בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
בידוד של RNA עם יושרה גבוהה נדרש לניסויים בביולוגיה מולקולריים שיגרתי כגון סופג צפוני 9, qRT-PCR 1 או ביטוי פרופיל גנטי 5. רוב השיטות עכשוויות של בידוד RNA מבוססות על שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine 2, 3. Thiocyanate guanidine הוא denaturant חלבון חזק ויהיה יעיל לשבש את הפעילות של ribonuclease תחת רוב התנאים. השיטה הפופולרית של Chomczynski וסאקי 3 בשילוב פנול לפתרון תמוגה thiocyanate guanidine, צמצום זמן הבידוד לכ -4 שעות. ריאגנטים מיצוי RNA, זמינים מסחרי רבים מבוססים על Chomczynski וסאקי שיטת 3.
רקמות ribonuclease עשירות כגון לבלב אנושי או עכבר מציגה אתגר נוסף לבידוד RNA. לבלב של עכבר עשוי להכיל עד 75 מ"ג ribonuclease 6 שחלקם ישוחרר דוריןשיבוש גרם של רקמת הלבלב וכתוצאה מכך autolysis רקמות. שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine שימשו בהצלחה לבודד RNA מלבלב עם רמה גבוהה של יושרה 2, 4, 7, 10. עירוי של מגיב ייצוב RNA לבידוד בהנחייתם לבלב של עכברים של RNA עם רמה גבוהה של יושרה 4, 7, 10, לעומת זאת עירוי של פתרונות ללבלב דורש מיומנות רבה, עשוי לדרוש מכשירים מיוחדים כגון מיקרוסקופ לנתח ושיבוש ארכיטקטורת רקמה במהלך ההליך עלול לגרום לתמוגה תא. מרוססים רקמות עם מגיב ייצוב RNA עשוי להפריע ליישומים אחרים, כולל בידוד חלבון וצביעה היסטולוגית. יתר על כן, טכניקה זו אינה מתאימה לבידוד RNA מן הלבלב אנושי. פרוטוקולים אחרים דורשים ההכנה של פתרונות ספציפיים על ידי החוקר 2.
אנו מדווחים על פרוטוקול לבודד RNA עם יושרה גבוהה מלבלב עכבר. הפרוטוקול דואר משתמש באלמנטים של שיטות שפורסמו בעבר, והוא מבוסס במידה רבה על הפרוטוקולים סטנדרטי פנול / guanidine מבוסס thiocyanate תמוגה מגיב. היא אינה דורשת ההכנה של פתרונות מיוחדים ואינו דורש עירוי של חומרים כימיים ללבלב. שלבים קריטיים עבור בידוד RNA מוצלח כוללים פנול / מבוסס guanidine מגיב תמוגה גבוהה יחס רקמות, הסרת הרקמה מעוכלת מראש לשלב הפרדה והכללת מעכב ribonuclease לפתרון RNA וכתוצאה מכך. באמצעות אלה ושינויים אחרים, אנחנו בדרך כלל לבודד RNA עם רין יותר מ 7 שישמשו לניתוח ביטוי גנים שבשגרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד RNA מן הרקמות הribonuclease עשירים מהווה אתגר גדול לניסויים בביולוגיה מולקולריים. ריאגנטים וערכות שונים זמינים באופן מסחרי המבוססים בעיקר על שיטת thiocyanate guanidine פנול של מיצוי RNA. thiocyanate guanidine denatures חלבון ובכך מפחית את הפעילות של ribonuclease. עם זאת, הגודל העצום של ribonuclease בלבלב ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Jianhua לינג, ריימונד מקדונלד, גאלווין סוויפט, מישל גריפין, פול Grippo וSatyanarayana Rachagani להערות, הצעותיהם מועילות ושיתוף של הפרוטוקולים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי U01CA111294 מענק ופרס פיתוח רעיון מהביצוע העצמי תכנית המחקר של אוניברסיטת מדינת אוהיו.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
