Vi presenterar en mikroflödesbaserad elektro biochip för DNA-hybridisering detektering. Efter ssDNA sond funktion är specificiteten, känslighet och detektionsgräns studeras med kompletterande och icke-komplementära ssDNA mål. Resultaten illustrerar inverkan av DNA-hybridiserings-händelser på den elektrokemiska systemet, med en detektionsgräns av 3,8 nM.
Miniatyrisering av analytiska stationärförfaranden i den mikroskala ger betydande fördelar i fråga om att reaktionstiden, kostnad och integrering av pre-processteg. Med hjälp av dessa enheter mot analysen av DNA hybridiseringshändelser är viktigt eftersom det ger en teknik för realtids bedömning av biomarkörer vid point-of-care för olika sjukdomar. Men när enheten fotavtryck minskar dominansen av olika fysiska fenomen ökar. Dessa fenomen påverkar tillverkningsprecision och driftsäkerhet hos anordningen. Det finns därför ett stort behov av att noggrant tillverka och driva dessa enheter i ett reproducerbart sätt för att förbättra det totala resultatet. Här beskriver vi de protokoll och de metoder som används för tillverkning och drift av en mikroflödesbaserad elektro biochip för noggrann analys av DNA hybridiseringshändelser. Den biochip består av två delar: ett mikroflödes chip medtre parallella mikrokanalerna tillverkade av polydimetylsiloxan (PDMS), och en 3 x 3 anordnade elektromikrochips. De DNA hybridiseringshändelser detekteras med hjälp av elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS) analys. EIS analysen möjliggör övervakning variationer av egenskaperna hos den elektrokemiska system som dominerar vid dessa längdskalor. Med möjligheten att övervaka förändringar av både laddningsöverföring och diffusion motstånd med biosensor visar vi selektivitet till komplementära ssDNA mål, en beräknad detektionsgräns på 3,8 nM, och en 13% korsreaktivitet med andra icke-komplementära ssDNA efter 20 min av inkubation. Denna metod kan förbättra prestanda för miniatyriserade enheter genom att belysa på beteendet hos diffusion på mikroskala regimen och genom att möjliggöra studier av DNA hybridiseringshändelser.
Microfluidic lab-on-a-chip (LOC) enheter ger många fördelar i klinisk diagnostik, miljöövervakning och biomedicinsk forskning. Dessa enheter använder mikroflödessystem kanaler för att styra vätskeflödet till regioner i chip där olika förfaranden kan ske inklusive reagensblandning, affinitetsbaserad bindning, signaltransduktion, och cell odling 1-4. Microfluidics ger många fördelar jämfört med konventionella kliniska diagnostiska verktyg såsom mikroplattläsare eller elektro gel skiftanalyser. Mikrofluidikanordningar kräver 2 till 3 storleksordningar (nanoliter i motsats till mikroliter) färre reagens för att utföra liknande analyser. Dessutom kan dessa anordningar öka hastigheten med vilken vissa biologiska händelser inträffa på grund av den mindre inneslutning av arterna inom kanalerna 5,6. För det tredje kan sensorer vara integrerade i mikrofluidanordningar som använder litografi och etsningstekniker, som kan förse etiketten fritt detection. Slutligen är dessa anordningar är billig att producera och kräver lite arbete på den del av teknikern för att driva 7-10.
Tillverkare fritt detekterings typiskt utförs med användning av en optisk eller elektrisk givare. Optiska enheter kan presentera bättre avkänning prestanda på grund av lägre interferens med analyter i provet. Ändå är deras prestanda komprometteras i fall där provet har en bakgrund har samma resonansvåglängden som sensorn 11. Det finns många fördelar med att använda elektriska signaler för att utföra biologisk och kemisk detektion i mikrofluidiska system. Tillverkningen är i sig mindre komplicerat eftersom dessa sensorer normalt endast kräver mönstrade elektroder för att fungera. Dessutom kan elektriska signaler direkt gränssnitt med de flesta mätutrustning medan andra signal formerna kan kräva en omvandlare för att omvandla signalen 12-15. Elektriska sensorer mäter vanligen förändringar i impedance 16,17, kapacitans 18, eller redoxaktivitet 19. Men nya utmaningar presenteras som dessa system miniatyriserade. De viktigaste utmaningar att övervinna är: provberedning och blandning av vätskor (på grund av den låga provvolym och Reynolds tal), fysikaliska och kemiska effekter (inklusive kapillärkrafter, ytjämnhet, kemisk interaktion mellan byggmaterial och analyter), låg signal- till-brusförhållandet (producerat av den reducerade ytarea och volym) från 20 till 23, och risk för störningar från elektroaktiva analyter i komplexa biologiska prover (t.ex. blod och saliv). Ytterligare undersökning av dessa effekter kommer att resultera i riktlinjer för en korrekt tillverkning och drift av dessa enheter i ett reproducerbart sätt som skulle förbättra deras samlade resultat.
DNA-hybridisering detektering används i stor utsträckning för att diagnostisera genetiska sjukdomar 24,25 och olika former av cancER 26. Varje år flera stammar av influensa identifierats hos patienter som använder resultat från DNA hybridiseringstekniker 27. Influensavirus ensamt står för 36.000 dödsfall varje år i USA 28. Sådana exempel skulle kunna gynnas av en bänk-topp mikrofluidikanordning som kan utföra samma analystekniker som en plattläsare eller gelskiftanalys med låg provvolym och till en bråkdel av kostnaden utan att offra känslighet eller specificitet. På grund av de många fördelarna med etikettfria elektrokemisk avkänning, har den använts i stor utsträckning för detektion av DNA hybridiseringshändelser 29,30. En installation där makroskala elektroder (i millimeterområdet) doppas i bägare med lösningen av intresse kan användas för att ge mycket känsliga uppgifter om de bindande kinetik enkelsträngade DNA-sekvenser i sina matchande komplementära sekvenser. Nyligen har det funnits några framsteg i att införliva elektroanalys i MICRofluidics för DNA-hybridisering. Studier har utförts avseende hybridiseringskinetik 31 och integration av sensorer för detektion 15 i mikroflödessystem kanaler. Dock finns det fortfarande ett behov av en snabb hög genomströmning mikroflödessystem enhet som kan analysera DNA hybridiseringshändelser parallellt utan komplicerade provberedningssteg.
Enheten som presenteras i detta arbete ger en plattform som gör det möjligt för flera interaktioner som ska screenas parallellt och utan komplicerade provberedningssteg. Vår protokoll visar hur mikroflödesbaserade elektrokemiska biochips är mikrofabricerad med mikroelektromekanisk system (MEMS) teknik 32,33. Vi beskriver tillverkningsprocessen av både mikrofluidchip, tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS), och den elektrokemiska chip, som består av en matris av elektroder. Den kemiska funktionalisering av biochip med ssDNA sonder tas också upp. Slutligen Abilhet av biosensor att specifikt upptäcka och analysera ssDNA mål demonstreras. Totalt sett är mikroflödesbaserade elektro biochip en snabb och hög genomströmning analysteknik. Den kan användas för att undersöka interaktioner mellan biologiska molekyler och ledande givare, och kan användas i en mängd olika tillämpningar lab-on-a-chip.
Våra rutiner visar tillverkningen av en mikroflödesbaserad elektro biochip och dess användning för DNA hybridiseringshändelser analys. Genom en hög avkastning kontrollerad mikrofabrikation process utvecklar vi en anordning som består av mikroskala kanaler integreras med en mängd elektrokemiska givare. Vi har tagit fram kontrollerade processparametrar för fotolitografi förfarandet för den elektrokemiska chip och mikroflödeskanalen formen genom en iterativ metod. Dessa steg ger riktlinjer för framtida skapand…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Robert W. Deutsch Foundation, Reduction Agency Defense Threat (DTRA) och National Science Foundation Emerging Frontiers i forskning och innovation (EFRI) om finansiellt stöd. Författarna tackar också Maryland Nanocenter och dess Fablab för renrum anläggning stöd.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Material | |||
4'' Silicon wafer | Ultrasil | 4-5664 | Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm |
Shipley 1813 photoresist ("PR1") | Microchem | positive photoresist | |
AZ5214 photoresist ("PR2") | Hoechst Celanse | positive photoresist | |
SU-8 50 photoresist ("PR3") | Microchem | negative photoresist | |
Gold etchant | Transene | TFA | No dilution |
Chromium etchant | Transene | 1020AC | No dilution |
PDMS elastomer | Dow Corning | 3097366 1004 | |
PDMS curing agent | Dow Corning | 3097358 1004 | |
Biopsy punching tool | Healthlink | BP20 | |
Tygon flexible tubing | Cole Parmer | R 3603 | .015" |
Tygon flexible adapter | Cole Parmer | 06417-41 | .0625" |
1 mL syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Monobasic potassium phosphate | Fluka | 1551139 | |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Sigma | RES20765-A7 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
tris(2-carboxyethyl)phosphine | Aldrich | C4706 | |
6-mercapto-1-hexanol | Aldrich | 451088 | |
20x concentrated saline-sodium citrate buffer | Sigma | 93017 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Aldrich | 455946 | |
Sodium ferrocyanide | Aldrich | CDS001589 | |
Target ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’ |
Complementary ssDNA #1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’ |
Target ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’ |
Complementary ssDNA #2 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’ |
Target ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’ |
Complementary ssDNA #3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 100 nmole DNA oligo | 5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’ |
Instrument | |||
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) | Oxford Instruments | PlasmaLab System 100 | Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute. |
DC sputtering unit | AJA International | ATC 1800-V | For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min. |
E-beam evaporation system | Denton | Custom-built | For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second. |
Potentiostat | CH Instruments | 660D | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS230 |