Isolering af murine lymfeknuder stromacellers
Summary
Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.
Abstract
Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.
Introduction
Lymfeknuder er specialiserede segmenter, hvor adaptive immunrespons mod fremmede og selvantigener indledes og koordineres. Fremgangsmåden præsenteres her beskriver en kort enzymatisk nedbrydning kombineret med automatiseret mekanisk pipettering at opnå lymfeknude enkelt cellesuspension og få adgang til brugbare lymfeknude stromaceller der opretholder overfladeekspression af en række forskellige molekyler.
Lymfeknude stromacelle danner stillads af lymfeknude og opfylde tre hovedfunktioner: først de filtrerer kropsvæsker at prøve antigener, patogener og deres patogen forbundet molekylære mønster (PAMPs), samt cytokiner og fare forbundet molekylær mønster (dæmper) til stede i kroppen. For det andet, de tiltrækker og instruere antigenpræsenterende celler (APC) og lymfocytter til at interagere og iværksætte adaptive immunrespons; og tredje, giver de en strukturel miljø for homeostase og differentieringen af lymfocytter en-3. Under inflammation lymfeknude stromale celler producerer vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner, tilpasse sig hævelse derved organisere samspillet mellem dendritiske celler (DCS), T og B-celler. Orkestrering af immunreaktioner er kun mulig på grund af den komplekse strukturelle arkitektur udgøres af forskellige stromale celle populationer.
Lymfeknude Stromaceller CD45 negative celler og kan skelnes ved ekspression af CD31 eller gp38 i fibroblastiske og endotelceller 1 -6. Gp38 + CD31 – definerer T-zone retikulære celler (TRC, også kendt som FRC: fibroblastiske retikulære celler) gp38 + CD31 + definerer lymfeendotelceller (LEC), gp38 – CD31 + definerer blod endotelceller (BEC). Yderligere karakterisering af subpopulationer afslørede eksistensen af andre lymfeknude stromale celler. Faktisk blev en lille pericyt-lignende celle befolkning karakteriseret inden forgp38 – CD31 – befolkning 7. Derfor tilpasning af isolation procedure er fordelagtig til identifikation og karakterisering af de funktionelle egenskaber af forskellige lymfeknude stromaceller.
Før udviklingen af lymfeknude stromaceller fordøjelse protokoller studiet af lymfeknude stromaceller blev begrænset til in situ observationer ved hjælp af vævssnit og mikroskopi. Ikke desto mindre strukturelle og funktionelle undersøgelser viste vigtigste egenskaber lymfeknude stromale celler. Lymfeknude stromaceller forbundet med podoplanin, kollagen og ekstracellulær matrix (ECM) proteiner til dannelse af et kompleks 3-dimensionel struktur kaldet rørsystem, der transporterer lymfeknuder og tilhørende lav molekylmasse proteiner fra subkapsulære hule lymfeknudesygdom til den høje endotel venuler i T-celler zone 8. DC'er er i tæt kontakt med stroma-celler og kan observeres rager ind i den rørformede conduit struktur prøve væske og detektere antigener 8. Interaktionen af lymfeknude stromale celler (TRCs og LEC) med udviklingslandene medieres af frigivelsen og præsentation af chemokiner CCL21 og CCL19 9,10. CCL19 og CCL21 er anerkendt af CCR7 receptoren letter DCer og T-celler til at migrere til lymfeknuderne T-celle zone 4,11. Trods anvendelse af lignende kemokiner, DCS og T-celler har forskellige trækruter i lymfeknuderne 12. Senere, ved hjælp af enzymatisk fordøjelse af lymfeknude og isolation af rene lymfeknude stromaceller blev funktionelle undersøgelser udført på den rolle, som forskellige lymfeknude stromale celler og deres evne til at interagere med DC'er og T / B-celler 6,13. Først krydstale mellem IFN-γ producerende effektor T-celler og lymfeknude stromale celler inducerer produktionen af metabolitten nitrogenoxid vist sig at dæmpe T-celle responser og proliferation i de sekundære lymfoide organer 14-16. For det andet, lymfe node stromale celler er blevet rapporteret at understøtte differentieringen af regulerende DC delmængder via produktionen af IL-10 17, og at modulere naiv T-celle-homeostase via produktionen af IL-7 6,18. For det tredje, TLR ekspression i lymfeknude stromaceller tyder på, at stromacellerne er modtagelige for at signalere afledt af en infektion eller en selvstændig molekyler frigives under vævsskade. Faktisk behandling af lymfeknude stromaceller med liganden TLR3 poly (I: C) inducerer en beskeden opregulering af dominerende histokompatibilitetskompleks-klasse I-ekspression og opregulering af co-inhiberende molekyle PD-L1, men ikke af costimulerende molekyler, hvilket resulterer i dramatiske ændringer i perifere væv antigener udtryk 19. Flere grupper har vist lymfeknude stromaceller udtrykker perifere vaevsantigener og inducere tolerance over for selvnedbrydende T-celler 19,21-27. Derfor forstå samspillet mellem lymfeknude stromale celler og andre vandrende og resident lymfeknudeceller vil hjælpe med at finde nye målmolekyler at tillade aktivering eller undertrykkelse af immunreaktioner under inflammation. Derfor er der behov for gennemførelsen af den offentliggjorte enzymatisk adskillelse af lymfeknude.
Tidligere publicerede protokoller anvender forskellige kombinationer af collagenase-baserede enzymatisk fordøjelse med lav mekanisk belastning 6,19,20. Lange inkubationer med fordøjelse enzymer eller den anden kombination af fordøjelsen enzym kan dog nedbryde forskellige overflademolekyler kræves for at analysere status aktivering og til at identificere nye lymfeknude stromale celler. Afhængig af analysen stromacellen kan Link protokollen eller Fletcher protokol være mere velegnet. I den beskrevne procedure, er en lidt kortere enzymatisk nedbrydning kombineret med automatiseret mekanisk opdeling for at minimere overflade markør nedbrydning af levedygtige lymfeknude stromaceller. Denne procedure gør det muligt for meget reproducerbar isolation ogskelnen af lymfeknude stromale celle populationer med lav variation og mere end 95% levedygtighed. De frisk isolerede lymfeknudeceller stromale celler kan anvendes direkte til overfladen markør ekspression proteinanalyse og transkriptionelle undersøgelser samt etablering af stromale cellelinier til at udføre funktionelle assays in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af lymfeknude stromalceller nylig blev et forskningsfokus på grund af udviklingen af to offentliggjorte fordøjelse protokoller 6,13. Begge protokoller er tilstrækkelige til at opnå en enkelt lymfeknude stromale celler, men adskiller sig i brugen af fordøjelsesenzymer og tidspunktet for fordøjelsen. Da stromaceller og deres overflademarkører er følsomme over for enzymatisk fordøjelse og mekanisk belastning, er en optimeret protokol kræves.
Isoleringen af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.
Materials
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyren Round-Bottom Tubes 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating funktion | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petridishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell – Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -. W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
