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Immunology and Infection

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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Les ganglions lymphatiques sont des compartiments spécialisés où les réponses immunitaires adaptatives contre des antigènes étrangers autonomes et sont initiés et coordonnés. La procédure présentée ici décrit une digestion enzymatique courte combinée avec pipetage mécanique automatisé pour obtenir des ganglions lymphatiques suspension cellulaire unique et accéder aux cellules stromales ganglionnaires viables qui maintiennent l'expression de surface de plusieurs molécules.

former cellules stromales ganglionnaire l'échafaud du ganglion lymphatique et remplit trois grandes fonctions: ils filtrent première fluides corporels pour déguster des antigènes, des agents pathogènes et leur pathogène motif moléculaire associé (PAMP), ainsi que des cytokines et danger motif moléculaire associé (atténue) présente dans le corps. Deuxièmement, ils attirent et instruisent les cellules présentatrices d'antigènes (APC) et des lymphocytes d'interagir et d'initier des réponses immunitaires adaptatives; et la troisième, ils fournissent un environnement structurel pour l'homéostasie et la différenciation des lymphocytes 1-3. Pendant les cellules ganglionnaires du stroma de l'inflammation produisent des facteurs de croissance, des cytokines et des chimiokines, à adapter l'organisation de gonflement ainsi l'interaction entre les cellules dendritiques (DCs), T et les cellules B. L'orchestration de réponses immunitaires est seulement possible en raison de l'architecture structurale complexe formé par les différentes populations de cellules stromales.

Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont des cellules CD45 négatives et peuvent être distinguées par l'expression de CD31 ou de gp38 dans les cellules endothéliales et fibroblastiques 1 -6. Gp38 + CD31 - définit les cellules de la zone T réticulaire (TRC, également connu sous le FRC: les cellules réticulaires fibroblastiques), gp38 + CD31 + définit cellules lymphatiques endothéliales (LEC), gp38 - CD31 + définit les cellules endothéliales de sang (BEC). En outre, la caractérisation des sous-populations a révélé l'existence d'autres cellules stromales de ganglions lymphatiques. En effet, une petite population de cellules pericyte comme a été caractérisée dans legp38 - CD31 - population 7. Par conséquent, l'adaptation de la procédure d'isolement est avantageux pour l'identification et la caractérisation des propriétés fonctionnelles différentes cellules stromales de ganglions lymphatiques.

Avant le développement des ganglions lymphatiques cellules stromales digestion protocoles de l'étude des cellules stromales de ganglion lymphatique a été limitée à des observations in situ en utilisant la section de tissu et la microscopie. Néanmoins, des études structurales et fonctionnelles ont montré des caractéristiques importantes des cellules stromales de ganglions lymphatiques. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques sont associés à podoplanin, du collagène et de la matrice extracellulaire des protéines (ECM) pour former un complexe d'une structure en 3 dimensions appelé système de conduites qui transporte les protéines lymphatiques et de masse moléculaire associé-bas à partir du sinus sous-capsulaire du ganglion de la haute endothéliale veinules dans la zone des cellules T 8. DCs sont en contact étroit avec les cellules du stroma et peut être observé dans la saillie tubulaire constructure duit à l'échantillon liquide et de détecter les antigènes 8. L'interaction des cellules stromales de ganglions lymphatiques (TRC et ESL) avec les PED est médiée par la presse et la présentation des chimiokines CCL21 et CCL19 9,10. CCL19 et CCL21 sont reconnus par le récepteur CCR7 faciliter les DC et les cellules T à migrer vers la zone des cellules T des ganglions lymphatiques 4,11. Malgré l'utilisation de chimiokines similaires, les cellules T ont PED et les routes de migration différentes dans les ganglions lymphatiques 12. Par la suite, en utilisant une digestion enzymatique de ganglion lymphatique et de l'isolement des cellules stromales de ganglions lymphatiques pures, des études fonctionnelles ont été effectuées sur le rôle des différentes cellules des ganglions lymphatiques de stroma et de leur capacité à interagir avec des DC et des lymphocytes T / B 6,13. Tout d'abord, la diaphonie entre les cellules T productrices d'IFN-effectrices de γ et de cellules stromales de ganglions lymphatiques induit la production d'oxyde nitrique du métabolite montré à atténuer les réponses des lymphocytes T et la prolifération dans des organes lymphoïdes secondaires 14 à 16. Deuxièmement, la lymphe node cellules stromales ont été rapportés pour soutenir la différenciation de sous-ensembles de régulation à courant continu par l'intermédiaire de la production d'IL-10 17, et à moduler naïf homéostasie des cellules T par l'intermédiaire de la production d'IL-7 6,18. En troisième lieu, l'expression des TLR dans les cellules stromales de ganglions lymphatiques suggère que les cellules stromales sont sensibles à un signal dérivé de l'infection ou des auto-molécules libéré au cours de la lésion tissulaire. En effet, le traitement de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec le ligand de TLR3 poly (I: C) induit une régulation à la hausse modeste de grande expression d'histocompatibilité de classe complexe I et la régulation positive de co-inhibiteur molécule PD-L1, mais pas de molécules de costimulation, ce qui des changements dramatiques dans les tissus périphériques antigènes expression 19. Plusieurs groupes ont montré des cellules stromales de ganglions lymphatiques expriment des antigènes de tissus périphériques et induire une tolérance des cellules T autoréactives 19,21-27. Par conséquent, la compréhension des interactions entre les cellules stromales de ganglions lymphatiques et l'autre re migratoire etcellules ganglionnaires sident aideront à trouver de nouvelles molécules cibles pour permettre l'activation ou la suppression de la réponse immunitaire lors de l'inflammation. Par conséquent, la mise en œuvre de la séparation enzymatique de la publication du ganglion lymphatique est nécessaire.

Protocoles publiés précédemment utilisent différentes combinaisons de base de la collagénase-digestion enzymatique avec une faible contrainte mécanique 6,19,20. Cependant, de longues incubations avec des enzymes de digestion ou de la combinaison différente de digestion enzymatique peuvent dégrader diverses molécules de surface nécessaires pour analyser l'état d'activation et d'identifier de nouvelles cellules stromales ganglionnaires. Selon le type de l'analyse de cellules du stroma, le Protocole de liaison Protocole Fletcher ou peut-être plus approprié. Dans la procédure décrite, une digestion enzymatique légèrement plus courte est associée à la ventilation mécanique automatisé pour minimiser la dégradation de surface marqueur des cellules stromales nœud lymphatiques viable. Cette procédure permet d'isoler hautement reproductible etdistinction des populations de cellules stromales de ganglions lymphatiques avec une faible variabilité et plus de 95% de viabilité. Les cellules stromales de ganglions lymphatiques fraîchement isolées peuvent être directement utilisés pour l'expression de marqueurs de surface, l'analyse des protéines, et des études de la transcription, ainsi que la création de lignées de cellules stromales pour effectuer des tests fonctionnels in vitro.

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Protocol

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Dans cette publication vidéo et de protocole, toutes les procédures d'animaux ont été réalisées conformément au protocole approuvé pour les animaux par cantonal Autorité de Bâle-Ville, Suisse.

1. ganglions lymphatiques Préparation et digestion

  1. L'eau de pré-chauffage dans un bêcher à 37 ° C sur un agitateur magnétique à plaque chauffante.
  2. Préparer de base moyen de la manière suivante: milieu DMEM (sans pyruvate) supplémenté avec 2% de FCS, 1,2 mM de CaCl2 et Pen / Strep (100 unités de pénicilline, 100 ug de streptomycine).
  3. Stériliser tous les instruments de dissection avant utilisation.
  4. Euthanasier souris ganglionnaire donateurs par CO 2 asphyxie et disséquer de façon aseptique les ganglions lymphatiques. Ne pas disséquer la graisse entourant. NOTE: Ce protocole est optimisé pour le noeud périphérique drainage lymphatique peau (inguinale, brachiale, axillaire).
  5. Placez les ganglions lymphatiques dans une boîte de Pétri stérile contenant 2 ml de glace milieu basique froid.
  6. Perturber le ganglion lymphatique capsule l'aide de deux aiguilles de 25 G fixés sur seringue de 1 ml.
  7. Transférer le tissu des ganglions lymphatiques perturbé dans un tube à fond rond de 5 ml contenant 750 polypropylène milieu de base supplémenté avec ul de 1 mg / ml de collagénase IV et 40 ug / ml de DNAse I.
  8. Ajouter un agitateur magnétique stérile dans chaque tube.
  9. Placer le tube dans le bécher avec 37 ° C préchauffé eau et remuer les tubes à une vitesse lente (1 tour / s) pendant 30 min.
  10. Retirer le tube de l'agitateur magnétique avec plaque chauffante et laisser des fragments de ganglions lymphatiques s'installent.
  11. Retirez délicatement le surnageant enrichi en "cellule non-stromal". REMARQUE: Si l'analyse de T, B, les cellules dendritiques et CD45 - CD31 - gp38 - est prévu, sauf la "cellules stromales non" fraction.
  12. Laver le tissu des ganglions lymphatiques restant une fois avec 750 pi de milieu basique. REMARQUE: Cette étape est nécessaire uniquement si vous travaillez avec des souris immuno-compétentes.
  13. Laissez fragments de ganglions lymphatiques s'installent.
  14. Retirez lefraction flottante des cellules non-stroma.
  15. Ajouter aux fragments de ganglion lymphatique 750 pi de milieu de base supplémenté avec 3,5 mg / ml de collagénase D et 40 pg / ml de DNase I.
  16. Placer le tube de retour dans le bécher contenant 37 ° C préchauffé eau.
  17. Digérer le tissu des ganglions lymphatiques de 5 min, tout en agitant lentement.
  18. Lymphatiques fragments de tissus de noeud désagrégées par pipetage et mélange 700 ul de 10 cycles à la vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé. NOTE: Ce qui perturbe le tissu des ganglions lymphatiques pour améliorer la digestion.
  19. Placer le tube de retour dans le bécher avec 37 ° C de l'eau préchauffée.
  20. Des fragments de tissu de ganglion lymphatique digérer pendant encore 10 minutes tout en remuant lentement.
  21. Ventiler fragments de tissus de ganglions lymphatiques par pipetage et mélange pendant 99 cycles à vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé.
  22. Ajouter 7,5 pl d'EDTA 0,5 M pour assurer le maintien de la suspension de cellules isolées.
  23. Des fragments de tissu de ganglion lymphatique Ventiler par tuyauPrép et en mélangeant pendant 99 cycles à vitesse maximale à l'aide d'une pipette multicanaux automatisé.
  24. Ajouter 750 pi de milieu de base et passer les cellules à travers une maille de nylon de 70 um.
  25. Centrifugeuse suspension cellulaire 5 min à 1500 xg, 4 ° C.
  26. Les cellules stromales peuvent maintenant être utilisés pour une analyse ultérieure.

2. coloration des cellules des ganglions lymphatiques stromales

  1. Utilisez une combinaison de l'anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorps anti-CD31 de reconnaître avec succès des cellules TRC, ESL, BEC et DN.
  2. Incuber le tissu des ganglions lymphatiques digéré avec Live traqueur / Dead, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) dans 100 ul de HBSS contenant 2 % de FCS pendant au moins 20 min, 4 ° C, dans l'obscurité.
  3. Laver les cellules en ajoutant 500 l de HBSS contenant 2% de SVF
  4. Centrifugeuse suspension cellulaire 3 min à 1500 xg, 4 ° C.
  5. Re-suspendre dans 100 ul de HBSS contenant 2% de FCS.
  6. Exécutez les cellules colorées dans un cytomètre de flux EQUIPPed avec les optiques suivantes: source d'excitation avec un maximum de trois lasers: bleu (488 nm, refroidi par air, 20 mW à l'état solide), rouge (633 nm, 17 mW HeNe) et le violet (405 nm, 30 mW à l'état solide) .
  7. Porte CD45 - cellules à exclure les cellules hématopoïétiques.
  8. maillots Gate (FSC-W) et des cellules vivantes (ELS / trackers DEAD) à exclure doublets et les cellules mortes.
  9. Terrain gp38 contre CD31 pour visualiser TRC (gp38 + CD31 -), ESL (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) des cellules (voir la figure 1) et DN (gp38 - - CD31).

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Representative Results

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Le présent protocole est un protocole de modification de digestion publié par Link et al. 2007 6 avec un temps de digestion plus courte (45 minutes au maximum), en raison de la désagrégation mécanique avec une pipette à canaux multiples automatisé. En outre, la procédure est plus uniforme, minimise la dégradation de marqueurs de surface sur les différentes cellules du stroma de ganglion lymphatique et permet la manipulation de plus d'un échantillon à la fois.

Collagénase IV et la collagénase D Liens protocole 6 et protocole actuel ou collagénase P et Dispase à Fletchers protocole 13 de maintenir des ganglions lymphatiques stromale la viabilité des cellules et épargnent la digestion de plusieurs marqueurs de surface, y compris CD45, CD31 et gp38. Pour tester les nœuds protocole, axillaires, brachial et lymphatiques inguinal actuels ont été enlevés et digérés pour isoler leurs cellules stromales. Analyse de CD45, CD31 et gp38 expression démontré la présence de TRC, ESL, BEC et DN cellules isolées à partir de souris C57BL / 6 mglace (Figure 1, la stratégie de déclenchement).

Le stress mécanique peut réduire la viabilité des cellules stromales de nœud lymphatique lors de la digestion. La comparaison de la viabilité des sous-populations isolées de cellules de stroma à l'aide des trois protocoles différents, il a été constaté que la viabilité était supérieure à 95% dans le protocole Fletcher, mais inférieur à la fois pour le protocole actuel et un lien de protocole (figure 2A), bien que courante émission de protocole meilleur survie dans la sous-population BEC alors Protocole de liaison. Le nombre de cellules totales récupéré après digestion des sous-ensembles de cellules stromales ganglionnaires était légèrement plus élevé dans le protocole actuel par rapport à Lien protocole et protocole Fletcher (figure 2A). Ces résultats démontrent que le protocole actuel maintient la viabilité des cellules stromales de ganglions lymphatiques semblables à des protocoles publiés. Les principales différences entre les trois protocoles sont répertoriés dans le tableau 1.

marqueurs de surface d'un re nécessaire pour caractériser les cellules stromales nœud lymphatiques par cytométrie de flux et de les isoler par tri cellulaire. CRT et ESL isolé par Courant, protocoles Link et Fletcher ont été comparées pour IA b, CD140a, CD80, PD-L1 et l'expression de CD40. Après avoir isolé les cellules stromales par les trois protocoles, nous avons trouvé l'expression de IA b, CD80, CD140a, PD-L1, et CD40 était plus élevé lors d'une digestion avec CP et LP dans les deux CRT et ESL (figure 2B). Ces résultats suggèrent que la dégradation de certaines molécules de surface avec de la collagénase IV et D sont moins fortes que de la collagénase P et la dispase.

Pris ensemble, le protocole de courant comprend un court digestion combinée à la ventilation mécanique automatisé afin de minimiser la dégradation de la surface de marqueur des cellules stromales noeud lymphatiques viable.

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Figure 1: TRC, les cellules LEC, BEC, et DN coloration, déclenchement, et de quantification. Les ganglions lymphatiques de souris C57BL / 6 ont été digérés en suivant le protocole actuel et colorées avec CD45, CD31 et gp38, Live / Dead to définir TRC, LEC, BEC, et DN cellules par cytométrie de flux. Les données montrent des résultats représentatifs de la coloration. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2: Viabilité et surface expression du marqueur de cellules stromales de ganglions lymphatiques. Nœuds lymphatiques de souris C57BL / 6 ont été digérés après l'actuel (CP), de Link (LP) et le protocole de Fletcher (FP) et colorées avec CD45, gp38 et CD31 pour définir TRC, ESL, BEC et DN cellules par cytométrie de flux. A) VIABILlité et le nombre total de cellules de toutes les sous-populations de cellules ganglionnaires du stroma après en direct coloration / Dead (n ≥ 5, les données regroupées de deux expériences indépendantes, barres représentent SEM). B) Analyse de l'expression de surface de IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) et CD40 (PE-Cy7) sur les CRT et ESL (n = 6 pour FP et n = 11 pour LP et CP , les données regroupées des deux expériences indépendantes, barres représentent SEM). IMF valeurs géométriques auto-fluorescence pour LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Actuel Protocole de-enzymes Current protocole Protocole de liaison de-enzymes Link-protocole FaProtocole-enzymes Letcher Fletcher-protocole
La collagénase IV, la DNase I 30 min, 37 ° C, sous agitation La collagénase IV, la DNAse I 30 min, 37 ° C La collagénase P, la dispase, la DNAse I 20 min, 37 ° C, 5 min à chaque inverser
La collagénase D, la DNase I 5 min, 37 ° C, sous agitation, remettre en suspension La collagénase D, la DNAse I 20 min, 37 ° C La collagénase P, la dispase, la DNAse I 10 min, 37 ° C, remise en suspension 30 sec
10 min, 37 ° C, sous agitation La collagénase D, la DNAse I 37 ° C, remise en suspension toutes les 10 minutes jusqu'à ce que la digestion complète La collagénase P, la dispase, la DNAse I 37 ° C, remise en suspension toutes les 5 minutes jusqu'à ce que la digestion complète
remise en suspension mécanique automatisé

Tableau 1: De brefs résumés des CP, LP, enzymes PF utilisés et les protocoles.

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Discussion

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L'étude des cellules stromales de ganglions lymphatiques est récemment devenu un axe de recherche en raison du développement de deux protocoles de digestion publiés 6,13. Les deux protocoles sont suffisants pour obtenir des cellules stromales noeud unique lymphatiques, mais diffèrent dans l'utilisation d'enzymes de digestion et le temps de digestion. Etant donné que les cellules stromales et les marqueurs de surface sont sensibles à la digestion enzymatique et une contrainte mécanique, un protocole optimisé est nécessaire.

L'isolement des cellules de ganglion lymphatique de stroma viables à partir de ganglions lymphatiques fraîchement découpé est la première étape en vue d'effectuer des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Par conséquent, il est important de digérer avec soin la concentration d'enzymes défini, stable à une température et pendant le temps indiqué. Deux protocoles de digestion ont été décrits 6,13, mais avec des étapes assez longues de digestion. Pour réduire le temps de digestion, la ventilation mécanique a été inclus et normalisé à l'aide d'une pipette multicanaux. Sur e les avantages du protocole actuel est qu'il permet l'isolement des cellules stromales en seulement 45 minutes, ce qui réduit par conséquent le temps d'incubation avec des enzymes de digestion. En outre, une agitation constante pendant la digestion permet l'accès optimal des enzymes de digestion de la structure des ganglions lymphatiques. En outre, le volume de la digestion a été réduit à 750 ul de minimiser la quantité d'enzyme utilisée.

La contrainte mécanique excessive perturbe jonctions serrées, mais peut provoquer la mort cellulaire à la fois. Pour cette raison, nous avons testé plusieurs combinaisons de cycles de remise en suspension et les différents dispositifs de dissociation. Nous avons constaté que l'utilisation d'une pipette à canaux multiples automatisé permet la dissociation à l'intérieur de deux applications de 99 cycles; appliquer une pression constante pour les cellules, ce qui se traduira par la suspension de cellules individuelles avec une viabilité optimale. Quatre à six échantillons peuvent être mélangés et introduits à la pipette dans le même temps la réduction du temps de ganglion lymphatique isolement de cellules stromales.

ontenu "> Le protocole de digestion doit maintenir l'expression à la surface de la quasi-totalité des molécules,. seulement de cette façon la coloration simultanée de plusieurs marqueurs peut révéler si une population homogène ou hétérogène, par exemple, l'utilisation de BP-3 et CD35 dans l' TRC gp38 + CD31 -. permet la visualisation et l'isolement des médullaire TRC (Sanjiv Luther, communication personnelle) En outre, la fraction mal caractérisé DN a été caractérisé comme contenant Aire + cellules et pericyte comme les cellules positives pour l'intégrine α7 (examinées en 7, 13). conséquent, la présente protocole a été comparée à celles publiées. Comme le montrent les résultats, la fréquence et le nombre de cellules stromales de ganglions lymphatiques similaires ont été obtenus avec le protocole en cours par rapport à ceux publiés. intéressant de noter que la fréquence et le nombre de isolé TRC ont été le plus élevé en utilisant le protocole Fletcher suggérant une meilleure dissociation des structures de TRC dans le protocole actuel etLien protocole. En outre, l'expression de diverses molécules de surface a été renforcée avec le protocole actuel par rapport à protocole Fletcher. Ces différences dans le procédé de digestion peut être la raison pour légèrement différents profils d'expression dans les études de cellules stromales de ganglions lymphatiques 6,19,21. Il pourrait être utile de tester différents protocoles de digestion en raison des avantages de chaque protocole. Le protocole actuel est peut-être mieux pour l'analyse de l'expression de surface, alors que le protocole Fletcher pourrait être utile pour l'isolement de nombre élevé de cellules viables pour l'analyse de la transcription (telle que publiée dans Malhotra et al. 7). Par conséquent comparant les trois protocoles de digestion peut être important pour obtenir des résultats optimaux après isolement des cellules stromales de ganglions lymphatiques et doit être considérée comme complémentaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

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References

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Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

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