Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Astrocytom är den vanligaste primära hjärntumör och glioblastom (GBM), en klass IV astrocytom, är den vanligaste och aggressiva subtyp med en medianöverlevnad på 12-15 månader 1,2. Invasion av diffusa astrocytom, särskilt GBM, utesluter komplett kirurgisk resektion, begränsar effektiviteten av adjuvant terapi, och oundvikligen leder till efterbehandling återfall 3. Patienter som ursprungligen före antingen med de novo (primär) GBM eller med lägre kvalitet astrocytom som oundvikligen utvecklas till (sekundär) GBM 4. GBM är genomiskt heterogen och präglas av ömsesidigt uteslutande och samarbete förekommer mutationer i gener som styr tre centrala signalvägar: G 1 / S (Rb) cellcykel checkpoint, receptor (RTK) och TP53 spridningsvägar 5-7. GBM består av fyra genomiska subtyper med skilda uttryck profiler som liknar olika hjärncelltyper, vilket tyder på att GBM subtyp är influpåverkades av dess cellursprungs 6,8,9. Bättre astrocytom modeller krävs för att definiera rollen av specifika kombinationer av mutationer i specifika celltyper under astrocytom patogenes. Utnyttja dessa modeller för effektivare preklinisk läkemedelsutveckling kommer i slutändan bidra till att förbättra behandlingsresultat. Nuvarande astrocytom modeller har etablerat humana cellinjer, patient härledda xenotransplantat (PDX), genmodifierade normala mänskliga astrocyter och neurala stamceller (NSC) och genetiskt modifierade möss (GEM) 10-14. Vi utvecklade ett alternativt, icke-könsceller GEM (nGEM) modell 15 som använder primära hjärnceller – kortikala astrocyter och NSC – skördas från GEM hyser olika kombinationer av floxed onkogena alleler. Målet var att skapa astrocytom modeller med genetiskt definierade celler som kan fenotypiskt kännetecknas både in vitro och in vivo och potentiellt utnyttjas för preklinisk läkemedelsutveckling i immune kompetenta möss.
Etablerade humana cellinjer är den vanligast använda modellen av astrocytom patogenes och läkemedelssvar in vitro och in vivo. De är tekniskt rakt framåt, allmänt tillgängliga, och har definierat kinetik och tumorigenicitet upon orthotopic xenografting i immundefekta möss 10,11,16-18 . Deras nackdelar inkluderar oförmåga att generera etablerade cellinjer från låggradig astrocytom, begränsar studien endast höggradig astrocytom; Avsaknaden av en definierad cell ursprungs; förekomsten av komplexa genomiska avvikelser, ofta med genomiska profiler som skiljer sig markant från det ursprungliga patientprovet; och känslighet för fenotypisk och genotypisk Avvikelsen under seriekulturen i serum 11,17,19-22. De fenotypiska konsekvenserna av enskilda onkogena mutationer i etablerade humana GBM cellinjer kan maskeras av de många avvikelser som faktiskt före, som ofta utesluter elucsolideringen av direkta genotyp-fenotyp konsekvenser.
PDX genereras genom subkutan passage av patient isolerade astrocytomceller i immundefekta möss eller genom sin kultur som icke-vidhäftande sfäroider i definierat, serumfritt medium före orthotopic injektion i hjärnan hos immundefekta möss 12,23. PDX behålla mer exakt genom-landskap av mänskliga astrocytom, men liknar etablerade humana cellinjer, kan den fenotypiska effekten av enskilda onkogena mutationer maskeras på grund av deras genomiska komplexitet 19,24. För att definiera de fenotypiska konsekvenserna av specifika onkogena mutationer, i synnerhet som svar på nya terapier, är paneler av etablerade humana cellinjer eller PDX ofta utnyttjas för att fastställa genotyp-fenotyp korrelationer, visar generaliserbarhet, och minimera sannolikheten för cell-linjespecifika effekter. Medan PDX exakt rekapitulera de histopatologiska kännetecken mänsklig astrocytom, including invasion, orthotopic xenografter av etablerade humana cellinjer i allmänhet inte 21,23,25. Dessutom normala mänskliga astrocyter och NSC har genetiskt engineered med definierade onkogena mutationer att modellera astrocytom tumörigenes in vitro och in vivo 13,14,26. Dessa celler saknar den genomiska komplexiteten av etablerade humana cellinjer och PDX och noggrant rekapitulera humant astrocytom histopatologi, men kräver xenografting i immundefekta gnagare in vivo. Eftersom alla humana cellmodeller kräver immunodeficienta gnagare värdar för att förhindra immunmedierad xenograftavstötning, dessa modeller inte rekapitulera de infödda tumör-stroma interaktioner av ett syngent systemet och saknar ett intakt immunsystem, vilket begränsar preklinisk undersökning av stroma inriktade och immunmodulerande terapier 10,11.
GEM tillåter granskning av de fenotypiska konsekvenserna av förutbestämda kombinationer av onkogen mutationer in vivo under in situ tumorigenes. Icke-villkorlig GEM har mutationer i alla vävnader i hela utveckling, har villkorat GEM floxed onkogena alleler som möjliggör inriktning av mutationer genom att begränsa Cre-medierad rekombination till specifika celltyper genom att använda cell typspecifika promotorer 10,11,15,18. Villkorlig astrocytom GEM har använts för att belysa de funktionella roller onkogena mutationer i olika celltyper inom en intakt hjärna 11. Den prekliniska användbarheten av in situ gliomagenesis använder villkorad GEM är begränsad av ett antal faktorer, inklusive en) avsaknaden av en in vitro-korrelat, 2) svårigheten att generera stora kohorter av möss med komplexa genotyper, 3) lång latens på in situ-tumörutveckling , 4) och stokastisk tumörprogression. För i situ tumorigenes saknar en motsvarande in vitro-modell, inte kan utföras drogtestning in vitro wITH konventionella villkor GEM modeller. I motsats till andra typer av cancer, är villkorade GEM modeller av astrocytom sällan inducerad av enkel onkogena mutationer 11. Således är komplexa avelsprogram krävs för att generera villkor GEM med flera onkogena mutationer. Dessutom sker astrocytom initiering med variabel penetrans efter en lång latensperiod i dessa modeller, medan progression till höggradig astrocytom uppträder i allmänhet i en icke-enhetlig, stokastisk sätt och i slutändan ger upphov till tumörer med komplexa genomiska landskap och snabb tillväxt kinetik 27, 28. Den rörliga penetrans och stokastiska natur malign progression i villkor GEM modeller kräver att enskilda möss screenas genom radiografisk avbildning för att påvisa förekomst och lokalisering av hög kvalitet astrocytom innan de är inregistrerade i prekliniska läkemedelsprövningar. Sammantaget ger dessa begränsningar hindrar produktion och testning av de stora kohorter av villkor GEM krävs för preclinical drogtestning.
Den RCAS-TVA GEM-systemet, som utnyttjar avian retrovirala (RCAS) vektorer för att infektera GEM konstruerad för att uttrycka den virala receptorn (TVA) på specifika neuronala celltyper, har i stor utsträckning används för att modellera astrocytom tumorigenes 11. I motsats till villkorlig GEM möjliggör detta modellsystem införa multipla onkogena mutationer i specifika celltyper utan krav på komplexa avelsprogram. Det är dock begränsad av variabel penetrans, kravet på att aktivt delande celler för att uppnå viral integration och den slumpmässiga införande av transgener i värdgenomet 29.
Icke nedärvda GEM (nGEM) modeller, som använder celler som skördats från GEM, blir allt viktigare eftersom de övervinna många av de begränsningar av andra modellsystem 15. Den roll som initiativ celltyp och samarbete förekommer mutationer i astrocytom patogenes är svåra att avskräckagruvan med hjälp av etablerade humana GBM cellinjer eller PDX eftersom de kommer från slutstegs tumörer som har ackumulerats omfattande genetiska mutationer i odefinierade celltyper under malign progression. Däremot kan alla kvaliteter av astrocytom modelleras med hjälp nGEM genom att inducera definierad genetiska mutationer i specifika renade hjärnan celltyper 11,30. Således kan påverkan av specifika genetiska mutationer och celltyp om cellulära och molekylära fenotyper bestämmas in vitro och in vivo. Liknar etablerade humana GBM cellinjer, kan initialt in vitro drogtestning med hjälp nGEM användas för att prioritera läkemedel för in vivo-testning som använder samma celler. Tumorigenesis in vivo kan sedan bestämmas genom allografting nGEM celler ortotopiskt in i hjärnorna på immunkompetenta syngeniska kullsyskon 30. Dessa orthotopic transplantationsmodeller tillåter därmed in vivo-testning inte bara av konventionella cytotoxiska and inriktade terapier, men immunmodulerande och stroma inriktade terapier också. Slutligen kan den roll som mikromiljön på tumör initiering och progression bestämmas genom att jämföra resultaten mellan nGEM och konventionella GEM modeller med användning av samma mutationer i samma celltyper.
Vi och andra har utvecklat astrocytom nGEM använder primära celler – astrocyter, NSC, eller oligodendrocyt prekursorceller (OPC) – skördas från GEM 30-34. Logiken bakom utvecklingen av en astrocytom nGEM var att skapa en modell för att bestämma de fenotypiska konsekvenserna av onkogena mutationer i specifika celltyper som potentiellt skulle kunna användas för preklinisk drogtester in vitro och in vivo i immunkompetenta djur. Vi skördade fenotypiskt WT kortikala astrocyter och NSC från icke-Cre uttrycker, villkor GEM upprätthålls på en> 94% C57 / BL6 bakgrund med floxed RB vägen – Rb1 loxP / loxP eller TgGZT121 – och floxed RTK / RAS / PI3K vägen – NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – gener i olika kombinationer 35-39. Vi framkallade genetisk rekombination in vitro med användning av adenovirusvektorer kodar Crerekombinas. Eftersom kortikala astrocyternas skördar innehåller en blandning av celltyper, använde vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerande onkogena transgener, såsom TgGZT 121 drivs från den mänskliga GFAP promotor, att anrika GFAP + kortikala astrocyter i dessa kulturer. Vi definierade de fenotypiska konsekvenserna av G 1 / S (Rb), MAPK, och PI3K pathway mutationer i kortikala astrocyter och NSC in vitro och in vivo. MAPK och PI3K vägen aktiverad G1 / S-defekta astrocyter molekylärt härmade mänskliga proneural GBM och vid orthotopic injektion, bildade tumörer i en fördefinierad plats med enhetliga tillväxt kinetik, korta latenser och histopatologiskaal kännetecken human GBM 30. Längsgående övervakning av tumörtillväxt in vivo hjälpmedel prekliniska drogtestning genom normalisering av behandlings kohorter och kvantitativ analys av tumörtillväxt som svar på behandling 40. Vi bestämde tumörtillväxt kinetik med längd mareld avbildning av möss som injicerats med luciferas uttrycker kortikala astrocyter. Därför kortikala astrocyter och NSC härrör från villkor GEM ger en lätthanterlig modellsystem för definition av funktionella konsekvenserna av astrocytom associerade mutationer och en potentiell systemmodell för preklinisk läkemedelsutveckling.
De mest kritiska stegen för att säkerställa korrekt skörd och odling av kortikala astrocyter är 1) för att skära ut kortex utan att ta vävnad nedan corpus callosum, 2) för att avlägsna hjärnhinnorna, 3) att grundligt dissociera cellerna, och 4) för att anrika för GFAP + astrocyter. Även om vi använde mekanisk (skakningar) och genetisk (begränsning av genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttjande av en dominerande trans transgen (TgGZT 121) under GFAP…
The authors have nothing to disclose.
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Papain | Worthington | LS003127 | |
L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |