Summary

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.

Abstract

Riparazione del DNA difettoso porta ad una maggiore instabilità genomica, che è la causa principale delle mutazioni che portano alla tumorigenesi. Analisi della frequenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche in diversi tipi cellulari permette difetti nei percorsi di riparazione del DNA da chiarire. Comprensione mammiferi riparazione del DNA biologia è stato molto aiutato dalla produzione di topi con ko in geni specifici. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B del mouse. Etichettatura dei telomeri con sonde PNA-FISH (peptide di acido nucleico – ibridazione fluorescente in situ) facilita l'analisi rapida di instabilità genomica degli spread metafase cromosomiche. Cellule B hanno vantaggi specifici relativi ai fibroblasti, perché hanno ploidia normale e un indice mitotico superiore. Cultura a breve termine di cellule B consente quindi la misurazione precisa di instabilità genomica in una popolazione di cellule primarie, che rischia di avere mutazione genetica secondaria menos di quello che è tipicamente presenti nei fibroblasti trasformati o linee cellulari di pazienti.

Introduction

Il cancro è causato da un accumulo di mutazioni che interessano i geni che regolano la crescita delle cellule normali. La mutazione è una conseguenza di modifiche alla struttura e la sequenza del genoma causato da danni al DNA. Danno al DNA può avvenire attraverso una varietà di processi, compresi gli agenti esogeni come radiazioni ionizzanti, e come un sottoprodotto del normale metabolismo cellulare, come deaminazione spontanea di basi nucleotidiche o danni che si verificano per contatto con le specie reattive dell'ossigeno 1.

Anche se le cellule di mammifero in possesso di una serie di attività di riparazione che può invertire il danno del DNA o ripristinare la sequenza in siti rottura, le mutazioni si accumulano comunque per tutta la durata di una cella. Danno al DNA può contribuire inoltre alla senescenza e la perdita di efficacia delle cellule staminali, due processi che sono associati con la malattia associata all'invecchiamento 2. Comprendere la riparazione dei danni al DNA è quindi di fondamentale importanza per affrontare due segnoquestioni ificant nella salute pubblica. Una crescente evidenza suggerisce che mammiferi percorsi di riparazione del DNA possono contribuire all'evoluzione del genoma delle cellule di cancro 3,4, il che rende ancora più indispensabile per capire i processi coinvolti nella soppressione mutazione a livello molecolare.

Visualizzazione diretta di aberrazioni cromosomiche è un potente e quantitativi mezzi per determinare il grado di instabilità genomica in un particolare tipo di cellula. Cromosomi abbreviato da cellule in metafase possono essere isolate e ispezionati utilizzando la luce o la microscopia a fluorescenza. Tali approcci citogenetiche sono stati in pratica per diversi decenni e può essere utilizzato per dimostrare l'aspetto di traslocazioni o specifici tipi di aberrazioni cromosomiche associate alla perdita di attività di riparazione del DNA. Il protocollo si presta a diversi potenziali estensioni: i cromosomi possono essere etichettati con sonde per cariotipo spettrale (SKY) o multicolor fluorescente in situ ibridazione(MFISH) per identificare traslocazioni 5,6. Queste tecniche permettono anche la frequenza di traslocazioni cromosomiche e la struttura di traslocazioni cromosomiche complesse da determinare, che fornisce informazioni aggiuntive di là di quanto è possibile con questo protocollo. In alternativa, sonde sequenza-specifiche possono essere generati e utilizzati per testare la frequenza di rottura del DNA in siti genomici selezionati 7.

In questo protocollo, si descrive la preparazione del cromosoma metafase diffonde da linfociti B. Un peptide acido nucleico (PNA) sonda fluorescenza marcata per le ripetizioni telomeriche viene utilizzato, che segna in modo efficiente telomeri in metafase cromosoma si diffonde Questo protocollo ha diversi vantaggi. Cellule B possono essere indotte a crescere ad alto indice mitotico in modo che gli spread di alta qualità possono essere prodotti in modo coerente. Cellule B da topi geneticamente modificati sono anche molto meno probabile che contengono mutazioni genetiche secondarie che possono confondere l'analisi del contributodi geni specifici per l'integrità genomica. L'approccio PNA-FISH può essere completato in un giorno, e permette il punteggio più accurata delle rotture cromosomiche. Usando questo approccio, in particolare in combinazione con attrezzature specifiche descritte in questo protocollo, è possibile produrre molto consistenti, spread alta qualità e analizzare rapidamente la velocità e il tipo di instabilità genomica.

Protocol

Questa procedura è stata approvata dal Comitato di cura e l'uso degli animali Istituzionale presso la Rutgers, l'Università statale del New Jersey. I topi sono stati trattati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli scienziati dovrebbero consultare i loro organizzazioni nazionali ed istituzionali animali per linee guida stabilite e approvate. Prima di iniziare, preparare le soluzioni elencate nella tabella 1. <p cla…

Representative Results

Cromosomi in metafase derivati ​​da una cella dovrebbe formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi (se si utilizza cellule di topo) (Figura 1A). Ogni cromosoma ha un centromero ad una estremità, che è visibile come una sfera azzurro. In cromosomi normali, due segnali telomeri sono visti alla fine dei cromatidi e due segnali di ciascun centromero. Nuclei in interfase saranno presenti sul vetrino pure. Questi saranno visibili come sfere blu, con segnali telomeri rosse, ma non cromosomi conde…

Discussion

Considerando che i linfociti B attivati ​​sono particolarmente adatti alla preparazione degli spread cromosomi mitotici, possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule. Linfociti T condividere molti dei vantaggi delle cellule B, in quanto possono essere purificati dai nodi milza o linfonodi, e hanno un elevato indice mitotico, quando stimolato dalla crescita in terreno contenente mitogeni appropriate 8. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono adatti anche per l'analisi della metafase …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto da NIH concedere R00 CA160574 (SFB) e da una borsa di studio del programma di formazione Biotecnologie Rutgers (a SMM).

Materials

Name Company  Catalog Number  Comments
50% Dextran sulfate Intergen S4030
Deionized formamide  Ambion 9342
Pepsin (5g) Sigma P 6887 
FCS Gemini 100-106
LPS (100mg) Sigma L2630
IL-4 (5μg) Sigma I1020
PNA Telomere Probe PNA Bio Inc F1002 (CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid Roche 295892
Mowiol 4-88 Sigma 81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads Miltenyl Biotec.  130-049-801
DAPI Sigma 32670-5MG
Eclipse E800 Nikon
AxioImager.Z2 Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber Thermotron

References

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Cite This Article
Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. J. Vis. Exp. (90), e51806, doi:10.3791/51806 (2014).

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