Isolering av murint Lymph Node stromaceller
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Lymfkörtlar är specialiserade fack där adaptiva immunsvar mot utländska och självantigener initieras och samordnas. Det förfarande som presenteras här beskriver en kort enzymatisk spjälkning kombinerat med automatiserad mekanisk pipettering att få lymfkörtel enda cell fjädring och få tillgång till livskraftiga lymfkörtel stromaceller som upprätthåller ytan uttryck för flera molekyler.
Lymfkörtel stromal cell bildar ställningen i lymfkörteln och uppfylla tre viktiga funktioner: först de filtrerar kroppsvätskor att prova antigener, patogener och deras patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) samt cytokiner och fara molekylära mönster (dämpas) före i kroppen. För det andra, de locka och instruera antigenpresenterande celler (APC) och lymfocyter att interagera och initiera adaptiva immunsvar; och tredje, de ger en strukturell miljö för homeostas och differentiering av lymfocyter en-3. Under inflammations lymfkörtel stromala celler producerar tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner, anpassa sig till svullnad därigenom anordna interaktionen mellan dendritiska celler (DC), T-och B-celler. Orkestreringen av immunresponser är endast möjlig på grund av den komplexa strukturella arkitektur bestående av olika stromala cellpopulationer.
Lymfkörtel stromaceller är CD45 negativa celler och kan särskiljas genom uttrycket av CD31 eller gp38 i fibroblastiska och endotelceller 1 -6. Gp38 + CD31 – definierar T zon retikulära celler (TRC, även känd som FRC: fibroblastiska retikulära celler), gp38 + CD31 + definierar lymfatiska endotelceller (LEC), gp38 – CD31 + definierar blod endotelceller (BEC). Vidare karakterisering av delpopulationer avslöjade förekomsten av andra lymfkörtel stromaceller. I själva verket var en liten pericyte liknande cellpopulation känne inomgp38 – CD31 – befolkningen 7. Därför är anpassning av isoleringsförfarandet fördelaktig för identifiering och karakterisering av de funktionella egenskaperna hos olika lymfkörtel stromaceller.
Innan utvecklingen av lymfkörtel stromaceller matsmältningen protokoll studiet av lymfkörtel stromaceller var begränsad till in situ-observationer med hjälp av vävnadssnitt och mikroskopi. Icke desto mindre, strukturella och funktionella studier visade viktiga egenskaper hos lymfkörtel stromaceller. Lymph node stromaceller är associerade med podoplanin, kollagen och extracellulär matrix (ECM)-proteiner för att bilda ett komplex 3 dimensionell struktur som kallas ledningssystem, som transporterar lymfa och tillhörande lägsta molekylmass proteiner från subkapsulär sinus av lymfkörteln till den höga endotel venoler i T-celler zon 8. DCs är i nära kontakt med stromaceller och kan observeras skjuter in i rörformiga conduit struktur för att prova vätska och upptäcka antigener 8. Samspelet mellan lymfkörtel stromaceller (TRCs och LECS) med DC förmedlas genom frisättning och presentation av kemokiner CCL21 och CCL19 9,10. CCL19 och CCL21 känns igen av CCR7 receptorn underlättar DCs och T-celler att migrera till lymfkörtel T-cellzonen 4,11. Trots att använda liknande kemokiner, DCs och T-celler har olika vandringsvägar i lymfkörtlarna 12. Senare, med hjälp av enzymatisk nedbrytning av lymfkörteln och isolering av rena lymfkörtel stromaceller, var funktionella studier utförts på den roll de olika lymfkörtel stromaceller och deras förmåga att interagera med DCs och T / B-celler 6,13. Först överhörningen mellan IFN-γ producerande effektor-T-celler och lymfkörtel stromaceller inducerar produktionen av metaboliten kväveoxid visat att dämpa T-cellssvar och proliferation i de sekundära lymfoida organ 14-16. För det andra, lymfa node stromaceller har rapporterats att stödja differentiering av reglerande DC delmängder via produktionen av IL-10 17, och för att modulera naiv T-cell homeostas via produktionen av IL-7 6,18. För det tredje föreslår TLR uttryck i lymfkörtel stromaceller att stromalceller är känsliga för signalen kommer från en infektion eller själv molekyler frigörs vid vävnadsskada. Faktiskt, behandling av lymfkörtel stromaceller med liganden av TLR3 poly (I: C) inducerar en måttlig uppreglering av MHC klass I-expression och uppreglering av sam-inhiberande molekyl PD-L1, men inte av samstimulerande molekyler, vilket resulterar i dramatiska förändringar i perifer vävnad antigener uttryck 19. Flera grupper har visat lymfkörtel stromaceller uttrycker perifera vävnadsantigener och inducera tolerans av självreaktiva T-celler 19,21-27. Därför att förstå samspelet mellan lymfkörtel stromaceller och andra flyttande och reSident lymfnodceller hjälper att hitta nya målmolekyler för att tillåta aktivering eller undertryckande av immunsvar vid inflammation. Därför behövs för genomförandet av den publicerade enzymatisk separation av lymfkörteln.
Tidigare publicerade protokoll använder olika kombinationer av kollagenas-baserad enzymatisk spjälkning med låg mekanisk påkänning 6,19,20. Dock kan långa inkubationer med matsmältningen enzymer eller olika kombinationer av matsmältningen enzym försämra olika ytmolekyler krävs för att analysera aktiveringsstatus och att identifiera nya lymfkörtel stromaceller. Beroende på vilken typ av analys för stromacells-, kanske Länkprotokoll eller Fletcher protokoll vara mer lämpade. I det beskrivna förfarandet, är en något kortare enzymatisk nedbrytning kombinerat med automatiserad mekanisk disaggregering att minimera ytmarkör nedbrytningen av viabelt lymfkörtel stromaceller. Detta förfarande möjliggör mycket reproducerbar isolering ochskillnaden av lymfkörtel stromala cellpopulationer med låg variabilitet och mer än 95% viabilitet. De nyisolerade lymfkörtel stromaceller kan direkt användas för ytmarkör expression, proteinanalys, och transkriptionella studier samt etablering av stromala cellinjer att utföra funktionella analyser in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien av lymfkörtel stromaceller nyligen blev ett forskningsfokus på grund av utvecklingen av två publicerade matsmältning protokoll 6,13. Båda protokollen är tillräckliga för att få enstaka lymfkörtel stromaceller men skiljer sig i användningen av rötnings enzymer och tiden för matsmältningen. Eftersom stromaceller och deras ytmarkörer är känsliga för enzymatisk nedbrytning och mekanisk påverkan, är ett optimerat protokoll som krävs.
Isoleringen av viabla l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
