שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.
מגבלה העיקרית אחת עם פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) הנוכחיים היא הדור של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תרבויות אלה מכילות תאים של עניין, אלא גם נגועות בESCs מובחן, נגזרים שאינם עצביים ותת עצביים אחרים. זה מגביל את השימוש שלהם במבחנה וביישומי vivo, כגון דוגמנות במבחנה לגילוי סמים או טיפול בתחליפי תא. כדי לסייע להתגבר על זה, שורות תאי כתב, אשר מציעות אמצעים כדי לחזות, מסלול ובודד תאים של עניין, יכולות להיות מהונדסות. עם זאת, כדי להשיג את זה בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית היא מאוד לא יעילה. פרוטוקול זה מתאר מיקוד של homeobox יותרת המוח 3 הלוקוס (PITX3) בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות nucleases אבץ אצבע מעוצב בהתאמה אישית, המציג את הפסקות DNA גדיל פעמיים ספציפיות לאתר, יחד עםPITX3 – וקטור תורם DNA -specific EGFP. בעקבות הדור של הקו הסלולרי כתב PITX3, זה יכול לאחר מכן להיות מובחן באמצעות פרוטוקולים שפורסמו לשימוש במחקרים כגון במבחנה דוגמנות מחלה או החלפת תא הטיפול בפרקינסון.
פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים (ESC) זרם לגרום לאוכלוסיות תאים הטרוגנית, במיוחד ביחס לגזירה של פנוטיפים עצביים ספציפיים. כך, למרות שתרבויות להכיל את הפנוטיפ הסלולרי הרצוי, עצבי אחרים, סוגים מובחנים בלתי הלא עצבי ותא הם לעתים קרובות הווה 1. מאפיינים אלה מגבילים את היישום של ESC נגזר מקורות תא לשימוש בטיפול בתחליפי תא ובדוגמנות מחלה מבחנה.
שורות תאי כתב גנטיות מציעות אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של עניין, ובלבד שהביטוי של חלבון הכתב (RP) מתרבה ביטוי אנדוגני. שימוש במקדמים באופן מיידי במעלה הזרם של אזור קוד גנטי יכול לשמש כדי להפיק כתבים גנטיים גולמיים אך מבנים כגון חסרי אלמנטי רגולציה המדויקים השולטים על ביטוי גני אנדוגני. בניגוד לכך, רקומבינציה הומולוגית מציעההזדמנות להבטיח ביטוי באיכות גבוהה של RP. בעבר, מיקוד וקטורים מיועדים לרקומבינציה הומולוגית בלוקוסים ספציפיים של עניין היה בשימוש למקד RPS בעכבר ESCs (mESCs) באמצעות electroporation כאמצעי למשלוח DNA 1,2. עם זאת הדור של שורות תאי כתב באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוא מאוד לא יעיל לESCs האנושי (hESCs), ובכך תועד רק בקומץ של מקרים (שנסקר ב3). על ידי שימוש בחלבון מהונדס chimeric המכיל שילוב של פוק אני nuclease עם מוטיבים אבץ אצבע ספציפי לאתר, ידועים קולקטיבי אבץ האצבע nucleases (ZFNs), יכולות להיות הציגו הפסקות כפולות גדיל DNA בלוקוסים הגנומי שנקבע מראש. כאשר וקטור DNA עם הומולוגיה לשני הצדדים של הפסקת גדיל הדנ"א כפול הוא הוסיף, האתר הגנומי ניתן לתיקון על ידי רקומבינציה הומולוגית, המאפשר שילוב של רצף תורם DNA. טכניקה זו הוכיחה f שימושיתאו עריכה הגנומי בשני תאים ראשוניים אנושיים 4,5 וhESCs 6,7. nucleases עבודה מאוחרת יותר נצלה שעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs), גורמי שעתוק המשמשים את מפעל פתוגנים 8, כדי לסייע בעיצוב של nucleases ספציפי לאתר 9.
בפרוטוקול הבא אנחנו מדגימים את הדור של שורת תאי כתב hESC ידי electroporation של EGFP המכיל וקטור מיקוד הומולוגי 6 יחד עם ZFNs לhomeobox יותרת המוח האנושי 3 הלוקוס (PITX3). בעקבות בחירתה אנטיביוטיקה ל2-3 שבועות, hESCs עם DNA המשולב בצורה נכונה יכול להיות ידני הרים, הרחיב והוקרן בתחילה באמצעות PCR, ומאומתים בהמשך על ידי סופג דרום.
הדור של שורות תאי כתב מציע אמצעי רב עוצמה למעקב אחר, לחזות ובודד תאים של ריבית מאוכלוסייה הטרוגנית נגזרת מhESCs. עם זאת, גן המיקוד באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוכיח להיות מאוד יעיל לESCs אדם 3. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה פשוטה יחסית להכנסת RP לאקסו…
The authors have nothing to disclose.
העבודה המתוארת בפרוטוקול זה התאפשרה על ידי מימון מהממשלה ויקטוריאני, כחלק מברית של שיתוף פעולה עם מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM).
Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
Cell Scraper | Corning | 3008 | |
Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
Cell Strainer – 40um | BD Biosciences | 352340 | |
33mm – 0.22 um filter | Millipore | SLGP033RS | |
rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
0.4cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Proteinase K solution (20mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
HyperLadder 1kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |