30. Disse ortotopiske allograft modeller tillater derfor in vivo testing, ikke bare av cytotoksisk en konvensjonellnd målrettet terapi, men immun-modulerende og Stroma målrettede behandlinger også. Endelig kan rollen til mikromiljøet på tumor initiering og progresjon bestemmes ved å sammenligne resultatene mellom nGEM og konvensjonelle GEM-modeller ved å bruke de samme mutasjoner i de samme celletyper.
Vi og andre har utviklet astrocytom nGEM bruker primærceller – astrocytter, NSC, eller oligodendrocyte forløper celler (OPC) – høstet fra GEM 30-34. Begrunnelsen bak utviklingen av et astrocytom nGEM var å lage en modell for å bestemme fenotypiske konsekvensene av onkogene mutasjoner i bestemte celletyper som potensielt kan brukes til preklinisk narkotika testing in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstet fenotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre uttrykker, betinget GEM opprettholdes på en> 94% C57 / BL6 bakgrunn med floxed RB sti – Rb1 loxP / loxP, eller TgGZT121 – og floxed RTK / RAS / PI3K pathway – NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – gener i ulike kombinasjoner 35-39. Vi indusert genetisk rekombinasjon in vitro ved hjelp av adenovirale vektorer som koder for Cre rekombinase. Fordi kortikale astrocyte avlinger inneholder en blanding av celletyper, brukte vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, slik som TgGZT 121 drevet fra den menneskelige GFAP promoter, for å berike for GFAP + kortikale astrocytter i disse kulturene. Vi definerte fenotypiske konsekvensene av G 1 / S (RB), MAPK, og PI3K pathway mutasjoner i kortikale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K sti-aktivert G1 / S-defekte astrocytter molekylært etterlignet menneske proneural GBM, og ved orthotopic injeksjon, dannet svulster i et forhåndsdefinert sted ensartede vekstkinetikk, korte ventetider, og histopatologiskeal kjennetegnene ved menneskelig GBM 30. Langsgående overvåking av tumorvekst in vivo hjelpemidler preklinisk narkotika testing gjennom normalisering av behandlings kohorter og kvantitativ analyse av tumorvekst i respons på behandlingen 40. Vi bestemt tumorvekst kinetikk ved langsgående bioluminesens avbildning av mus injisert med luciferase uttrykke kortikale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC avledet fra betinget GEM gi en medgjørlig modellsystem for definisjon av funksjonelle konsekvenser av astrocytom mutasjoner og en potensiell modellsystem for preklinisk narkotika utvikling.
De mest kritiske trinn for å sikre riktig og høsting av kulturen kortikale astrocytter er 1) for å skjære barken uten å ta vev under corpus callosum, 2) for å fjerne hjernehinnene, 3) for å grundig dissosiere cellene, og 4) å anrike for GFAP + astrocytter. Selv om vi brukte mekanisk (risting) og genetisk (begrensning av genetisk rekombinasjon med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttelse av en dominerende transformerende transgenet (TgGZT 121) under GFAP promoter kontroll) met…
The authors have nothing to disclose.
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |