Summary
We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.
Abstract
Miniaturisatie van analytische procedures benchtop in de micro-schaal biedt aanzienlijke voordelen met betrekking tot reactietijd, kosten en integratie stappen voorbewerking. Gebruik makend van deze apparaten naar de analyse van DNA hybridisatie is belangrijk omdat het een technologie voor real time evaluatie van biomarkers in het point-of-care voor verschillende ziekten. Echter, wanneer de inrichting footprint vermindert de dominantie van verschillende fysische verschijnselen toeneemt. Deze fenomenen beïnvloeden de fabricage nauwkeurigheid en bedrijfszekerheid van de inrichting. Daarom is er een grote behoefte aan om de algemene prestaties verbeteren nauwkeurig fabriceren en gebruiken deze apparaten reproduceerbare wijze. Hier beschrijven we de protocollen en het wordt gebruikt voor de fabricage en de werking van een microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip voor een nauwkeurige analyse van DNA hybridisatie methoden. De biochip bestaat uit twee delen: een microfluïdische chip metdrie parallelle microkanalen van polydimethylsiloxaan (PDMS), en een 3 x 3 Arrayed elektrochemische micro-chip. De DNA hybridisatie gebeurtenissen worden gedetecteerd met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) analyse. De EIS analyse stelt bewaking variaties van de eigenschappen van het elektrochemische systeem dat dominant op deze lengteschalen zijn. Met de mogelijkheid om veranderingen zowel ladingsoverdracht en diffusie weerstand met de biosensor monitoren tonen we de selectiviteit naar complementaire ssDNA doelen, een berekende detectielimiet van 3,8 nM, en een 13% kruisreactiviteit met andere niet-complementaire ssDNA na 20 min incubatie. Deze methode kan de prestaties van geminiaturiseerde inrichtingen verbeteren door het ophelderen van het gedrag van diffusie op micro-schaal regime en doordat de studie van DNA hybridisatie.
Introduction
Microfluïdische lab-on-a-chip (LOC)-apparaten bieden tal van voordelen in de klinische diagnostiek, bewaking van het milieu en biomedisch onderzoek. Deze apparaten maken gebruik van microkanalen te fluïdumstroming regio's van de chip waarbij een aantal verschillende werkwijzen kan plaatsvinden reagens zoals mengen, op basis van affiniteit binding, signaaltransductie en cel kweken 1-4. Microfluidics biedt vele voordelen ten opzichte van conventionele klinische diagnostische hulpmiddelen zoals microwell plaat lezers of elektroforetische gel shift assays. Microfluïdische apparaten vereisen 2 tot 3 orden van grootte (nanoliter tegenover microliter) minder reagentia vergelijkbare assays. Daarnaast kunnen deze apparaten op de snelheid waarmee een biologische gebeurtenissen door de kleinere opsluiting van de soorten van de kanalen 5,6 te verhogen. Ten derde kunnen de sensoren worden geïntegreerd binnen microfluïdische apparaten met behulp van lithografie en etsen technieken, die label-free detectio kan biedenn. Tenslotte, deze apparaten zijn goedkoop te produceren en vereisen weinig werk door de technicus te bedienen 7-10.
Labelvrije detectie wordt typisch uitgevoerd met een optische of elektrische transducer. Optische apparaten beter detectieprestaties presenteren door lagere interferentie met analyten in het monster. Toch is hun prestaties aangetast wanneer de achtergrond van het monster dezelfde resonerende golflengte als de sensor 11. Er zijn vele voordelen aan het gebruik van elektrische signalen aan biologische en chemische detectie uitvoeren in microfluïdische systemen. De fabricage is inherent minder ingewikkeld, omdat deze sensoren meestal alleen nodig patroon elektroden te bedienen. Bovendien kunnen elektrische signalen direct worden aangesloten op de meeste meetapparatuur terwijl andere modaliteiten een signaal transducer kan uitvoering van de signaal 12-15 converteren. Elektrische sensoren veranderingen in impedanc algemeen metene 16,17, capaciteit 18 of redox activiteit 19. Er zijn echter nieuwe uitdagingen gepresenteerd als deze systemen worden verkleind. De belangrijkste uitdagingen te overwinnen zijn: monstervoorbereiding en mengen van fluïda (vanwege de geringe hoeveelheid monster en Reynoldsgetal), fysische en chemische effecten (zoals capillaire krachten, oppervlakteruwheid, chemische interacties tussen bouwmaterialen en analyten), lage signaal- ruisverhouding (door het gereduceerde oppervlak en volume) 20-23 en mogelijke interferentie van elektro-actieve analyten in complexe biologische monsters (zoals bloed en speeksel). Nader onderzoek van deze effecten zal resulteren in richtlijnen voor een nauwkeurige fabricage en werking van deze inrichtingen op een reproduceerbare wijze die op hun prestaties zou verbeteren.
DNA hybridisatie detectie schaal gebruikt voor genetische aandoeningen 24,25 en verschillende vormen van canc diagnosticerener 26. Elk jaar, verschillende stammen van influenza geïdentificeerd bij patiënten die resultaten uit DNA hybridisatietechnieken 27. Het influenzavirus alleen al goed voor 36.000 doden per jaar in de Verenigde Staten 28. Deze voorbeelden zouden profiteren van een bench-top microfluïdische apparaat dat dezelfde assay technieken kunnen uitvoeren als een plaatlezer of gel shift assay met lage monstervolume en een fractie van de kosten zonder dat gevoeligheid of specificiteit. Door de vele voordelen van labelvrije elektrochemische detectie, is uitgebreid gebruikt voor de detectie van DNA hybridisatie 29,30. Een opstelling waarbij macroschaal elektroden (in het millimeterbereik) gedompeld in bekers met de oplossing van belang kan worden gebruikt om gevoelige gegevens over de bindingskinetiek van enkelstrengs DNA-sequenties aan hun bijpassende complementaire sequenties verschaffen. Onlangs zijn er een aantal ontwikkelingen in de integratie van elektrochemische sensing in micr geweestofluidics voor DNA hybridisatie. Er zijn studies verricht naar hybridisatiekinetiek 31 en integratie van sensoren voor detectie 15 in microkanalen. Er bestaat echter nog steeds behoefte aan een snelle high throughput microfluïdische apparaat dat kan analyseren DNA hybridisatie in parallel zonder complexe opzuivering.
De in dit werk inrichting een platform dat voor meerdere interacties te screenen in parallel en zonder ingewikkelde opzuivering. Ons protocol presenteert hoe microfluïdisch-gebaseerde elektrochemische biochips worden microfabricated met micro-elektromechanische systemen (MEMS) technologie 32,33. We beschrijven het fabricageproces van zowel de microfluïdische chip, gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) en de elektrochemische chip, bestaande uit een reeks elektroden. De chemische functionalisering van de biochip met ssDNA sondes is ook aan de orde. Ten slotte Abilheid van de biosensor specifiek ssDNA targets te detecteren en analyseren wordt aangetoond. Kortom, de microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip is een snelle en high-throughput analysetechniek. Het kan worden gebruikt om de interacties tussen biologische moleculen en houden transducers onderzoeken, en kan worden gebruikt in een verscheidenheid van lab-on-a-chip toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Microfabricage van de Microfluidic Chip
- Bereid Elektrochemische Chip
- Patroon Gold Elektroden
- Spoel een lege 4 'siliciumwafel (prime Grade) met aceton, methanol en isopropanol ("AMI" clean). Spoel de isopropanol van de wafer met gedeïoniseerd water (DI), gevolgd door drogen met N2 pistool.
- Groeien een 1 micrometer dik SiO 2 passiveerlaag met plasma-geassisteerde chemical vapour deposition (PECVD) tool. Deponeer een 200 A dikke laag chroom gevolgd door een 2000 A dikke laag van goud met een DC sputteren tool.
- Spin "PR1" positieve fotolak (spinnen parameters: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) om een uniforme film ~ 1,6 micrometer dik te maken. Pre-bak de wafer gedurende 1 min bij 100 ° C op een hete plaat.
- Maak de wafer 190 mJ / cm 2 bij 405 nm door een fotomasker. Ontwikkel de wafer gedurende 30 seconden in 352 developer en spoel de wafer met DI en droog met N2 pistool.
- Ets het goud met goud etsmiddel voor 1,5 min. Ets het chroom met chroom etsmiddel voor ~ 30 sec. Spoel de wafer met DI en droog met N2 pistool.
- Strip de fotolak met "AMI" clean procedure.
LET OP: STERK OXYDEREND en potentieel explosief. - Reinig de wafer met 4: 1 H 2 SO 4: H 2 O 2 mengsel ("Piranha" clean) gedurende 1 minuut. Spoel de wafer met DI en droog met N2 pistool.
- Patroon platina-elektroden
- Spin "PR2" positieve fotolak (spinnen parameters: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) om een uniforme film ~ 1,4 micrometer dik te maken. Pre-bak de wafer gedurende 1 min bij 100 ° C op een hete plaat.
- Maak de wafer 30 mJ / cm 2 bij 405 nm door een fotomasker. Bak de wafer gedurende 45 seconden bij 125 ° C op een hete plaat. Vloed blootde wafer 1000 mJ / cm 2 bij 405 nm zonder fotomasker. Ontwikkel de wafer gedurende 2 minuten in 6: 1 AZ400K ontwikkelaar en spoel de wafer met DI en droog met N2 pistool.
- Deponeer een 400 A dikke laag van titaan, gevolgd door een 1600 A dikke laag van platina met een elektronenbundel verdamping systeem.
- Til fotolak in een ultrasoon acetonbad voor 5 min, gevolgd door spoelen met aceton en isopropanol. Spoel de wafer met DI en droog met N2 pistool.
- Patroon Gold Elektroden
- Bereid Assay Channels
- Bereid Mold voor Assay Channels
- Spoel een lege 4 '' silicium wafer (test rangkwaliteit) met "AMI" clean procedure. Spoel de isopropanol van de wafer met DI gevolgd door drogen met N2 pistool.
- Spin "PR3" negatieve fotolak (2-step spinnen parameters:. Stap een - 600 rpm, 120 rpm / sec, 10 sec Stap twee - 1.150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) om gelijkmatige film ~ 100 pm dik te maken. Pre-bak de wafer op een hete plaat (2 stappen bakken parameters:. Stap een - opvoeren van kamertemperatuur tot 65 ° C bij 300 ° C / hr ingedrukt gedurende 10 min Stap 2 - opvoeren tot 95 ° C bij 300 ° C / uur en vasthoudtemperatuur gedurende 30 min).
- Maak de wafer 2500 mJ / cm 2 bij 405 nm door een fotomasker. Post-bak de wafer door verhoging tot 95 ° C bij 300 ° C / hr ingedrukt gedurende 10 minuten op een hete plaat. Ontwikkel de wafer gedurende 10 min in propyleenglycolmonomethylether Acetate (PGMEA) ontwikkelaar. Spoel de wafer met isopropanol en droog met N2 pistool.
- Fabriceren Assay Channels
- Bereid 10: 1 polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel (20 g elastomeer, 2 g hardingsmiddel) en volledig ontgast in een vacuümkamer gedurende 20 minuten.
- Definieer een behuizing rond de mal wafer met aluminiumfolie en giet langzaam de niet uitgeharde PDMSin de mal.
- Bak de vorm met de PDMS in een kameroven (2 stappen bakken parameters:. Stap een - 5 min opvoeren van kamertemperatuur tot 80 ° C Stap 2 - houden op 80 ° C gedurende 17 min).
- Schil weg de PDMS uit de mal en leg ze op aluminiumfolie. Snijd de assay chips met een chirurg mes definiëren gaten met een biopsie stansgereedschap.
- Bereid Mold voor Assay Channels
2 Monteer de Device
- Handmatig uitlijnen van de PDMS-test kanalen met de werkende elektroden op de elektrochemische chip. PDMS stokken goed de elektrochemische chip, het afdichten van de kanalen en voorkomen lekkage.
- Sluit een flexibele buis (OD 0,087 "en 0,015 ID ') een plastic elleboog of rechte connector tonen volgens een flexibele buis als adapter (OD 0,1875" en 0,0625 ID'). Bevestig connectors aan elk van de geperforeerde inlaten in de inrichting.
- Sluit een spuit op het andere uiteinde vande slang en plaats de injectiespuit in een spuitpomp. Afwisselend veranderen de set van een spuit, een buis, en een connector volgens de vereiste procedure stap in hoofdstuk 3 en de bijbehorende oplossing.
3 Analyseer DNA hybridisatie
OPMERKING: Breng elke oplossing langzaam in het kanaal bij een stroomsnelheid van 200 ul / uur tot de hele kanaal gevuld.
- Functionaliseren elke verticale microkanaalplaat met een ander ssDNA probe sequentie (uitgevoerd in parallel met de 3 separate verticale microkanalen):
- Vul elk microkanaal met een ander ssDNA probe incubatie-oplossing (10 mM fosfaatbuffer, 100 mM NaCl, 10 pM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) en 1 uM probe ssDNA) en incubeer gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen van het microkanaal met PBS.
- Vul het microkanaal met een oplossing die 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (MCH) in een buffer van 10 mM PBS, 100 mM NaCl en 1,395 mM TCEP en INCUverminder gedurende 1 uur, gevolgd door spoelen van de microkanaal met PBS.
- Til de PDMS, 90 ° te draaien om een horizontale oriëntatie, en leg neer op afzonderlijke rijen van reactiekamers bloot bij elke rij met een unieke teller en referentie-elektrode (figuur S1).
- Vul de microkanalen met controlemeting oplossing van 4x geconcentreerde zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) buffer en incubeer gedurende 20 minuten.
- Achtergrond meting: Vul de microkanalen met 5 mM ferricyanide / 5 mM ferrocyanide in PBS-oplossing en noteer de impedantie waarden van het elektrochemische systeem voor de verschillende frequenties (elektrochemische impedantie spectroscopie; EIS) met behulp van een potentiostaat verbonden met de werken, teller, en referentie-elektroden ( EIS parameters: frequentiebereik van 1 MHz tot 0,1 Hz, 10 frequentie gegevenspunten per decade, 25 mV amplitude, 5 mV polarisatie versus de referentie-elektrode). Herhaal deze meting voor elke werkelektrode in de microkanalen. Meet DNA hybridisatie (voeren voor elke niet-complementaire en complementaire ssDNA doel).
- Vul de microkanalen met doel ssDNA meetoplossing 4x geconcentreerde SSC buffer die 1 uM van het doel ssDNA, en incubeer gedurende 20 minuten. Meet het DNA volgens stap 3.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een bestuurbare en nauwkeurig fabricageproces voor de experimentele inrichting essentieel onderzoek. Het maakt het mogelijk onderzoekers om reproduceerbare en high throughput experimenten verkrijgen. Hier hebben we een hoge opbrengst, hoge reproduceerbaarheid microfabricage proces van een microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip (figuur 1) aangetoond. Met een laag uitvalpercentage, zijn enkele apparaten getoond bonding problemen die leiden tot oplossing lekkage. Om de elektrochemische activiteit van de biochip valideren, worden cyclische voltammetrie metingen uitgevoerd in de microkanalen gevuld met een elektro-actieve redox koppel ferricyanide / ferrocyanide. Figuur 2 toont de reproduceerbare elektrochemische reactie van negen verschillende werkelektrode op de chip. Deze resultaten tonen dat de elektrochemische activiteit is hetzelfde in alle negen kamers van de biochip waardoor high-throughput metingen.
De meeste DNA hybridisatie sensoren immobiliseren ssDNA-sondes op een sensor oppervlak. Als goud wordt gebruikt om de patroon detectie-elektroden voor de microfluïdische inrichtingen, thiolen zijn goede kandidaten sterke covalente bindingen vormen met de sensor oppervlakken 34. Een gebruikelijke techniek conjugatie betrokken toevoegen van een functionele thiol (SH) groep aan een uiteinde van het ssDNA. De SS disulfidebinding beschermt de vrije thiolgroep van oxidatie totdat deze klaar voor gebruik. Zodra de disulfide verminderd met tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) bovendien het vrije thiol (SH) beschikbaar aan het DNA binden aan een goudoppervlak. Zonder TCEP, zal de zwavelbruggen van de ssDNA ook monteren op de elektrode, maar de band is veel zwakker dan de thiol-gouden band en zal niet gedurende het experiment stabiel blijven. In dit werk werd een stabiele ssDNA monolaag hybridisatie detectie verkregen met incubatietijden tussen een en twee uur. Zodra de ssDNA probes zijn gemonteerd op de elektrode, wordt 6-mercapto-1-hexanol (MCH) gebruikt om een passivereny belichte gebieden op het oppervlak om niet-specifieke binding effecten 35 verminderen. Thiolgroep De MCH is ruimte voor zelf-assemblage op het goud en de hydroxylgroep vermindert niet-specifieke adsorptie van het ssDNA in oplossing. De hoge TCEP concentratie wordt gebruikt om de thiolgroepen die mogelijk geoxideerd disulfidebindingen verminderen. Zonder de hoge TCEP inhoud in de buffer, zou het MCH onstabiele monolagen vormen en de impedantie van gegevens zou dienovereenkomstig variëren als gevolg van verschillen met de oppervlakte lading. Het MCH heeft nog een andere belangrijke functie bij het gebruik ervan als passiveren met ssDNA moleculen. De oxidatieve adsorptie werkwijze volgens de MCH injecteert elektronen naar de elektrode en vermindert de oppervlaktepotentiaal. Dit veroorzaakt een elektrostatisch effect met de anionische probe ssDNA reeds geïmmobiliseerd en ssDNA rechtop vanaf de elektrode 36. Rechtop sondes sterk toenemen van de hybridisatie efficiëntie omdat de doelgroep ssDNA- strengen hebben veel gemakkelijker toegang tot de entire lengte van de probe sequentie. Dit passiveringsstap is cruciaal voor een stabiele impedantie-meting van de sensor, waardoor valse positieve signalen en verwijderen van zwak gebonden moleculen van het oppervlak.
De biosensing mechanisme van DNA hybridisatie is gebaseerd op afstotende krachten tussen de negatief geladen DNA en andere electro-actieve moleculen. Bij hybridisatie gebeurtenis plaatsvindt, sterker afstotingskrachten tussen de gehybridiseerde DNA en de elektro-actieve moleculen maken het moeilijker voor de elektro-actieve species te diffunderen naar de elektrode 37. Hier gebruiken we een ferricyanide / ferrocyanide echtpaar als de redox soort indicator voor deze afstoting krachten, die worden gemeten met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS). Wij gebruiken deze biosensoren mechanisme in de microfluïdische gebaseerde elektrochemische biochip, en tonen het vermogen om DNA hybridisatie 33 detecteren. Figuur 3 toont hetselectiviteit van de biosensor door illustreren variaties in de impedantie als gevolg van hybridisatie drie ssDNA probes en hun complementaire ssDNA doel. Een 13% kruisreactiviteit met andere niet-complementaire ssDNA na 20 min incubatie aangetoond. Deze resultaten tonen de haalbaarheid van de microfabricated apparaat DNA hybridisatie in een reproduceerbare en high-throughput wijze meten. We hebben ook de gevoeligheid van de biosensor door de invoering van verschillende concentraties van complementaire ssDNA doelstelling om de sonde aangetoond. Figuur 4 toont de functionaliteit van de biosensor met een trend van toenemende impedantiewaarden hogere ssDNA doelconcentraties. Na berekening van de beperkte diffusie weerstand 33 voor verschillende concentraties van complementaire ssDNA doel, een lineaire regressieanalyse resulteerde in een theoretische detectiegrens van 3,8 nM bij de berekening van de overeenkomstige ssDNA doelconcentratie het achtergrondsignaal. Kortom, de biochip toont het vermogen om snel detecteren van de aanwezigheid van DNA hybridisatie.
Figuur 1 foto van verpakte testen apparaat (chip afmetingen: 3,5 cm x 3,5 cm; microchannel hoogte is 100 micrometer en 500 micrometer in de breedte).
Figuur 2 Elektrochemische validatie. Cyclische voltammogrammen 9 (3 x 3 raster) elektrodes in aanwezigheid van ferrocyanide / ferricyanide redox koppel. De reproduceerbaarheid van de gevormde elektroden blijkt uit de soortgelijke vorm, piekhoogten en piekscheiding voor alle elektroden."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51797/51797fig2highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Specificiteit van de biosensor. De impact van hybridisatie tussen verschillende ssDNA- doelen en drie verschillende ssDNA sondes op de overdracht van lading weerstand. Bij DNA hybridisatie gebeurtenis, hoe sterker repulsie kracht tussen de negatief geladen dubbelstrengs DNA en de negatief geladen ferrocyanide / ferricyanide moleculen tot hogere ladingsoverdracht weerstand.
Figuur 4 Functionaliteit van de biosensor. Nyquist plotelektrochemische impedantie spectroscopie metingen na de introductie van 0,01, 0,1, 1, en 1 uM doel ssDNA (pijl geeft stijgende ssDNA doelconcentraties). De verhoogde impedantiewaarden bij lage frequenties (~ 15 Hz) hogere doel ssDNA concentraties door de sterkere afstotingskrachten tussen de dsDNA en ferrocyanide / ferricyanide moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze procedures tonen de productie van een-microfluïdische gebaseerd elektrochemische biochip en het gebruik ervan voor DNA hybridisatie analyse. Door een hoge opbrengst gecontroleerde microfabricage te ontwikkelen we een inrichting bestaande uit microschaal kanalen geïntegreerd met een reeks elektrochemische transducers. We hebben gecontroleerde verwerking parameters voor de fotolithografie procedure van de elektrochemische chip en de microfluïdische kanaal mal bedacht door een iteratieve aanpak. Deze stappen geven richtlijnen voor de toekomstige creatie van andere geminiaturiseerde analytische apparatuur. Belangrijk zij een werkwijze voor het optimaliseren van verschillende biosensoren parameters zoals signaal-ruisverhouding, stabiliteit en gevoeligheid. Volgende apparaat fabricage, functionaliseren we de elektrochemische sensoren met ssDNA- sonde als bioreceptor, het verstrekken van een unieke analytische doeleinden. Hoewel deze procedures aan te tonen lage apparaat percentage mislukkingen, oplossing lekkage toont een majo zijnr afgifte na montage van de inrichting en tijdens de uitvoering van de DNA hybridisatie assay. Verder onderzoek bonding falen in dergelijke apparaten zou de opbrengst van het proces te verbeteren en maakt het ideaal voor micro-biosystemen studie.
In onze studies tonen wij het vermogen van de biochip nauwkeurig en specifiek detecteren van DNA hybridisatie. Als onderdeel van ontwerpparameters voor een nieuwe analytische micro-inrichting, moet men rekening houden met de vervaardiging van de inrichting, die een iteratieve aanpak vereist om fabricage parameters te optimaliseren (bijvoorbeeld fotolithografie parameters microkanaal afmetingen, type afgezette metaal). Om DNA hybridisatie efficiënt detecteren ssDNA probe constructie en hybridisatieomstandigheden moeten ook worden geoptimaliseerd (bijvoorbeeld. Incubatietijd, buffer concentratie, probe concentratie voorkomen van niet-specifieke adsorptie).
De mogelijkheid om snel fo screenenr bepaalde DNA-sequenties is zeer gunstig in het gebied van kankeronderzoek, influenza detectie en gentechnologie. De meeste bekleed detectiemethoden gebruik van een label om het signaal te produceren en gebruiken van meerdere wasstappen en incubatie. Gebruik makend van de voorgestelde microfluïdische inrichtingen zullen DNA hybridisatie uitgevoerd met een groot aantal DNA-sequenties in dezelfde inrichting zonder etiketten dan ook. We zien korte termijn toepassingen waarbij diverse geavanceerde mogelijkheden om de biochip om prestaties en modulariteit verbeteren. Bijvoorbeeld kleppen gebaseerde microfluïdische heeft het potentieel om de biochip met automatische en gecontroleerde analyse mogelijkheden bieden. Een ander voorbeeld is het functionaliseren van het apparaat met andere bioreceptors van unieke sensing eigenschappen die kunnen worden gebruikt in een groter aantal toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de Robert W. Deutsch Foundation, het Defense Threat Reduction Agency (DTRA), en de National Science Foundation Emerging Frontiers in onderzoek en innovatie (EFRI) voor financiële steun. De auteurs danken ook de Maryland Nanocenter en het Fablab voor cleanroom faciliteit ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm |
| Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
| AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
| SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
| Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
| Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
| PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
| Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
| Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | 0.015" |
| Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | 0.0625" |
| 1 ml syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
| 6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
| 20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
| Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
| Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
| Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
| Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
| Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
| Instrument | |||
| Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min. |
| DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
| E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec. |
| Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS230 | |
References
- Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening. Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).
- Sun, Y., Kwok, Y. C. Polymeric microfluidic system for DNA analysis. Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).
- Xu, Y., Yang, X., Wang, E.
- Yang, W., Woolley, A. T. Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis. J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).
- Gervais, T., Jensen, K. F. Mass transport and surface reactions in microfluidic systems. Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).
- Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q.
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview. Sensors. 11, 5754-5768 (2011).
- Dittrich, P. S., Manz, A.
- Craighead, H. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules. Nature. 442, 387-393 (2006).
- Hunt, H. K., Armani, A. M. Label-free biological and chemical sensors. Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).
- Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).
- Fang, T. H., et al. Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection. Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).
- Pavlovic, E., et al. Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences. Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).
- Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments. Talanta. 80, 8-18 (2009).
- Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).
- Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples. Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).
- Prakash, S. B., Abshire, P. Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip. Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).
- Yamaguchi, A., et al. Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel. Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).
- Mariella, R. Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).
- Bhushan, B. Springer handbook of nanotechnology. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Ghallab, Y. H., Badawy, W. Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications. , Artech House. (2010).
- Chee, M., et al. Accessing genetic information with high-density DNA arrays. Science. 25, 610-614 (1996).
- Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy. Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).
- Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).
- Kao, L. T. -H., et al. Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system. Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).
- Li, J., Chen, S., Evans, D. H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).
- Gautier, C., et al. Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach. J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).
- Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement. Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).
- Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel. Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).
- Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces. Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).
- Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis. Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).
- Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P.
- McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy. Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).
- Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation. Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).
- Katz, E., Willner, I. Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors. Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).
