خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.
واحد القيود الرئيسية مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية هو الجيل من السكان الخلية غير المتجانسة. هذه الثقافات تحتوي على خلايا الفائدة، ولكن الملوثة أيضا مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة، والمشتقات غير العصبية والخلايا العصبية فرعية أخرى. هذا يحد من استخدامها في في المختبر وفي الجسم الحي التطبيقات، مثل النمذجة في المختبر لاكتشاف الأدوية أو العلاج ببدائل الخلية. للمساعدة في التغلب على هذا، خطوط الخلايا مراسل، والتي تقدم وسيلة لتصور وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، يمكن هندستها. ومع ذلك، من أجل تحقيق هذا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية. هذا البروتوكول يصف استهداف homeobox النخامية 3 (PITX3) موضع في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام مصمم خصيصا nucleases إصبع الزنك، الذي يعرض فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا في مواقع محددة، جنبا إلى جنب معPITX3 – EGFP -specific ناقلات المانحة DNA. بعد جيل من خط الخلية مراسل PITX3، فإنه يمكن عندئذ أن تكون متباينة باستخدام بروتوكولات نشرت للاستخدام في الدراسات مثل النمذجة المرض في المختبر أو استبدال خلية العلاج باركنسون.
الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية تؤدي إلى السكان الخلية غير متجانسة، ولا سيما فيما يتعلق اشتقاق الظواهر العصبية محددة. وهكذا، على الرغم من الثقافات تحتوي على النمط الظاهري الخلوية المطلوب، العصبية الأخرى، وأنواع الخلايا غير العصبية وغير متمايزة، غالبا ما تكون موجودة 1. هذه الخصائص تحد من تطبيق ESC مصادر اشتقاق الخلايا لاستخدامها في العلاج ببدائل الخلية والنمذجة المرض في المختبر.
خطوط الخلايا مراسل الوراثية توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، شريطة أن يكون التعبير عن بروتين مراسل (RP) يستنسخ التعبير الذاتية. استخدام المروجين المنبع مباشرة من منطقة الجين الترميز يمكن استخدامها لاستخلاص صحفيين الجيني الخام ولكن مثل هذه البنى التنظيمية تفتقر إلى العناصر الدقيقة التي تتحكم في التعبير الجيني الذاتية. في المقابل، إعادة التركيب مثلي يقدمفرصة لضمان عالية الدقة تعبير عن RP. في الماضي، واستهداف ناقلات مصممة لإعادة التركيب مثلي في مواضع محددة من الفائدة التي استخدمت لاستهداف RPS في الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية (mESCs) باستخدام Electroporation للكوسيلة لتسليم DNA 1،2. ومع ذلك الجيل من خطوط الخلايا مراسل عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية (hESCs)، وبالتالي قد تم توثيقه فقط في عدد قليل من الحالات (التي تم استعراضها في 3). باستخدام بروتين خيالية المهندسة تحتوي على الانصهار من فوك أنا نوكلياز بزخارف الزنك الاصبع في مواقع محددة، والمعروفة ب الزنك إصبع nucleases (ZFNs)، DNA فواصل المزدوج حبلا يمكن إدخالها في مواضع محدد مسبقا الجيني. عند إضافة ناقلات DNA مع التماثل لكلا الجانبين من الحمض النووي حبلا كسر مزدوج، يمكن اصلاحها الموقع الجيني عن طريق إعادة التركيب مثلي، والسماح للإدراج تسلسل الحمض النووي المانحة. وقد أثبتت هذه التقنية و مفيدةأو تحرير الجيني في كل من الخلايا الأولية الإنسان وhESCs 4،5 6،7. أكثر الأعمال الأخيرة وقد استخدمت النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، عوامل النسخ التي تستخدمها مسببات الأمراض النباتية 8، للمساعدة في تصميم nucleases موقع معين 9.
في البروتوكول التالية نظهر الجيل خط خلية مراسل HESC بواسطة Electroporation للمن EGFP تحتوي على استهداف ناقلات مثلي 6 مع ZFNs لhomeobox النخامية البشري 3 (PITX3) موضع. بعد اختيار المضادات الحيوية لمدة 2-3 أسابيع، hESCs مع الحمض النووي متكاملة بشكل صحيح يمكن التقاطها يدويا، وتوسعت في البداية عن طريق فحص PCR، والتحقق من صحتها فيما بعد النشاف الجنوبي.
جيل من خطوط الخلايا مراسل يوفر وسيلة قوية لتتبع وتصور وعزل خلايا الفائدة من السكان غير متجانسة المستمدة من hESCs. ومع ذلك، فقد أثبتت استهداف الجينات عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية لتكون فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 3. في هذا البر…
The authors have nothing to disclose.
وقدم العمل المبين في هذا البروتوكول بفضل تمويل من حكومة فيكتوريا كجزء من تحالف التعاوني مع معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM).
Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
Cell Scraper | Corning | 3008 | |
Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |