RNA Isolering från mus Pankreas: En Ribonuclease rika Tissue
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
Isolering av RNA med hög integritet som krävs för rutinmässiga molekylärbiologiska experiment som norra blotting 9, QRT-PCR 1 eller profilering av genuttryck 5. De flesta moderna metoder för RNA-isolering är baserade på modifieringar av guanidintiocyanat protokoll 2, 3. Guanidintiocyanat är ett starkt proteindenatureringsmedel och kommer att effektivt störa aktiviteten hos ribonukleas under de flesta förhållanden. Den populära metoden enligt Chomczynski och Sacchi 3 kombinerad fenol till guanidintiocyanat lyslösning, minska isoleringen gång till omkring 4 timmar. Många kommersiellt tillgängliga RNA-extraktions-reagensen är baserade på Chomczynski och Sacchi metod 3.
Ribonukleas rika vävnader såsom människa eller mus bukspottkörteln är ytterligare en utmaning för att isolera RNA. Mus bukspottkörteln kan innehålla upp till 75 mg ribonukleas 6 varav några kommer att släppas During störningar i bukspottskörteln vävnad resulterar i vävnads autolys. Modifikationer av guanidintiocyanat protokollen har med framgång använts för att isolera RNA från pankreas med hög integritet 2, 4, 7, 10. Infusion av RNA-stabilisering reagens i mus bukspottkörteln lättat isolering av RNA med hög integritet 4, 7, 10, infusion emellertid av lösningar i bukspottkörteln kräver stor skicklighet, kan kräva särskilda instrument såsom en dissekera mikroskop och störa vävnadsarkitektur under förfarandet kan leda till cell-lys. Perfusion vävnad med RNA stabiliseringsreagens kan störa andra tillämpningar, inklusive proteinisolering och histologisk färgning. Dessutom är denna teknik inte lämpar sig för isolering av RNA från human pankreas. Andra protokoll kräver beredning av specifika lösningar av prövaren 2.
Vi rapporterar ett protokoll för att isolera RNA med hög integritet från mus bukspottkörteln. The protokollet använder delar av tidigare publicerade metoder och bygger till stor del på de vanliga fenol / guanidintiocyanat baserade lyseringsreagenset protokoll. Det kräver inte beredning av specialiserade lösningar inte heller kräver infusion av reagens i bukspottkörteln. Kritiska steg för lyckad RNA isolering innefattar en hög fenol / guanidin-baserade lysisreagens till vävnadsförhållande, borttagning av osmält vävnad före fasseparation och införandet av en ribonukleasinhibitor till den resulterande RNA-lösningen. Med hjälp av dessa och andra modifieringar, isolerar vi vanligtvis RNA med RIN högre än 7 för att användas för rutin genuttrycksanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolera RNA från vävnader som ribonukleas rika utgör en stor utmaning för molekylärbiologiska experiment. Olika reagenser och kit finns kommersiellt tillgängliga som är huvudsakligen baserade på fenol guanidintiocyanat metod för RNA-extraktion. Guanidintiocyanat denaturerar protein och därmed minskar aktiviteten av ribonukleas. Men den stora omfattningen av ribonukleas i bukspottkörteln kräver ytterligare ändringar standardprotokoll för RNA-isolering. Ett protokoll redovisas här som är baserad på standa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo och Satyanarayana Rachagani för deras hjälp kommentarer, förslag och dela med sig av sina protokoll. Detta arbete stöddes av bidrag U01CA111294 och en idéutveckling Award från Ohio State University Interna Research Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
