Summary

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Abstract

Defecte DNA herstel leidt tot genomische instabiliteit, wat de oorzaak van mutaties die leiden tot tumorvorming toegenomen. Analyse van de frequentie en de aard van de chromosoomafwijkingen in verschillende celtypes laat defecten in DNA-herstel trajecten worden opgehelderd. Inzicht zoogdieren DNA-reparatie biologie is enorm geholpen door de productie van muizen met uitstoters in specifieke genen. Het doel van dit protocol is om genomische instabiliteit in de muis B-lymfocyten te kwantificeren. Etikettering van de telomeren met PNA-FISH probes (peptide nucleïnezuur – fluorescerende in situ hybridisatie) vergemakkelijkt de snelle analyse van genomische instabiliteit in metafase chromosoom spreads. B-cellen hebben specifieke voordelen ten opzichte van fibroblasten, omdat ze normaal ploïdie en een hogere mitotische index. Korte termijn kweek van B-cellen kunnen dus nauwkeurige meting van genomische instabiliteit in een primaire celpopulatie die waarschijnlijk minder secundaire genetische mutaties dan is typisch in getransformeerde fibroblasten of patiënt cellijnen.

Introduction

Kanker wordt veroorzaakt door de accumulatie van mutaties die genen die normale celgroei reguleren. Mutatie is een gevolg van veranderingen in de structuur en sequentie van het genoom veroorzaakt door beschadiging van DNA. DNA schade kan ontstaan ​​door een verscheidenheid van proces, waaronder exogene middelen zoals ioniserende straling, en als een bijproduct van normale cellulaire metabolisme zoals spontane deaminatie van nucleotide basen of schade ontstaat contact met reactieve zuurstof species 1.

Hoewel zoogdiercellen een scala aan reparatie activiteiten die DNA-schade kan terugdraaien of herstellen van de volgorde bij breuk locaties bezitten, mutaties toch verzamelen gedurende de levensduur van een cel. DNA schade kan bovendien bijdragen tot senescentie en verlies van vermogen van stamcellen, twee processen die zijn geassocieerd met veroudering geassocieerde ziekte 2. Inzicht in de reparatie van DNA-schade is daarom van vitaal belang voor het aanpakken van twee tekenificant vraagstukken in volksgezondheid. Meer gegevens suggereren dat zoogdier-DNA herstelmechanismen kan bijdragen aan de evolutie van de kankercel genoom 3,4, waardoor het nog noodzakelijk om de bij het ​​onderdrukken mutatie op moleculair niveau processen te begrijpen.

Directe visualisatie van chromosoomafwijkingen is een krachtige en kwantitatieve wijze bepalen van de mate van genomische instabiliteit in een bepaald celtype. Gecondenseerde chromosomen uit cellen in metafase kan worden geïsoleerd en geïnspecteerd door licht of fluorescentiemicroscopie. Dergelijke cytogenetische benaderingen in de praktijk al tientallen jaren en kan worden gebruikt om het uiterlijk van translocaties of specifieke types chromosoomafwijkingen aan een verminderde DNA reparatiewerkzaamheden tonen. Het protocol leent zich voor verschillende potentiële extensies: chromosomen kunnen met probes voor spectrale karyotypering (SKY) of meerkleurige fluorescerende in situ hybridisatie worden geëtiketteerd(MFISH) om translocaties 5,6 identificeren. Deze technieken de frequentie van chromosoom translocaties en de structuur van complexe chromosoom translocaties te bepalen, die aanvullende informatie biedt dan wat er mogelijk is met dit protocol in te schakelen ook. Alternatief kunnen sequentie-specifieke probes gegenereerd en gebruikt om de frequentie van DNA breuken testen geselecteerde genome locaties 7.

In dit protocol beschrijven we bereiding van metafase chromosoom spreads van B lymfocyten. Een fluorescentie-gemerkt peptide nucleïnezuur (PNA) probe voor telomeer herhalingen gebruikt, die efficiënt merken telomeren in metafase chromosoom spreads Dit protocol heeft verschillende voordelen. B-cellen kunnen worden geïnduceerd te groeien bij hoge mitotische index zodat hoogwaardige spreads logischerwijze kan worden geproduceerd. B-cellen van genetisch gemodificeerde muizen zijn ook veel minder waarschijnlijk secundaire genetische mutaties die de analyse van de bijdrage kan verwarren bevattenspecifieke genen genomische integriteit. De PNA-FISH aanpak kan in een dag worden afgerond, en maakt het mogelijk nauwkeuriger scoring van chromosoom breekt. Door deze benadering, met name in combinatie met specifieke apparatuur beschreven in dit protocol is het mogelijk om zeer consistent hoge kwaliteit spreads produceren en snel analyseren de snelheid en aard van genomische instabiliteit.

Protocol

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan Rutgers, de State University van New Jersey. Muizen werden behandeld in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Wetenschappers moeten hun nationale en institutionele dierlijke organisaties raadplegen voor gevestigde en erkende richtlijnen. Voordat u begint, voor te bereiden van de in tabel 1 vermelde oplossingen. 1 B Cell Iso…

Representative Results

Metafase chromosomen afkomstig ve cel moet een discrete cluster met 40 chromosomen (bij gebruik muizencellen) (Figuur 1A) vormen. Elk chromosoom een ​​centromeer aan een einde, die zichtbaar als een lichtblauwe bol. In normale chromosomen, zijn twee telomeer signalen van eind van de chromatiden en twee signalen door elke centromeer. Interfase kernen zal aanwezig zijn op de foto ook. Deze zijn zichtbaar als blauwe bollen, rode telomere signalen, maar geen gecondenseerde chromosomen (zie bijvoorbeeld …

Discussion

Dat geactiveerde B-lymfocyten zijn bijzonder geschikt voor bereiding van mitotische chromosomen smeersels kunnen andere celtypes worden gebruikt. T lymfocyten hebben veel van de voordelen van B-cellen, zoals ze kunnen worden gezuiverd uit de milt of lymfeknopen, en hebben een hoge mitotische index wanneer gestimuleerd door groei in medium dat adequate mitogenen 8. Embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn ook geschikt voor metafase chromosoom analyse 9. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan fibroblas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​R00 CA160574 (SFB) en door een gemeenschap van de Rutgers Biotechnologie Training Program (naar SMM).

Materials

Name Company  Catalog Number  Comments
50% Dextran sulfate Intergen S4030
Deionized formamide  Ambion 9342
Pepsin (5g) Sigma P 6887 
FCS Gemini 100-106
LPS (100mg) Sigma L2630
IL-4 (5μg) Sigma I1020
PNA Telomere Probe PNA Bio Inc F1002 (CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid Roche 295892
Mowiol 4-88 Sigma 81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads Miltenyl Biotec.  130-049-801
DAPI Sigma 32670-5MG
Eclipse E800 Nikon
AxioImager.Z2 Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber Thermotron

References

  1. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
  2. Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
  3. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  4. Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
  5. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
  6. Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
  8. Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  9. Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
  11. Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
  12. Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
  13. Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
  14. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
  15. Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
  16. Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).

Play Video

Cite This Article
Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. J. Vis. Exp. (90), e51806, doi:10.3791/51806 (2014).

View Video