Vi presenterer en mikrofluidbasert elektro biochip for DNA hybridisering deteksjon. Etter ssDNA probe funksjon, er spesifisiteten, følsomhet, og deteksjonsgrense studert med komplementære og ikke-komplementære ssDNA mål. Resultatene illustrerer påvirkning av DNA-hybridise-hendelsene på elektrokjemisk system, med en deteksjonsgrense på 3,8 nM.
Miniatyrisering av analytiske prosedyrer stasjonære inn i mikro-skala gir betydelige fordeler med hensyn til reaksjonstid, kostnad, og integrering av pre-behandlingstrinn. Utnytte disse enhetene mot analyse av DNA-hybridisering hendelser er viktig fordi det gir en teknologi for sanntids vurdering av biomarkører ved point-of-care for ulike sykdommer. Men når enheten fotavtrykk reduseres dominans av ulike fysiske fenomener øker. Disse fenomener påvirker fabrikasjon presisjon og pålitelighet drift av anordningen. Derfor, er det et stort behov for å fremstille nøyaktig og drive disse enhetene i en reproduserbar måte for å forbedre den samlede ytelsen. Her beskriver vi protokoller og de metoder som brukes for fabrikasjon og drift av et mikrofluidbasert elektrokjemisk biochip for nøyaktig analyse av DNA-hybridise-arrangementer. Den biochip er sammensatt av to deler: en microfluidic chip medtre parallelle mikrokanaler laget av polydimetylsiloksan (PDMS), og en 3 x 3 Arrayed elektrokjemisk mikro-brikken. De DNA hybridisering hendelser oppdages ved hjelp av elektro impedansspektroskopi (EIS) analyse. EIS analysen muliggjør overvåking av variasjoner av egenskapene til det elektrokjemisk system som er dominerende på disse lengdeskala. Med muligheten for å overvåke endringer i både kostnad overføring og diffusjon motstand med biosensor demonstrerer vi selektiviteten til komplementære ssDNA mål, en beregnet deteksjonsgrense på 3,8 nM, og en 13% kryssreaktivitet med andre ikke-komplementære ssDNA etter 20 min inkubasjon. Denne metodikken kan forbedre ytelsen av miniatyriserte enheter ved å belyse på oppførselen til diffusjon på mikro-skala regimet og ved å muliggjøre studier av DNA hybridisering hendelser.
Microfluidic lab-on-a-chip (LOC) enheter gir mange fordeler i klinisk diagnostikk, miljøovervåking og biomedisinsk forskning. Disse anordninger anvender microfluidic kanaler for å kontrollere fluidstrøm til regioner av brikken, hvor en rekke forskjellige fremgangsmåter kan skje blant annet reagens blanding, basert bindende affinitet, signaltransduksjon, og celledyrkning 1-4. Microfluidics gir mange fordeler fremfor konvensjonelle kliniske diagnostiske verktøy som mikroplate lesere eller elektro gel shift-analyser. Microfluidic enheter krever 2 til 3 størrelsesordener (nanoliter i motsetning til mikroliter) færre reagenser for å utføre lignende analyser. Dessuten kan disse enhetene øke hastigheten ved hvilken noen biologiske hendelser oppstå på grunn av den mindre innesperring av artene innenfor kanalene 5,6. For det tredje kan sensorene bli integrert i microfluidic enheter ved hjelp av litografi og etsning teknikker, som kan gi label-free deteksjon. Til slutt, disse enhetene er billig å produsere og krever lite arbeide på en del av teknikeren for å operere 7-10.
Etikett-fri deteksjon vanligvis utføres ved hjelp av en optisk eller elektrisk transducer. Optiske enheter kan presentere bedre sensorytelse på grunn av lavere interferens med analytter i prøven. Likevel er resultatene deres kompromittert i tilfeller der prøven bakgrunn gjør det samme resonerende bølgelengde som sensor 11. Det er mange fordeler med å bruke elektriske signaler til å utføre biologiske og kjemiske gjenkjenning i microfluidic systemer. Fabrikasjonen er iboende mindre komplisert, siden disse sensorene vanligvis bare kreve mønstrede elektroder til å operere. I tillegg, kan elektriske signaler være direkte integrert med de fleste måleapparat, mens andre signalformer kan kreve en transduser for å konvertere signalet 12-15. Elektriske sensorer ofte måle endringer i impedance 16,17, kapasitans 18, eller redoks aktivitet 19. Men nye utfordringer presentert som disse systemene er miniatyrisert. De viktigste utfordringene for å overvinne inkluderer: sample (kjemiske interaksjoner mellom byggevarer og analytter inkludert kapillære krefter, overflateruhet,) lav signal-forberedelse og blanding av væsker (på grunn av lavt prøvevolum og Reynolds tall), fysiske og kjemiske påvirkninger, til-støy-forholdet (som produseres av det reduserte overflateareal og volum) 20 til 23, og potensiell forstyrrelse fra elektro-aktive analytter i komplekse biologiske prøver (f.eks, blod og spytt). Videre undersøkelser av disse effektene vil resultere i retningslinjer for en nøyaktig fabrikasjon og drift av disse enhetene i en reproduserbar måte som ville forbedre deres generelle ytelsen.
DNA hybridisering deteksjon brukes mye til å diagnostisere genetiske lidelser 24,25 og ulike former for CANCER 26. Hvert år blir flere stammer av influensa identifisert hos pasienter som bruker resultatene fra DNA diseringsteknikker 27. Influensavirus alene står for 36.000 dødsfall hvert år i USA 28.. Slike eksempler kan ha nytte av en benk-top microfluidic enhet som kan utføre de samme analyseteknikker som en plateleser eller gel shift analysen med lavt prøvevolum og til en brøkdel av kostnadene uten å ofre følsomhet eller spesifisitet. På grunn av de mange fordelene med etiketten-free elektro sensing, har det vært brukt mye for påvisning av DNA hybridisering hendelser 29,30. Et oppsett der makro-skala elektroder (i millimeterområdet) blir dyppet i begerglass med en oppløsning av interesse kan bli brukt til å gi svært sensitive data vedrørende bindingskinetikken av enkelt-trådede DNA-sekvensene til de samsvarende komplementære sekvenser. Nylig har det vært noen fremskritt i å innlemme elektro sensing i microfluidics for DNA-hybridisering. Utført studier om hybridisering kinetikk 31 og integrasjon av sensorer for deteksjon 15 i microfluidic kanaler. Imidlertid er det fortsatt eksisterer et behov for en hurtig høy gjennomstrømning mikrofluidenhet som kan analysere DNA-hybridi-hendelser i parallell uten kompliserte prøveprepareringstrinn.
Anordningen presenteres i dette arbeidet gir en plattform som gjør det mulig for flere interaksjoner som skal skjermes parallelt og uten kompliserte prøveprepareringstrinn. Vår protokoll presenterer hvordan microfluidic basert elektro biochips er microfabricated med mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologi 32,33. Vi beskriver fremstillingsprosessen av både mikrofluid brikken, som består av polydimetylsiloksan (PDMS), og den elektrokjemiske brikken, som består av en oppstilling av elektroder. Den kjemiske funksjonalisering av den biochip med ssDNA sonder er også adressert. Endelig ABILligheten av biosensor for spesifikt å påvise og analysere ssDNA mål er demonstrert. Totalt sett er microfluidic basert elektro biochip en rask og høy gjennomstrømming analyseteknikken. Den kan brukes for å undersøke interaksjonen mellom biologiske molekyler, og som driver transdusere, og kan utnyttes i en rekke lab-på-en-chip-applikasjoner.
Våre fremgangsmåte demonstrerer fremstilling av en mikrofluidbasert elektrokjemisk biochip og dens utnyttelse for DNA hybridi hendelser analyse. Gjennom en høy avkastning kontrollert microfabrication prosessen utvikler vi en enhet som består av mikrokanaler integrert med en rekke elektrokjemiske transdusere. Vi har utviklet kontrollerte prosessparametere for fotolitografisk fremgangsmåte for den elektrokjemiske chip og mikrofluidkanal formen gjennom en iterativ tilnærming. Disse trinnene gi retningslinjer for frem…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner Robert W. Deutsch Foundation, Defense Threat Reduction Agency (DTRA), og National Science Foundation Emerging Frontiers in Research and Innovation (Efri) for økonomisk støtte. Forfatterne også takke Maryland Nanocenter og dens Fablab for renrom anlegget støtte.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Material | |||
4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
Instrument | |||
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |