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Immunology and Infection

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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Lymphknoten sind spezialisierte Fächer, wo adaptiven Immunantwort gegen fremde und Selbst-Antigene initiiert und koordiniert. Das hier vorgestellte Verfahren beschreibt eine kurze enzymatische Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Pipettieren Lymphknoten Einzelzellsuspension zu erhalten und Zugang zu lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen, die die Oberflächenexpression von mehreren Molekülen zu erhalten.

Lymphknoten Stromazellen bilden das Gerüst des Lymphknotens und erfüllen drei wichtige Funktionen: sie filtern ersten Körperflüssigkeiten, Antigene, Krankheitserreger und ihre Erregermuster (PAMPs) sowie Zytokine und Gefahr assoziierte molekulare Muster zu probieren (gedämpft) vorhanden im Körper. Zweitens, sie ziehen und weisen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und Lymphozyten zu interagieren und zu initiieren adaptive Immunantworten; und die dritte, bieten sie eine strukturelle Umgebung für die Homöostase und Differenzierung von Lymphozyten 1-3. Während der Entzündung Lymphknoten Stromazellen produzieren Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine, die Anpassung an Schwellungen damit die Organisation der Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DCs), T-und B-Zellen. Die Instrumentation von Immunantworten ist aufgrund der komplexen Strukturarchitektur von unterschiedlichen stromalen Zellpopulationen gebildet möglich.

Lymphknoten Stromazellen CD45-negativen Zellen und kann durch die Expression von CD31 und gp38 in Fibroblasten und Endothelzellen 1 -6 unterscheiden. Gp38 + CD31 - T-Zone definiert Retikulumzellen (TRC, die auch als FRC bekannt: fibroblastischen Retikulumzellen), gp38 + CD31 + definiert lymphatischen Endothelzellen (LEC), gp38 - CD31 + definiert Blut Endothelzellen (BEC). Weitere Charakterisierung von Subpopulationen zeigte die Existenz von anderen Lymphknoten Stromazellen. In der Tat wurde eine kleine pericyte artigen Zellpopulation innerhalb der gekennzeichnetgp38 - CD31 - Population 7. Daher ist die Anpassung des Isolationsverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von verschiedenen Lymphknoten Stromazellen vorteilhaft.

Vor der Entwicklung von Lymphknoten Stromazellen Verdauung Protokolle die Untersuchung von Lymphknoten Stromazellen wurde in situ Beobachtungen mit Gewebeabschnitt und Mikroskopie beschränkt. Dennoch zeigte strukturelle und funktionelle Untersuchungen wichtige Eigenschaften von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten Stromazellen mit podoplanin, Kollagen und extrazellulärer Matrix (ECM) Proteinen verbunden, um eine komplexe dreidimensionale Struktur 3 genannte Leitungssystem, die Lymphe und assoziierten-niedermolekulare Proteine ​​auf die hohe endotheliale Transporte vom subkapsuläre Sinus des Lymphknotens bilden Venolen in der T-Zellen-Zone 8. DCs sind in engem Kontakt mit Stroma-Zellen und in das rohrförmige con vorstehenden beachtenDuit Struktur zu Probenflüssigkeit und erkennen Antigene 8. Die Wechselwirkung von Lymphknoten Stromazellen (TRCs und LECs) mit DCs ist durch die Freisetzung und Präsentation von Chemokinen CCL21 und CCL19 9,10 vermittelt. CCL19 und CCL21 werden von der CCR7 Rezeptor erleichtert DCs und T-Zellen zu den Lymphknoten T-Zell-Zone 4,11 migrieren anerkannt. Trotz Verwendung ähnlicher Chemokine DCs und T-Zellen haben unterschiedliche Wanderungs in die Lymphknoten 12. Später mittels enzymatischer Verdauung der Lymphknoten und Isolierung von reinem Lymphknoten Stromazellen, funktionelle Studien über die Rolle der verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ihre Fähigkeit, mit DCs und T / B-Zellen interagieren 6,13 durchgeführt. Zuerst wird das Übersprechen zwischen IFN-γ produzierenden T-Effektorzellen und Lymphknoten Stromazellen induziert die Produktion der gezeigten T-Zell-Antworten und die Proliferation in den sekundären lymphoiden Organen 14-16 dämpfen Metaboliten Stickoxid. Zweiten, Lymphe node Stromazellen wurde berichtet, dass die Differenzierung der DC regulatorischen Untergruppen über die Produktion von IL-10-17 zu unterstützen und naiven T-Zell-Homöostase durch die Produktion von IL-7 6,18 modulieren. Drittens TLR-Expression in Lymphknoten stromalen Zellen legt nahe, dass Stromazellen sind anfällig für eine Infektion oder selbst Moleküle während Gewebeverletzung freigesetzt abgeleiteten Signals. Tatsächlich ist die Behandlung von Lymphknoten Stromazellen mit dem Liganden von TLR3 Poly (I: C) induziert eine geringe Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Expression und die Hochregulation von Co-inhibitorische Molekül PD-L1, jedoch nicht von kostimulatorischen Molekülen, was zu dramatische Veränderungen im peripheren Gewebe-Antigene Ausdruck 19. Mehrere Gruppen haben gezeigt, Lymphknoten Stromazellen exprimieren peripheren Gewebe-Antigene und induzieren Toleranz von selbstreaktiven T-Zellen 19,21-27. Daher, das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Lymphknoten Stromazellen und die andere Zugvögel und Wiedersident Lymphknotenzellen werden dabei helfen, neue Zielmoleküle zur Aktivierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen während der Entzündung ermöglichen zu finden. Daher wird die Umsetzung der veröffentlichten enzymatische Trennung des Lymphknotens erforderlich.

Zuvor veröffentlichten Protokolle verwenden verschiedene Kombinationen von Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung mit geringer mechanischer Belastung 6,19,20. Allerdings könnte lange Inkubationen mit Verdauungsenzymen oder andere Kombination von verschiedenen Enzym die Verdauung benötigt, um den Aktivierungsstatus zu analysieren und neue Lymphknoten Stromazellen identifizieren Oberflächenmoleküle abzubauen. Abhängig von der Art der stromalen Zellanalyse, kann die Link-Protocol-Protokoll oder Fletcher besser geeignet sein. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine etwas kürzere enzymatischen Verdau mit automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen minimieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht hoch reproduzierbare Isolation undUnterscheidung von Lymphknoten Stroma-Zellpopulationen mit geringer Variabilität und mehr als 95% Lebensfähigkeit. Die frisch isolierten Lymphknoten Stromazellen können direkt für Oberflächenmarker-Expression, Proteinanalyse und Transkriptionsstudien sowie Errichtung Stromazellen Leitungen verwendet, um funktionelle Assays in vitro durchzuführen.

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Protocol

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In diesem Video-Veröffentlichung und Protokoll wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit der von der kantonalen Behörde Basel-Stadt, Schweiz zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt.

1. Lymphknoten Vorbereitung und Verdauung

  1. Pre-Wärme-Wasser in einem Becher auf 37 ° C auf einem Magnetrührer mit Heizplatte.
  2. Bereiten Basis Medium wie folgt: DMEM-Medium (ohne Pyruvat) mit 2% FCS, 1,2 mM CaCl 2 und Pen / Strep (100 Einheiten Penicillin, 100 ug Streptomycin).
  3. Sterilisieren alle Dissektionsinstrumente vor dem Gebrauch.
  4. Einschläfern Lymphknoten Spendermäusen pro CO 2 Ersticken und aseptisch sezieren die Lymphknoten. Sezieren nicht die umgebende Fett. HINWEIS: Dieses Protokoll wird für periphere Haut-Lymphknoten (Leisten, brachial, Achsel) optimiert.
  5. Platzieren Lymphknoten in einer sterilen Petrischale mit 2 ml eiskaltem basischen Medium.
  6. Stören den Lymphknoten capsule mit zwei 25-G-Nadeln von 1-ml-Spritze befestigt.
  7. Übertragen des unterbrochenen Lymphknotengewebe in einem 5 ml-Polypropylen-Rundboden-Röhrchen mit 750 ul basischen Medium mit 1 mg / ml Collagenase IV und 40 ug / ml DNAse I ergänzt
  8. Fügen Sie einen sterilen Magnetrührer in jeder Röhre.
  9. Das Röhrchen in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmt Wasser und rühren die Rohre mit einer langsamen Geschwindigkeit (1 Runde / sec) für 30 min.
  10. Entfernen Sie den Schlauch vom Magnetrührer mit Heizplatte und lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen.
  11. Den Überstand in "nicht-Stromazellen" angereichert vorsichtig entfernen. HINWEIS: Wenn die Analyse der T, B, dendritischen Zellen und CD45 - gp38 - CD31 - vorgesehen ist, speichern Sie die "nicht-Stromazellen" Fraktion.
  12. Wasch übrigen Lymphknotengewebe einmal mit 750 ul Basismedium. Hinweis: Dieser Schritt nur erforderlich, wenn die Arbeit mit immunkompetenten Mäusen.
  13. Lassen Lymphknotenfragmente zu begleichen.
  14. Entfernen Sie dieNicht-Stromazellen-Schwimmfraktion.
  15. In den Lymphknoten-Fragmente 750 ul basischen Medium mit 3,5 mg ergänzt / ml Collagenase D und 40 ug / ml DNase I
  16. Ort Rohr zurück in den Becher mit dem 37 ° C vorgewärmt Wasser.
  17. Verdauen Lymphknotengewebe für 5 min, während langsam umrühren.
  18. Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen 700 ul für 10 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette. HINWEIS: Dies stört Lymphknotengewebe, um die Verdauung zu verbessern.
  19. Das Röhrchen zurück in das Becherglas mit 37 ° C vorgewärmte Wasser.
  20. Digest Lymphknotengewebefragmente für weitere 10 min unter langsamem Rühren.
  21. Disaggregate Lymphknotengewebefragmente durch Pipettieren und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit mit Hilfe eines automatisierten Mehrkanalpipette.
  22. Fügen 7,5 ul 0,5 M EDTA zur Aufrechterhaltung Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
  23. Disaggregierten Lymphknotengewebefragmente von RohrArmatur und Mischen für 99 Zyklen bei maximaler Geschwindigkeit unter Verwendung eines automatisierten Mehrkanalpipette.
  24. Fügen Sie 750 ul Basismedium und übergeben Zellen durch eine 70 um Nylon-Mesh.
  25. Zentrifuge Zellsuspension 5 min bei 1.500 × g, 4 ° C beträgt.
  26. Stromazellen können nun für die weitere Analyse verwendet werden.

2. Die Färbung der Lymphknoten Stromazellen

  1. Verwenden Sie eine Kombination von Anti-CD45, Anti-podoplanin (gp38), Anti-CD31-Antikörper gegen TRC, LEC, BEC und DN Zellen erfolgreich zu erkennen.
  2. Inkubieren der verdauten Lymphknotengewebe mit Live / Dead-Tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), Anti-CD31-APC (1: 200) in 100 ul HBSS, enthaltend 2 % FCS für mindestens 20 min, 4 ° C im Dunkeln.
  3. Waschen Sie die Zellen, indem 500 l HBSS, enthaltend 2% FCS
  4. Zentrifuge Zellsuspension 3 Minuten bei 1500 × g, 4 ° C beträgt.
  5. Resuspendieren in 100 ul HBSS, enthaltend 2% FCS.
  6. Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer equipped mit folgenden Optik: Anregungsquelle mit bis zu drei Laser: blau (488 nm, luftgekühlt, 20 mW Festkörper), Rot (633 nm, 17 mW HeNe) und Violett (405 nm, 30 mW Festkörper) .
  7. Tor CD45 - Zellen, die blutbildenden Zellen aus.
  8. Tor Slips (FSC-W) und lebenden Zellen (LIVE / DEAD-Tracker), um Dubletten und tote Zellen auszuschließen.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) und DN (gp38 - CD31 - Zellen) (siehe Abbildung 1) - Inhalts gp38 gegen CD31 zu TRC (gp38 + CD31) zu visualisieren.

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Representative Results

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Das vorliegende Protokoll ist ein von Link-et al., 2007 6 mit einer kürzeren Kochzeit (45 min maximal) durch mechanische Disaggregation mit einem automatisierten Mehrkanalpipette veröffentlicht modifizierten Verdauung Protokoll. Darüber hinaus ist das Verfahren eher standardisierte minimiert Abbau von Oberflächenmarkern auf verschiedenen Lymphknoten Stromazellen und ermöglicht die Behandlung von mehr als einer Probe gleichzeitig.

Kollagenase IV und Collagenase D Links-Protokoll 6 und aktuelle Protokoll oder Collagenase P und Dispase in Fletchers Protokoll 13 zu halten Lymphknoten Stromazellen Lebensfähigkeit und schonen die Verdauung von mehreren Oberflächenmarker CD45 einschließlich, gp38 und CD31. Um zu testen, die aktuelle Protokoll, Achsel-, Arm-und Leistenlymphknoten entfernt und verdaut, um ihre Stromazellen zu isolieren. Analyse von CD45, CD31 und gp38 Expression zeigte die Anwesenheit von TRC, LEC, BEC und DN Zellen aus C57BL / 6 m isoliertEis (Abbildung 1, Gating-Strategie).

Mechanische Belastung könnte die Lebensfähigkeit der Lymphknoten Stromazellen während der Verdauung zu reduzieren. Vergleicht man die Lebensfähigkeit von isolierten Subpopulationen von Stromazellen mit den drei verschiedenen Protokollen wurde festgestellt, dass die Tragfähigkeit war höher als 95% in der Fletcher-Protokoll, aber niedriger für beide Strom Protokoll und Link-Protokoll (2A), obwohl Aktuelle Protokoll Show besser Überleben in der BEC-Subpopulation dann Link-Protokoll. Die Gesamtzahl Zellen gewonnen Post Verdauung der Lymphknoten Stroma-Zelluntergruppen war etwas höher in Aktuelle Protokoll im Vergleich zu Link-Protokoll und Fletcher-Protokoll (Abbildung 2a). Diese Ergebnisse zeigen, dass das derzeitige Protokoll hält die Lebensfähigkeit der Lymphknoten Stromazellen ähnlich veröffentlichten Protokollen. Die Hauptunterschiede zwischen den drei Protokolle sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Oberflächenmarker ein Re die für die Charakterisierung Lymphknoten stromalen Zellen mittels Durchflusszytometrie und sie durch Zellsortierung isoliert. TRCs und LECs isoliert über Strom wurden Fletcher-Link und Protokolle für IA b, CD140a, CD80, PD-L1 und CD40 Expression im Vergleich. Nach der Trennung von Stromazellen durch alle drei Protokolle, fanden wir die Expression von IA b, CD80, CD140a, PD-L1 und CD40 war höher bei Verdauung mit CP und LP in beiden TRCs und LECs (2B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau einiger Oberflächenmoleküle mit Collagenase IV und D weniger stark als mit Collagenase P und Dispase.

Zusammengenommen umfasst das aktuelle Protokoll eine kurze Verdauung kombiniert mit automatisierten mechanischen Aufschlüsselung auf Oberflächenmarker Abbau von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen zu minimieren.

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Abbildung 1. TRC, LEC, BEC, und DN Zellen Färbung, Gating und Quantifizierung. Lymphknoten von C57BL / 6 Mäuse wurden nach dem aktuellen Protokoll verdaut und mit CD45, CD31 und gp38, Live / Dead gefärbt, um TRC, LEC zu definieren, BEC und DN Zellen mittels Durchflusszytometrie. Daten zeigen repräsentative Ergebnisse der Färbung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit und Oberflächenmarkerexpression von Lymphknoten Stromazellen. Lymphknoten von C57BL / 6 Mäuse wurden nach dem Strom (CP), LINK (LP) und Fletcher Protokoll (FP) und mit CD45, gp38 und CD31 gefärbt, um zu definieren verdaut TRC, LEC, BEC und DN Zellen mittels Durchflusszytometrie. A) Viabilkeit und die Gesamtzellzahl aller Lymphknoten stromalen Zellpopulationen nach lebend / tot-Färbung (n ≥ 5, gepoolten Daten von 2 unabhängigen Experimenten Balken repräsentieren SEM). b) Analyse der Oberflächenexpression von IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) und CD40 (PE-Cy7) auf TRCs und LECs (n = 6 für FP und n = 11 für LP und CP , gepoolten Daten von 2 unabhängigen Experimenten, Balken repräsentieren SEM). Geometrische MFI Autofluoreszenz-Werte für LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Aktuelle Protokoll-Enzyme Strom-Protokoll Link Protocol-Enzyme Link-Protokoll FLetcher Protokoll-Enzyme Fletcher-Protokoll
Collagenase IV, DNase I 30 min, 37 ° C, unter Rühren Collagenase IV, DNAse I 30 min, 37 ° C Collagenase P, Dispase, DNAse I 20 min, 37 ° C, kehren alle 5 min
Collagenase D, DNase I 5 min, 37 ° C, Rühren, resuspendieren Collagenase D, DNAse I 20 min, 37 ° C Collagenase P, Dispase, DNAse I 10 min, 37 ° C, 30 sec resuspendieren
10 min, 37 ° C, unter Rühren Collagenase D, DNAse I 37 ° C, Resuspendieren alle 10 min bis zur vollständigen Verdauung Collagenase P, Dispase, DNAse I 37 ° C, Resuspendieren alle 5 min bis zur vollständigen Verdauung
automatisierten mechanischen Resuspension

Tabelle 1. Kurzzusammenfassungen von CP, LP, verwendet und Protokolle FP Enzyme.

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Discussion

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Die Studie von Lymphknoten Stromazellen vor kurzem wurde ein Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung von zwei Protokolle veröffentlicht Verdauung 6,13. Beide Protokolle angemessen sind, um einzelne Lymphknoten Stromazellen zu erhalten, unterscheiden sich jedoch in der Verwendung von Verdauungsenzymen und dem Zeitpunkt der Verdauung. Da Stromazellen und ihre Oberflächenmarker empfindlich enzymatischen Verdau und mechanischer Belastung sind, wird ein optimiertes Protokoll erforderlich.

Die Isolierung von lebensfähigen Lymphknoten Stromazellen aus frisch sezierten Lymphknoten ist der erste Schritt, um phänotypische und funktionelle Analyse. Daher ist es wichtig, sorgfältig zu verdauen mit definierter Konzentration an Enzymen, um eine stabile Temperatur und für die angegebene Zeit. Zwei Verdauung Protokolle wurden 6,13 beschrieben, jedoch mit relativ langen Abbaustufen. Um die Zeit der Verdauung zu reduzieren, wurde mechanische Disaggregation enthalten und standardisiert mit einer Mehrkanalpipette. Auf e der Vorteile des aktuellen Protokolls ist, dass es erlaubt die Isolierung von Stromazellen in nur 45 min, damit die Minimierung ihrer Inkubation mit Verdauungsenzymen. Zusätzlich konstantem Rühren während des Aufschlusses kann der optimale Zugriff auf die Verdauungsenzyme in die Lymphknotenstruktur. Darüber hinaus wurde der Verdau Volumen auf 750 ul Minimierung der Menge des verwendeten Enzyms reduziert.

Übermäßige mechanische Kraft stört Tight Junctions könnte aber Zelltod zur gleichen Zeit führen. Aus diesem Grund haben wir getestet mehrere Kombinationen von Resuspension Zyklen und verschiedene Dissoziation Geräte. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung eines automatisierten Mehrkanalpipette ermöglicht die Dissoziation innerhalb 2 Anwendungen von 99 Zyklen; Anwendung eines konstanten Druckes in den Zellen, und dies wird in Einzelzellsuspension mit optimalen Lebensfähigkeit führen. Vier bis sechs Proben können gemischt und pipettiert gleichzeitig die Verringerung der Zeit von Lymphknoten stromalen Zellisolierung.

NHALT "> Die Verdau-Protokoll hat die Oberflächenexpression von fast allen Molekülen zu erhalten;. nur auf diese Weise die gleichzeitige Färbung mit mehreren Marker offenbaren, wenn eine Population homogen oder heterogen beispielsweise der Einsatz von BP-3 und CD35 in der TRC gp38 + CD31 -. ermöglicht die Visualisierung und Isolierung von Mark TRC (Sanjiv Luther, persönliche Mitteilung) Außerdem wurde die schlecht charakterisierte DN Fraktion wurde weiter als haltigen Aire +-Zellen und Perizyten wie Zellen, die positiv für die Integrin α7 gekennzeichnet (Bewertung in 7, 13). Daher ist die vorliegende Protokoll wurde auf die veröffentlichten Wieder verglichen. Wie in den Ergebnissen, ähnlichen Frequenzen und die Anzahl der Lymphknoten Stromazellen gezeigt sind, wurden mit dem aktuellen Protokoll im Vergleich zu den veröffentlichten Einsen erhalten. Interessanter, Frequenz und Anzahl isolierter TRC Am höchsten waren mit Fletcher Protokoll was auf eine bessere Dissoziation der TRC Strukturen als in der bisherigen Protokolls undLink-Protokoll. Darüber hinaus wurde die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle des geltenden Protokolls im Vergleich zu Fletcher Protokoll erweitert. Diese Unterschiede in der Aufschlußverfahren könnte der Grund für die etwas unterschiedliche Expressionsmuster in den Lymphknoten Stromazellen Studien 6,19,21 sein. Es könnte sinnvoll sein, unterschiedliche Protokolle Verdauung, weil die Vorteile der einzelnen Protokolle zu testen. Das derzeitige Protokoll könnte bessere Oberflächenexpressionsanalyse, während Fletcher Protokoll kann für die Isolierung von großen Anzahl von lebensfähigen Zellen zur Transkriptionsanalyse (wie in Malhotra et al. 7 veröffentlicht). Daher Vergleich aller drei Protokolle Verdauung könnte wichtig, um optimale Ergebnisse nach der Isolierung von Lymphknoten Stromazellen zu erhalten und sollte als Ergänzung gesehen werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

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References

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Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

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