Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av Murint Lymph Node stromale celler

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfeknuter er spesialiserte avdelinger der adaptive immunresponser mot utenlandske og selvantigener er initiert og koordinert. Fremgangsmåten presentert her beskriver en kort enzymatisk fordøyelse kombinert med automatisert mekanisk pipettering for å oppnå lymfeknute enkeltcellesuspensjon, og få tilgang til levedyktige lymfeknute stromale celler som opprettholder overflaten ekspresjon av flere molekyler.

Lymfeknute stromal celler danner stillaset av lymfeknute og oppfylle tre viktige funksjoner: for det første de filtrerer kroppsvæsker for å prøve antigener, patogener og deres patogen forbindelse molekylmønster (PAMPs) samt cytokiner og fare forbundet molekylmønster (demper) tilstede i legemet. For det andre, de tiltrekker og instruere antigenpresenterende celler (APC) og lymfocytter til å samhandle og initiere adaptive immunresponser; og tredje, gir de en strukturell miljø for homeostase og differensiering av lymfocytter 1-3. Under betennelse lymfeknute stromale celler produsere vekstfaktorer, cytokiner og chemokiner, tilpasse seg hevelse og dermed organisere samspillet mellom dendrittiske celler (DCS), T-og B-celler. Orkestrering av immunresponser er kun mulig på grunn av den komplekse strukturelle arkitektur dannet av forskjellige stromal cellepopulasjoner.

Lymfeknute stromale celler er CD45 negative celler og kan være preget av uttrykket av CD31 eller gp38 i fibrinoblast og endotelceller en -6. Gp38 + CD31 - definerer T sone retikulære celler (TRC, også kjent som FRC: fibrinoblast retikulære celler), gp38 + CD31 + definerer lymfatiske endotelceller (LMU), gp38 - CD31 + definerer blod endotelceller (BEC). Videre karakterisering av subpopulasjoner avslørte eksistensen av andre lymfeknute stromale celler. Faktisk ble en liten pericyte-lignende cellepopulasjon, karakterisert innenforgp38 - CD31 - befolkning 7. Derfor er tilpasning av isoleringsprosedyren fordelaktig for identifisering og karakterisering av de funksjonelle egenskaper av forskjellige lymfeknute stromale celler.

Før utviklingen av lymfeknute stromale celler fordøyelsen protokoller studiet av lymfeknute stromale celler var begrenset til in situ-observasjoner ved hjelp av vev-delen, og mikroskopi. Likevel, strukturelle og funksjonelle studier viste viktige kjennetegn ved lymfeknute stromale celler. Lymfeknute stromale celler er forbundet med podoplanin, kollagen og ekstracellulære matriks (ECM) proteiner for å danne en kompleks tre-dimensjonal struktur kalt ledningssystemet, som transporterer lymfe og forbundet-med lav molekylmasse fra proteiner subkapsulær sinus av lymfeknute til den høye endotelial venules i T-celler sone 8. DC er i nær kontakt med Stroma celler og kan observeres som stikker ut i rørformet conduit struktur for å prøve væske og oppdage antigener åtte. Samspillet av lymfeknute stromale celler (TRC og LMU) med DCs er mediert av utgivelsen og presentasjon av kjemokiner CCL21 og CCL19 9,10. CCL19 og CCL21 er anerkjent av CCR7 reseptor tilrettelegge DCs og T-celler til å migrere til lymfeknute T-celle sone 4,11. Til tross for å bruke lignende kjemokiner, DCS og T-celler har forskjellige trekkruter til lymfeknutene 12. Senere, ved hjelp av enzymatisk fordøyelse av lymfeknute og isolering av rene lymfeknute stromale celler, ble funksjonelle studier utført på rollen til de ulike lymfeknute stromale celler og deres evne til å samhandle med DC og T / B-celler 6,13. Først, krysstale mellom IFN-γ produserende effektor-T-celler og lymfeknute stromale celler induserer produksjonen av metabolitten nitrogenoksid vist å dempe T-celle-responser og spredning i de sekundære lymfoide organer 14-16. Sekund, lymfe node stromale celler er blitt rapportert å støtte differensiering av regulatoriske DC delmengder gjennom produksjonen av IL-10 17, og for å modulere naive T-celle-homeostase via produksjon av IL-7 6,18. Tredje, TLR uttrykk i lymfeknute stromale celler antyder at stromale celler er utsatt for signal avledet fra en infeksjon eller selv-molekyler utgitt under vevsskade. Faktisk, ved behandling av lymfeknute stromale celler med liganden av TLR3 poly (I: C) induserer en beskjeden oppregulering av store histocompatibility kompleks klasse I ekspresjon og oppregulering av co-inhiberende molekyl PD-L1, men ikke av kostimulerende molekyler, noe som resulterer i dramatiske endringer i perifert vev antigener uttrykket 19. Flere grupper har vist lymfeknute stromale celler uttrykker perifert vev antigener og indusere toleranse for selvreaktive T-celler 19,21-27. Derfor forstå samspillet mellom lymfeknute stromale celler og den andre trekkfugl og resident lymfeknute celler vil bidra til å finne nye mål molekyler å tillate aktivering eller undertrykkelse av immunresponser ved betennelse. Derfor er innføringen av den publiserte enzymatisk separasjon av lymfeknute nødvendig.

Tidligere publiserte protokoller bruke ulike kombinasjoner av collagebasert enzymatisk oppslutning med lav mekanisk belastning 6,19,20. Men kanskje lange inkubasjoner med fordøyelsen enzymer eller annen kombinasjon av fordøyelsen enzym degradere ulike overflatemolekyler som kreves for å analysere aktiveringsstatusen og å identifisere nye lymfeknute stromale celler. Avhengig av hvilken type av stromal celle analyse, kan det hende at Link Protocol eller Fletcher Protocol være mer egnet. I den beskrevne fremgangsmåten, blir en litt kortere enzymatisk fordøyelse kombinert med automatisert mekanisk dekomponering for å minimalisere overflate markør nedbrytning av levedyktige lymph node stromale celler. Denne fremgangsmåten gjør at svært reproduserbare isolasjon ogforskjellsbehandling av lymfeknute stromal cellepopulasjoner med lav variabilitet og mer enn 95% levedyktighet. De nylig isolerte lymfeknute stromale celler kan brukes direkte for overflate markør ekspresjon, proteinanalyse, og transkripsjonelle studier, samt etablering av stromale celler linjer for å utføre funksjonelle analyser in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne videoen publisering og protokollen, ble alle prosedyrer dyr utført i henhold til dyret protokoll godkjent av Cantonal Authority Basel-Stadt, Sveits.

1. lymfeknuter Forberedelse og fordøyelse

  1. Pre-varme vann i et begerglass til 37 ° C på en magnetrører med varmeplaten.
  2. Forbered Basic Medium som følgende: DMEM medium (uten pyruvat) supplert med 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 og Pen / Strep (100 enheter av penicillin, 100 mikrogram av streptomycin).
  3. Steriliser alle disseksjon instrumenter før bruk.
  4. Avlive lymfeknute giver mus per CO 2 kvelning og aseptisk dissekere lymfeknutene. Ikke dissekere det omliggende fett. MERK: Denne protokollen er optimalisert for perifer hud-drenering lymfeknute (lyskes, brachialis, axillaris).
  5. Plasser lymfeknuter i en steril petriskål inneholdende 2 ml iskald basisk medium.
  6. Forstyrre lymfeknute capsule ved hjelp av to 25 g nåler festet på en ml sprøyte.
  7. Overfør avbrutt lymfeknute vev i et 5 ml polypropylen rundbunnet rør inneholdende 750 mL basisk medium supplert med 1 mg / ml Collagenase IV og 40 mikrogram / ml DNAse I.
  8. Tilsett en steril magnetisk omrører i hvert rør.
  9. Plasser røret i begerglasset med 37 ° C forvarmet vann og omrør rørene ved en langsom hastighet (1 omg / sek) i 30 min.
  10. Fjern røret fra magnetrører med varmeplate og la lymfeknute fragmenter avgjøre.
  11. Fjern forsiktig supernatanten beriket i "non-stromal cell". MERK: Dersom analysen av T, B, dendrittiske celler og CD45 - gp38 - CD31 - er forutsett, lagre "non-stromale celler" brøk.
  12. Vask rester lymfeknute vev gang med 750 mL grunnleggende medium. MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis du arbeider med immun-kompetente mus.
  13. La lymfeknute fragmenter bosette.
  14. Fjernikke-stromal celle-flytende fraksjon.
  15. Legg til lymfeknute fragmenter 750 mL grunnleggende medium supplert med 3,5 mg / ml Kollagenase D og 40 mikrogram / ml DNase I.
  16. Plasser røret tilbake i begerglass inneholdende 37 ° C forvarmet vann.
  17. Fordøye lymfeknute vev i 5 min mens sakte omrøring.
  18. Disaggregert lymfeknute vev fragmenter ved pipettering og blande 700 mL 10 kurer på maksimal hastighet ved hjelp av en automatisert flerkanalspipette. MERK: Dette forstyrrer lymfeknute vev for å bedre fordøyelsen.
  19. Plasser røret tilbake i begerglass med 37 ° C forvarmet vann.
  20. Digest lymfeknute vev fragmenter for en annen 10 min mens sakte omrøring.
  21. Disaggregert lymfeknute vev fragmenter ved pipettering og miksing for 99 sykluser ved maksimal hastighet ved hjelp av en automatisert flerkanalspipette.
  22. Legg 7,5 mL av 0,5 M EDTA for å sikre opprettholdelse av enkeltcellesuspensjon.
  23. Disaggregert lymfeknute vev fragmenter av rørtte opp og blande for 99 sykluser ved maksimal hastighet ved hjelp av en automatisert flerkanalspipette.
  24. Legg 750 mL grunnleggende medium og passerer cellene gjennom en 70 mikrometer nylon mesh.
  25. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 1500 x g, 4 ° C.
  26. Stromale celler kan nå brukes for videre analyse.

2. Farging lymfeknute stromale celler

  1. Bruk en kombinasjon av anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antistoffer for å kunne gjenkjenne TRC, LEC, BEC og DN celler.
  2. Inkuber fordøyd lymfeknute vev med Levende / Døde tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) i 100 mL HBSS inneholder 2 % FCS i minst 20 min, 4 ° C, i mørket.
  3. Vask cellene legge 500 l av HBSS inneholder 2% FCS
  4. Sentrifuger cellesuspensjonen i 3 min ved 1500 x g, 4 ° C.
  5. Re-suspendere i 100 mL av HBSS inneholder 2% FCS.
  6. Kjør de fargede cellene i et flowcytometer equipped med følgende optikk: eksitasjon kilde med opptil tre lasere: blå (488 nm, luftkjølt, 20 mW solid state), rød (633 nm, 17 mW HeNe) og fiolett (405 nm, 30 mW solid state) .
  7. Gate CD45 - celler for å utelukke hematopoetiske celler.
  8. Gate singlets (FSC-W) og levende celler (LIVE / DEAD tracker) for å utelukke dubletter og døde celler.
  9. Plot gp38 vs CD31 å visualisere TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) og DN (gp38 - CD31 -) celler (se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokoll er en modifisert protokoll fordøyelse publisert av Link et al. 2007 6 med en kortere fordøyelse tid (45 min maksimum) på grunn av mekanisk dekomponering med et automatisk flerkanals pipette. I tillegg er fremgangsmåten mer standardisert, minimaliserer nedbrytning av overflatemarkører for forskjellige lymfeknute stromale celler og tillater håndtering av mer enn én prøve på samme tid.

Kollagenase IV og Kollagenase D i Links protokoll 6 og nåværende protokollen eller Kollagenase P og dispase i Fletchers protokoll 13 opprett lymfeknute stromal celler levedyktighet og spare fordøyelsen av flere overflatemarkører inkludert CD45, gp38 og CD31. For å teste de gjeldende protokollen, armhulen, brachialis og lyske lymfeknuter ble fjernet og fordøyd å isolere sine stromale celler. Analyse av CD45, gp38 og CD31 uttrykk viste tilstedeværelse av TRC, LEC, BEC og DN celler isolert fra C57BL / 6 mis (Figur 1, gating strategi).

Mekanisk stress kan redusere levedyktigheten til lymfeknute stromale celler under fordøyelsen. Sammenligning av levedyktighet av isolerte subpopulasjoner av stromale celler ved hjelp av de tre forskjellige protokoller, ble det funnet at levedyktigheten var større enn 95% i Fletcher protokollen, men lavere for begge Current protokoll og Link-protokoll (figur 2A), selv om Current Protocol viser bedre overlevelse i BEC undergruppe deretter koble protokollen. Den totale celler nummer gjenvunnet innlegg fordøyelsen av lymfeknute stromal celle undergrupper var noe høyere i Current protokollen i forhold til Link protokollen og Fletcher protokollen (figur 2A). Disse resultater viser at den nåværende protokoll opprettholder levedyktigheten lymfeknute stromale celler ligner publiserte protokoller. De store forskjellene mellom de tre protokollene er listet opp i tabell 1.

Overflatemarkører en re nødvendig å karakter lymfeknute stromale celler ved flowcytometri og til å isolere dem ved cellesortering. TRC og LMU isolert via Current, Link og Fletcher protokollene ble sammenlignet for IA b, CD140a, CD80, PD-L1 og CD40 uttrykk. Etter å isolere stromale celler ved alle tre protokoller, fant vi uttrykket av IA b, CD80, CD140a, PD-L1, og CD40 var høyere på fordøyelsen med CP og LP i begge TRC og LMU (Figur 2b). Disse resultater antyder at nedbrytning av enkelte overflatemolekyler med Collagenase IV og D er mindre sterk enn med Collagenase P og dispase.

Til sammen omfatter gjeldende protokoll en kort fordøyelsen kombinert med automatisert mekanisk disaggregation å minimere overflate markør nedbrytning av levedyktig lymfeknute stromale celler.

"/>
Figur 1. TRC, LEC, BEC, og DN celler flekker, gating, og kvantifisering. Lymfeknuter fra C57BL / 6 mus ble fordøyd etter gjeldende protokoll og farget med CD45, gp38 og CD31, Live / Dead to definere TRC, LEC, BEC, og DN celler ved strømningscytometri. Data viser representative resultatene av farging. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2
Figur 2. Livskraftig og overflate markør uttrykk for lymfeknute stromale celler. Lymfeknuter fra C57BL / 6 mus ble fordøyd etter Current (CP), Link (LP) og Fletcher protokoll (FP) og farget med CD45, gp38 og CD31 å definere TRC, LEC, BEC og DN celler ved flowcytometri. A) Viabilligheten og total celle nummer av alle lymfeknute stromal cellepopulasjoner etter Levende / Døde farging (n ≥ 5, sammenslåtte data fra to uavhengige eksperimenter, barer representerer SEM). B) Analyse av overflate uttrykk for IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) og CD40 (PE-Cy7) på TRC og LMU (n = 6 for FP og n = 11 for LP og CP , sammenslåtte data fra to uavhengige eksperimenter, barer representerer SEM). Geometriske MFI auto-fluorescens verdier for LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Klikk her for å se større bilde.

Gjeldende Protokoll Enzymer Gjeldende-protokollen Kjedeprotokoll-enzymer Link-protokollen FLetcher protokoll enzymer Fletcher-protokollen
Collagenase IV, DNase I 30 min, 37 ° C, omrøring Collagenase IV, DNAse I 30 min, 37 ° C Kollagenase P, dispase, DNAse jeg 20 min, 37 ° C, invertere hvert 5 min
Kollagenase D, DNase I 5 min, 37 ° C, under omrøring, resuspender Kollagenase D, DNAse jeg 20 min, 37 ° C Kollagenase P, dispase, DNAse jeg 10 min, 37 ° C, 30 sek resuspender
10 min, 37 ° C, omrøring Kollagenase D, DNAse jeg 37 ° C, resuspender hver 10 min inntil fullstendig fordøyelse Kollagenase P, dispase, DNAse jeg 37 ° C, resuspender hver 5 min inntil fullstendig fordøyelse
automatisert mekanisk resuspensjon

Tabell 1. Korte sammendrag av CP, LP, FP enzymer brukt og protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Studiet av lymfeknute stromale celler nylig ble en forskningsfokus på grunn av utviklingen av to publiserte fordøyelsen protokoller 6,13. Begge protokollene er tilstrekkelig til å få én lymfeknute stromale celler, men skiller seg i bruk av fordøyelsen enzymer og tidspunktet for fordøyelsen. Siden stromale celler og deres overflatemarkører er følsomme for enzymatisk oppslutning og mekanisk påkjenning, er nødvendig for en optimal protokoll.

Isolasjon av levedyktige lymfeknute stromale celler fra ferske dissekert lymfeknute er første skritt for å utføre fenotypiske og funksjonell analyse. Derfor er det viktig å nøye fordøye med definert konsentrasjon av enzymer, ved en stabil temperatur og i den angitte tid. To fordøyelse protokoller er blitt beskrevet 6,13, men med ganske lange nedbrytningstrinn. For å redusere tiden for fordøyelsen, ble mekanisk disaggregation inkludert og standardisert ved hjelp av en flerkanals pipette. På e av fordelene ved den aktuelle protokoll er at det tillater isolering av stromale celler i bare 45 min, og derfor minimalisere deres inkubasjonstid med fordøyelsesenzymer. I tillegg, under konstant omrøring i løpet av fordøyelsen tillater optimal tilgang av fordøyelsesenzymer til lymfeknute struktur. Videre ble fordøyelsen volumet redusert til 750 pl minimere mengden av enzym som brukes.

For stor mekanisk kraft forstyrrer tett veikryss, men kan føre til celledød på samme tid. Av denne grunn vi testet flere kombinasjoner av re-suspensjon sykluser og ulike dissosiasjon enheter. Vi har funnet at bruk av en automatisert flerkanalspipette tillater adskillelse innen to anvendelser av 99 sykluser; anvende et konstant trykk til cellene, og dette vil resultere i enkeltcellesuspensjon med optimal levedyktighet. Fire til seks prøvene kan blandes og pipettert på samme tid å redusere tiden for lymfeknute stromale celleisolasjon.

ontent "> har Fordøyelsen protokollen for å opprettholde overflaten ekspresjon av nesten alle molekyler. bare på denne måten samtidig farging med flere markører kan avsløre om en populasjon er homogen eller heterogen For eksempel, bruken av BP-3 og CD35 i TRC gp38 + CD31 -. åpner for visualisering og isolering av medullær TRC (Sanjiv Luther, personlig meddelelse) Videre dårlig karakterisert DN fraksjonen ble videre karakterisert som inneholder Aire + celler og pericyte lignende celler positive for inte α7 (anmeldt i 7, 13). Derfor er den foreliggende protokoll ble sammenlignet med de publiserte funn. Som vist i resultatene, tilsvarende frekvenser og antall av lymfeknute stromale celler ble oppnådd med den aktuelle protokoll, sammenlignet med de publiserte funn. Interessant, frekvens og antall isolerte TRC var høyest ved hjelp av Fletcher protokollen som tyder på en bedre dissosiasjon av TRC strukturer enn i dagens protokoll ogLink protokollen. Videre, ble ekspresjonen av forskjellige overflatemolekyler forbedret med Current Protocol forhold til Fletcher protokollen. Disse forskjellene i fordøyelsen metoden kan være årsaken til litt forskjellige uttrykk mønstre i lymfeknute stromal cellestudier 6,19,21. Det kan være nyttig for å teste forskjellige protokoller fordøyelse på grunn av fordelene ved hver protokoll. Den Current protokoll kan være bedre overflate uttrykk analyse for, mens Fletcher protokoll kan være nyttige for isolering av et høyt antall levedyktige celler for transkripsjon Analyse (som publisert i Malhotra et al. 7). Derfor sammenligne alle tre fordøyelsen protokoller kan være viktig for å oppnå optimale resultater etter isolering av lymfeknute stromale celler og bør bli sett på som komplementære.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
Isolering av Murint Lymph Node stromale celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter