Summary
Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.
Abstract
Reparo do DNA defeituoso leva ao aumento da instabilidade genômica, que é a causa de mutações que levam à tumorigênese. A análise da frequência e tipo de aberrações cromossômicas em diferentes tipos de células permite defeitos nas vias de reparo de DNA a ser elucidado. Biologia de reparo do DNA em mamíferos Entendimento foi muito ajudado pela produção de camundongos com nocautes em genes específicos. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de ratinho. Rotulagem dos telômeros, utilizando sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridização in situ fluorescente) facilita a análise rápida de instabilidade genômica dos spreads metáfase de cromossomos. As células B têm vantagens específicas em relação a fibroblastos, porque eles têm ploidia normal e um índice mitótico elevado. Cultura de curto prazo das células B, portanto, permite a medição precisa da instabilidade genômica em uma população celular primária que é susceptível de ter menos mutação genética secundários do que o que é normalmente encontrado em fibroblastos transformados ou linhas celulares de doentes.
Introduction
O cancro é causado pela acumulação de mutações que afectam os genes que regulam o crescimento de células normais. A mutação é uma conseqüência de alterações na estrutura e seqüência do genoma causada por danos ao DNA. Danos do ADN pode ocorrer através de uma variedade de processos, incluindo agentes exógenos, tais como radiação ionizante e, como um subproduto do metabolismo celular normal, tal como a desaminação espontânea de bases de nucleótidos que ocorram danos ou por contacto com espécies de oxigénio reactivas 1.
Embora as células de mamíferos possuem uma gama de actividades de reparação, que pode reverter danos ao DNA ou restaurar a seqüência em locais de quebra, no entanto, mutações se acumulam ao longo do tempo de vida de uma célula. Danos de DNA pode, além disso, contribuir para a senescência e a perda de potência de células-tronco, dois processos que estão associados com a doença associada ao envelhecimento 2. Compreender a reparação de danos ao DNA é, portanto, de importância central na abordagem de dois sinalquestões ificant em saúde pública. Uma evidência crescente sugere que as vias de reparação do ADN de mamíferos pode contribuir para a evolução do genoma de células de cancro de 3,4, o que torna ainda mais fundamental para compreender os processos envolvidos na supressão da mutação a nível molecular.
A visualização direta de aberrações cromossômicas é um meio poderoso e quantitativos de determinar a extensão da instabilidade genômica em um tipo particular de célula. Cromossomos condensados de células em metáfase pode ser isolado e inspecionados utilizando luz ou microscopia fluorescente. Tais abordagens citogenéticas têm sido, na prática há várias décadas e pode ser utilizado para demonstrar a aparência de translocação ou de determinados tipos de aberrações cromossómicas relacionadas com a perda de actividade de reparação de ADN. O protocolo presta-se a várias extensões possíveis: os cromossomas podem ser marcadas com sondas para cariotipagem espectral (CÉU) ou multicolor hibridização in situ fluorescente(MFISH) para identificar translocações 5,6. Essas técnicas também permitem a frequência de translocações cromossômicas ea estrutura de translocações cromossômicas complexas para ser determinada, que fornece informações adicionais para além do que é possível com este protocolo. Alternativamente, as sondas específicas para a sequência pode ser gerada e utilizada para testar a frequência de quebra de ADN em locais genómicos seleccionados 7.
Neste protocolo, descrevemos a preparação do cromossomo metaphase espalha a partir de linfócitos B. Um ácido nucleico (PNA) péptido sonda fluorescente marcada por repetições teloméricas é utilizado, de forma eficiente, que marca telómeros em cromossomas da metafase espalha Este protocolo tem várias vantagens. As células B podem ser induzidas a crescer em alto índice mitótico de modo que os diferenciais de alta qualidade pode ser produzido de forma consistente. Células B de camundongos geneticamente modificados também são muito menos propensos a conter mutações genéticas secundárias que podem confundir a análise da contribuiçãode genes específicos para a integridade genómica. A abordagem PNA-FISH pode ser concluído em um dia, e permite marcar mais precisa de quebras cromossômicas. Usando essa abordagem, particularmente em combinação com equipamento específico descrito no presente protocolo, é possível produzir muito consistentes, spreads de alta qualidade e analisar rapidamente a taxa eo tipo de instabilidade genômica.
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Protocol
Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Universidade Rutgers, a Universidade Estadual de Nova Jersey. Ratos foram tratados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cientistas devem consultar as suas organizações nacionais de animais, e institucionais para as diretrizes estabelecidas e aprovadas.
Antes de começar, preparar as soluções listadas na Tabela 1.
1. B Isolamento e Ativação Celular
Eutanásia um rato usando CO 2, seguida por deslocação cervical. Posicione o mouse para o lado esquerdo do corpo é para cima e pulverizar o mouse com etanol a 70% até a pele está úmida. Dissecar o baço e coloque em um 35 milímetros de cultura de tecidos prato com tampão de lavagem 2 ml. Em uma câmara de fluxo laminar, quebrar-se suavemente o baço em placas de cultura de tecidos utilizando a extremidade plana de uma seringa de 5 ml.
- Insira uma malha de nylon 70 um em um 50tubo ml e transferir a amostra de baço em 2 ml de tampão de lavagem para a malha de nylon. Suavemente perturbar o baço na malha usando a extremidade plana da seringa.
- Lavar a parte de trás da seringa e a placa 35 mm, com 8 ml de tampão de lavagem e filtrar através de malha de nylon de 70 ^ m. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise ACK. Pipeta-se para baixo e para interromper momentaneamente aglomerados e incubar durante 5 min. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet tocando no fundo do tubo, em seguida por pipetagem em 1 ml de tampão de lavagem. Adicionar 50 ul de microesferas anti-CD43 MACS e incubar em gelo durante 30 min. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem, agitar suavemente, e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem, agitar suavemente, e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Configurar umaColuna Mini-MACS, colocando uma coluna sobre o ímã MACS. Posicionar um tubo de 15 ml rotulados cónica inferior da coluna. Adicionar 1 ml de tampão de lavagem a coluna e permitir que a atravessam para o tubo de 15 ml.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem. Carregar a amostra na coluna depois de o tampão de lavagem foi executado por meio de.
- Depois a amostra foi executado através da coluna, adicionar 1 ml de tampão de lavagem para lavar a coluna. Adicionar 7 ml de tampão de lavagem diretamente para a amostra coletada no tubo de 15 ml.
- Contar as células usando um hemocitômetro. Transferir o volume necessário de células necessárias para a 5000000 células / cavidade em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. O suplemento de meio de células B com LPS a 1: 500 e IL4 1: 1000.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar o volume apropriado de meio de células B suplementado necessário para a concentração final de um milhão de células / ml.
- Células da placa em placas de 6 poços com 5 ml de células em um milhão de células / ml, e em lugar de um humidified cultura de células incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
2. B Fixação celular
- Adicionar 50 ul de colcemide a cavidade contendo 5 ml de células B (para uma concentração final de 100 ng / ml) e incubar 1 h a 37 ° C. Pré-aquecer uma solução de KCl 75 mM num banho de água a 37 ° C. Transferir as células B a um tubo de 15 ml marcado. Cobrir a etiqueta com fita e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo e ressuspender o sedimento por pipetagem. Adicionar 5 ml de KCl a queda pré-aquecido a gota ao bater ou pulsando em um vórtice.
- Adicionar 10 ml de KCl e misture invertendo. Incubar em C do banho de água 37 ° C durante 15 min. Adicione 5 gotas de fixador fresco e misture invertendo. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo e ressuspender pellet pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar 5 ml de fixador fresco gota a gota, ao bater ou pulsando em um vortex. Adicionar mais 10 ml de fixador e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml em tubos e ressuspender por pipetagem. Adicionar 14 ml de fixador fresco e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Repita o passo 2.7 mais duas vezes.
- Adicionar 14 ml de fixador fresco. Selar as tampas com Parafilm e armazenar durante a noite a -20 ° C.
3 Preparação de Metaphase Spreads cromossômicas
- Definir uma câmara ambiental regulada a 22,9 ° C e 52% de umidade.
- Centrifugar a células B fixa a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar fixador deixando 70 mL no tubo e ressuspender por pipetagem.
- Colocar as lâminas marcadas na câmara de humidade a um ângulo de 35 °. Queda de 35 mL de células B em ressuspensão numa lâmina e soltar duas lâminas por amostra. Permitir que os slides para secar na câmara de umidade por 30 min, em seguida, armazenar os slidesem uma caixa de lâminas a 37 ° C.
4. Telomere PNA FISH
- Preparação de Sonda
- Formamida desionizada pré-aquecer a 37 ° C. Misturar 2 uL de sonda ANP telómero com 7 ul de formamida desionizada pré-aquecida e incubar a 37 ° C com agitação durante 1 hora.
- Pré-quente mistura principal FISH para 37 ° C. Adicionar 7 ul de pré-mistura principal aquecido FISH para a mistura a partir do passo 4.1.1 e incubar a 37 ° C durante 1-3 horas.
- Desnaturar a mistura de sonda de 8 min a 80 ° C. Pré-hibridar a sonda durante 1 hora a 37 ° C.
- Pré-tratamento de Slides cromossômicas
- Pré-aquecer um frasco de deslizamento de coloração de vidro contendo 50 ml de HCl 0,01 M a 37 ° C em um banho de água.
- Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração de deslizamento diferentes contendo 2 x SSC durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 2 mL de estoque pepsina ao vidro pré-aquecido slide-coloração frasco e misturar invertendo. Transferir as lâminas para esta sl vidrojar ide-coloração e incubar 90 segundos a 37 ° C.
- Lavam-se as lâminas 2x em um frasco de vidro deslizante coloração diferente contendo 1x PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente, sob agitação. Em seguida, lave as lâminas por 5 min em 1x PBS / MgCl2 à temperatura ambiente, agitando.
- Transferir as lâminas para um frasco de vidro para coloração deslizante contendo recém-preparado formaldeído a 1% / PBS 1x / MgCl2 durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas por 5 min em um frasco de vidro deslizante coloração diferente contendo 1x PBS à temperatura ambiente, agitando.
- Prepara-se uma série de etanol, tendo a desidratação de vidro separada frascos corrediça de coloração que contêm 70%, 90%, e 100% de etanol.
- Transferir as lâminas para cada frasco durante 3 min, começando com 70% de etanol, em seguida etanol a 90%, e em seguida de etanol a 100%. Coloque frascos de etanol a -20 ° C quando terminar.
- Permitir que as lâminas para o ar seco tocando excesso de etanol em uma toalha de papel e apoiando os slides em um ângulo de 35 °. Depois de seco, mark uma área de 18 x 18 mm para a hibridação na parte de trás das lâminas através de uma caneta de diamante.
- A desnaturação de Slides para FISH
- Aplicar formamida 120 mL de 70% deionizada / 2X SSC para uma lamela de 24 x 60 mm. Toque no slide para a lamela. Desnaturar o slide a 80 ° C sobre uma placa quente durante 90 segundos.
- De forma rápida e cuidadosamente deslizar para fora da lamela e colocar a corrediça em gelo frio de etanol a 70% durante 3 min, seguido de etanol a 90%, e 100% de etanol durante 3 minutos cada. Permitir que as lâminas para o ar seco.
- Prepare uma câmara úmida, alinhando uma caixa de plástico com tampa e papel de seda molhado. O papel deve ser úmido, mas não saturado com água.
- Numa câmara húmida, aplicam-se a mistura de sonda de pré-recozido do passo 4.1.3 para a área marcada sobre a lâmina, coberta com uma tampa 18 x 18 mm de deslizamento e incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Lavagens de pós-incubação
- Pré-aquecer a 50% de formamida / 2x SSC, 1x SSC, e 4x SSC / 0,1% de Tween-20 a 45 ° em; C num banho de água.
- Retire cuidadosamente as lamelas e lavar as lâminas em pré-aquecido a 50% formamida / 2x SSC 3xfor 5 min cada, no escuro e tremendo. Lavar as lâminas em pré-aquecido 1x SSC 3xfor 5 min cada, tremendo. Finalmente, lava as lâminas em pré-aquecido 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min cada.
- Coloração das lâminas por 3 min em DAPI em uma luz protegida vidro slide-coloração jar.
- Lavar as lâminas por 5 min em 2x SSC, tremendo. Aplicar 35 l de Mowiol meio de montagem, cubra com 24 x 60 mm lamelas e armazenar os slides a 4 ° C.
5 Análise microscópica dos cromossomas
- Analisar os slides metafase utilizando um microscópio de epi-fluorescência padrão. Use uma plataforma de imagem com uma fase automatizada, como a plataforma MetaSystems Metafer para obter melhores resultados. Para cada metafase, recolher uma imagem de fluorescência para visualizar DAPI cromossomas, e uma imagem com o sinal fluorescente do telómero probe. (Por exemplo, outros Cy3- Fluors estão disponíveis e funcionam igualmente bem.)
- Sobreponha as imagens com um programa de análise de imagem e analisar.
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Representative Results
Cromossomos metafásicos derivadas de uma célula devem formar um conjunto discreto contendo 40 cromossomos (se estiver usando células de camundongo) (Figura 1A). Cada cromossoma tem um centrómero em uma extremidade, que é visível como uma esfera de luz azul. Em cromossomos normais, dois sinais dos telômeros são vistos no fim das cromátides e dois sinais de cada centrômero. Os núcleos interfásicos vai estar presente na lâmina bem. Estes serão visíveis como esferas azuis, com os sinais dos telômeros vermelho, mas não cromossomos condensados (ver por exemplo Figura 1B). Os núcleos interfásicos podem ser ignorados para fins de quantificação instabilidade genômica.
Um número de diferentes tipos de aberrações cromossómicas pode ser observada. Quebras de cromátides são pausas em uma das duas cromátides irmãs que compõem cada cromossomo metáfase. Eles podem ser marcados, se o investigador considerar uma descontinuidade numa cromatídeos, ou perda de um único sinal de telómeros de uma extremidade ofa cromossomo (ver exemplos na Figura 1B). Quebra de cromossomas são identificados pela procura de sinais de perda de telómeros de uma extremidade de um cromossoma (exemplo na Figura 1C). Em alguns casos, a extremidade quebrada do cromossoma pode ser observada como um fragmento com sinais telómeros no mesmo metafase (como é o caso na Figura 1C). Em outros casos, o final cromossoma pode não estar presente.
Vários tipos de rearranjos cromossômicos podem ser observadas. Cromossomos Radial tomar uma série de formas, caracterizada por rearranjos complexos envolvendo dois cromossomos (três exemplos são mostrados com setas vermelhas na Figura 1D). Cromossomos radiais também incluem rearranjos mais complexos, envolvendo três ou mais cromossomos. Cromossomos também pode tornar-se unidos para formar cromossomos dicêntricos, que aparecem como uma fusão end-to-end de cromossomos com centrômeros em ambas as extremidades (mostrado com uma seta branca na Figura 1D </ Strong>). Translocações Robertsonianas são um tipo de translocação entre os centrômeros de dois cromossomos, que aparecem como quatro braços de cromatídeos irmãos ligados a um único centrômero (visto na Figura 1E).
Figura 1F mostra uma metáfase que não tem sinais de telômero presente. Ausência de sinais dos telômeros pode ocorrer a partir de erros na preparação da sonda ou bolhas de ar no lamela durante a hibridação.
Figura 1 aberrações cromossômicas em células de camundongo B como visualizado por PNA FISH do telômero. A) A estrutura dos cromossomas de uma célula B de rato normal em metafase. 40 cromossomos são visíveis, com dois sinais dos telômeros em cada extremidade. B) exibindo um celular duas quebras de cromátides (setas verdes). C) D) A célula exibindo três cromossomos radiais (setas vermelhas) e um cromossomo dicêntrico (seta branca) E) A propagação. metaphase com um cromossomo com uma translocação Robertsoniana (seta amarela ). F) Um exemplo de uma hibridização falhou, mostrando cromossomos sem sinais dos telômeros. A barra de escala representa 10 m em cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Considerando que os linfócitos B activados são particularmente adequados para a preparação de barrar cromossómicas mitóticas, outros tipos de células podem também ser utilizados. Linfócitos T partilhar muitas das vantagens de células B, uma vez que podem ser purificadas a partir dos gânglios linfáticos ou do baço, e têm um elevado índice mitótico, quando estimulada por crescimento em meio contendo mitogénios adequadas 8. As células-tronco embrionárias (células ES) também são adequados para a análise de cromossomos metafásicos 9. Se estes não estiverem disponíveis, células de fibroblastos pode ser utilizado, embora um tratamento mais prolongado com colcemida (por exemplo, 16 horas, com colcemide a uma concentração final de 10 ng / ml) é recomendado para interceptar mais células em metafase antes da fixação.
Nós achamos que a consistência da preparação de metáfase os spreads é muito facilitada pela queda dos cromossomos fixados em uma câmara de umidade controlada, tal como o CDS-5 Thermotron Citogenética A câmara de secagem, mas é possível obter bons resultados while trabalhar em um banco, dependendo da umidade e temperatura do ambiente de laboratório. Para obter resultados confiáveis, é aconselhável marcar aberrações cromossômicas de pelo menos 100 metáfases por amostra. Como o processo de imagiologia manualmente cada metáfase em cada canal pode ser trabalhoso, adquirimos metáfases usando um sistema de microscopia automatizada Metasystems Metafer4, que pode rapidamente encontrar e analisar um grande número de cromossomos metafásicos com precisão.
Análise de cromossomos metafásicos marcadas com sondas dos telômeros é ideal para medir cromossomos e cromátides breaks, e os sinais dos telômeros também auxiliam a identificação de rearranjos cromossômicos complexos, tais como fusões e estruturas radiais. Coloração de cromossomos metafásicos fixas com solução de Giemsa também é adequado para a quantificação de aberrações cromossômicas, e oferece a vantagem de não necessitar de microscopia fluorescente 10. Rotular telômeros com uma sonda PNA pantelomeric estende o range de aberrações cromossômicas que podem ser quantificados, permitindo a identificação de fusões dos telômeros, que surgem, por exemplo, em células de camundongos knockout DNAPKcs-11. PNA-FISH também pode ser usado para medir as freqüências de anormalidades dos telômeros, incluindo duplicações dos telômeros de cromossomos e cromátides perda de telômeros 12,13. A perda de um sinal telómero pode ser causada por encurtamento dos telómeros, bem como pelo cromossoma ruptura. PNA-FISH pode ser usado para medir o comprimento dos telômeros sensibilidade usando Q-FISH (FISH quantitativa) 14.
Células sem diferentes atividades de reparo de DNA tendem a acumular diferentes tipos de aberrações cromossômicas. Por exemplo, a deficiência no fator 53BP1 resposta danos no DNA, leva ao acúmulo de cromossomo quebra 15. Por contraste, uma proporção elevada de estruturas cromossómicas radial complexos são observados em células sem BRCA1 4. Estes rearranjos cromossômicos são variados em sua estrutura exata,mas sempre envolve a fusão de material a partir de dois ou mais cromossomas. Quando as células possuem níveis muito elevados de instabilidade do genoma, como, por exemplo, ocorre após o tratamento com doses elevadas de agentes que provocam quebras no ADN, ele torna-se cada vez mais difícil de marcar aberrações cromossómicas individuais, o que coloca um limite para a gama dinâmica do ensaio.
A quantificação de quebras cromossômicas e rearranjos em metáfase é útil para testar se os genes específicos têm um papel no reparo do DNA. Um problema potencial no uso de análise cromossomos metafásicos para este fim é que as células que não possuem atividades de reparo de DNA pode não crescer normalmente. Se as células deficientes em reparação não atingem metafase, a importância de um gene para mediar a reparação de ADN pode ser subestimada. Por exemplo, RNF8 - / - células, que estão sujeitos à senescência dependente de p53, apresentam um nível modesto de instabilidade cromossômica, enquanto RNF8 - / - p53 - / - células duplo knockout mostram many aberrações cromossômicas mais, porque a supressão de p53 permite um melhor crescimento de células 16. É, portanto, importante para emparelhar as medições da instabilidade cromossómica com um ensaio do ciclo celular, para mostrar que as populações de células knockout podem crescer normalmente e contêm uma proporção significativa das células mitóticas.
A observação de instabilidade genômica por si só não dar dicas sobre a função exata de uma atividade de reparo fornecido por um gene específico, mas simplesmente age como um ponto de partida para estudos mais mecanicistas. Por fim, embora esta abordagem é útil para medir quebras cromossômicas e rearranjos complexos, é recomendado o uso de mFISH ou SKY para quantificar translocações cromossômicas. Essas técnicas também começam com spreads metáfase de cromossomos, mas usar um coquetel de sondas que 'pintura' cada cromossomo com uma combinação específica de fluoróforos. Qualquer destas técnicas é recomendado para medir o espectro completo do cromossoma instability em reparar as células deficientes.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder R00 CA160574 (SFB) e por uma bolsa do Programa de Formação Biotecnologia Rutgers (a SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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