시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

Summary

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Abstract

방법의 넓은 범위는 현재 단백질 사이의 해리 상수를 결정하고 작은 분자 상호 작용에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이들의 대부분은 전문 장비에 대한 액세스를 필요로하며, 종종 효과적으로 신뢰성 실험을 구축하고 데이터를 분석하는 지식의 정도를 필요로한다. 시차 주사 fluorimetry은 (DSF) 증가, 중 생리 파트너를 식별하기위한 또는 히트 검색에 작은 분자를 상호 작용하는 단백질의 초기 검사에 대한 강력한 방법으로 사용되고있다. 이 기술은 정량적 PCR에 적합하고, 대부분의 기관 계측 가능하므로 적합한 만 PCR 기계를 필요로하는 이점이있다; 프로토콜의 훌륭한 범위는 이미 사용할 수 있습니다; 상기 방법의 여러 용도에 대한 문헌에서 강한 전례가있다. 과거 작업 DSF 데이터로부터 해리 상수를 산출 여러 수단을 제안하고 있지만, 이러한 수학적 요구하고있다. 여기서 우리는 민주onstrate DSF 실험 데이터로부터 적당한 양의 해리 상수를 추정하기위한 방법. 이러한 데이터는 통상적으로 수거하고, 하루 내에서 분석 될 수있다. 우리는 단순한 결합 이벤트에서 수집 된 데이터에 맞추기 위해 사용될 수있는 방법을 보여 다른 모델과 협력 결합 또는 바인딩 사이트는 독립적 본 곳이다. 마지막으로, 우리는 표준 모델이 적용되지 않는 경우 데이터 분석의 예를 제시한다. 이러한 방법은 상업적으로 이용 가능한 제어 단백질에 수집 된 데이터, 그리고 우리의 연구 프로그램에서이 단백질과 도시되어있다. 전반적으로, 우리의 방법은 연구자가 빠르게 DSF를 사용하여 단백질 – 리간드 상호 작용에 더 통찰력을 확보 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다.

Introduction

모든 단백질은 다른 큰 거대 분자에 대한 간단한 이온에서 다른 분자의 다양한 범위로, 다양한 친화력으로 결합됩니다. 많은 경우에, 단백질 (예를 들면, 키나아제 ATP에 대한 결합) 정상 기능의 일부로서 작은 분자에 결합 파트너. 다른 상호 작용에 관련되지 않은 기능 일 수 있지만, 공구 (결정화 성공을 개선, 또는 용액 중의 단백질을 유지하는데 도움이 단백질을 안정화 예, 소분자)로서 실험적으로 유용있다; 억제제로서 작용 등의 효소 활성을 조절할 수있는 활성 부위 단백질의 알로 스테 릭 사이트에 결합하는 작은 분자 동안.

파트너 분자 단백질의 친화도를 결정하는데 이용 될 수있는 기술의 다양한 종류가있다. 등온 적정 열량계 ^하나는 반응에 풍부한 정보를 제공 널리 라벨 무료이며, "금 표준"으로 간주하고, 기회를 제한했다실험 rtifacts. 그러나, 계측 및 실험 장치의 자동화 감도 최근의 개선에도 불구하고, 그것은 여전히​​ 단백질 요건의 관점에서 비교적 고가 기껏 중저 처리량을 갖고, 및 중등도의 상호 작용에 가장 적합 높은 친화도 (100 μM의 K _d를 10 nm의) ^2. 이러한 표면 플라즈몬 공명 또는 이중층 간섭계 ³ 제안 높은 처리량 및 감도를 얻을 수있는 등의 다른 라벨없는 방법 (100)의 낮은 다 작은 분자를 검출한다. 그러나, 이러한 방법에 대한 높은 처리량 악기가 비교적 비싸다, 관련 프로젝트의 연속적인 처리가있을 것입니다 경우에만 정당화하고, 많은 대학 실험실에 접근 할 수 없을 가능성이 있습니다.

시차 주사 fluorimetry (DSF 또는 thermofluor) 먼저 약물 발견을위한 방법으로 2001 ^4에서 설명되었다. 이 방식 운전 방식에서D는, 단백질은 형광 염료와 함께 배양된다 (초기 나프탈렌 술폰산 염료가 사용되었다), 단백질의 소수성 영역에 결합시 그 형광을 변경한다. 단백질 – 염료 샘플은 가열하고, 열 상승으로 형광 모니터링. 단백질의 전개 및 단백질의 소수성 부분의 노출은, 온도 (도 1a)의 함수로서 형광 특성 패턴을 발생시킨다. 실험은 상업적 정량 PCR 장비에서 소량으로 수행 될 수 있고, 그래서 하나의 실험에서, 샘플의 다수의 동시 (인스트루먼트 모델에 따라 일반적으로 48, 96 또는 384 샘플) 시험 할 수있다. 실험은 일반적으로 시료 ^(5)의 높은 처리량 분석의 가능성을 제공하고, 시간의 주위에서 수행 될 수있다.

방법론에 대한 추가 개선은 더 나은 분광 특성 ^6,7와 염료의 채택을 보았다 </SUP>, 일반 데이터 분석 툴, 초기 스크리닝 ^8,9위한 프로토콜을 제안 하였다. 방법의 적용 범위는 제제 및 단백질 ^(10)의 저장을위한 최적의 조건을 설정하고 결정화에 ^11을 돕기 위해 잠재적 결합 파트너를 식별하는 특정의 중심으로 확장되었다. 이 방법의 상대적으로 높은 처리량, 단백질이 상대적으로 낮은 비용 (~ 2 반응 당 μg), 약한 결합 분자를 연구에 적용 특히 학문적 맥락 ^12-14에서 DSF에게 조각 기반 약물 설계를위한 유용한 도구를 만들었습니다.

단백질 – 리간드 상호 작용을 공부에 DSF의 넓은 응용 프로그램에도 불구하고, 몇몇 연구는 이러한 연구에서 해리 상수의 결정을 설명했다. 그러나 이러한 스파 스 데이터 또는 일부의 경우 전자에 장착해야 많은 매개 변수로, 단백질의 전개를 설명하는 자세한 방정식을 생산하는 경향이있다^7,15-17을 stimated. 이러한 방법은 특이한 전환을 표시 긴밀하게 결합 화합물 또는 단백질로, 도전적인 경우에 특히 관련이 있습니다. 그러나 많은 실험실에 대한 이러한 자세한 분석은 일상적인 사용하기에 너무 복잡하다. 그러므로 우리는 서로 다른 시나리오에 대해 대체 치료법을 제시하고, 이러한 서로 다른 단백질 – 리간드 상호 작용의 결과 데이터에 맞추기 위해 사용될 수있는 방법을 보여준다. 우리의 방법은 맞춤형 데이터 분석 소프트웨어를 사용할 수있는 StepOne qPCR의 악기를 사용; 이 데이터 분석을 가속화하는 동안, 다른 기기로부터의 결과는 이전에 발행 된 방법 ^9를 사용하여 처리 될 수 있고, 동일한 하류 분석이 수행 될 수있다.

Protocol

(한 자릿수 이내 즉,) 해리 상수에 대한 대략적인 값의 1 결정 표 1에 설명 된 혼합물을 준비합니다. 가장 높은 농도에서 관심있는 리간드의 주식을 준비하고,이 중 다음의 6 ~ 10 배 희석. 대략 K D의 데이터가 종래에 공지되는 경우, 적어도 두 개의 상기 농도와 K의 D 이하가 목표. 나누어지는 qPCR에 접시에 팔 우물에 혼합물의 18 μL. 첫째도에 용매의 2 μl를 추가합니다. 나머지 일곱 우물을 잘 한 각 리간드 희석 시리즈 (단계 1.2)의 각 구성원의 2 μl를 추가합니다. 접시 위에 qPCR에 실을 배치합니다. 플레이트의 좋은 밀봉을 달성하기 위해, 판의 중앙에 (특정 시약의 표를 참조) 핸드 어플리케이터를 배치했다. 한쪽으로 씰을 부드럽게 한 다음의 나머지 절반에 반복접시입니다. 공기 방울을 제거하기 위해 두 분 동안 500 XG에서 플레이트를 원심 분리기. StepOne qPCR의 상품에 접시를 놓습니다. (이 40 분에 걸쳐 99 ° C에 경사로 다음 25 ° C에서 2 분의 일시 정지, 다음 2 분의 일시 정지를 제공합니다) "용융 곡선"옵션, ROX 필터를 선택하고 빠른 램프 속도를 선택합니다. 열 변성을 실행합니다. 참고 : 실행을 수행하기위한 스크립트 파일은 HTTP에서 온라인으로 사용할 수 있습니다 // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. 악기 실행의 결론에서, 화면에 "분석"버튼을 클릭합니다. 결과 파일을 저장합니다. 단백질 열 시프트 소프트웨어를 엽니 다. 새로운 연구를 만들기; 속성 탭에서이 이름을 지정하고, 조건 탭에서, 세부 사항 리간드. 실험 파일 탭으로 이동하고, 저장된 결과 파일 (XXX.eds)를 가져, 각도 (템플릿 FIL의 내용을 설정ES)은 저자에서 사용할 수 있습니다. 분석 탭으로 이동하고 "분석"버튼을 누릅니다. 참고 :이 결과를 분석 할 것이다. 그것은 엑셀 내보내기 탭을 사용하여 함께 추가 조사에 대한 결과를 내보낼 수 있습니다. 결과는 탭 서술 형식으로 수출하고 있습니다. 그것은 Excel에서 내 보낸 파일을 열고 즉시 엑셀 형식으로 저장하는 것이 가장 좋습니다. 단독으로 용매의 존재 하에서 단백질이도 1a에 도시 된 것과 유사한 결과를 제공하는지 확인. 다음에, "복제"창에서 관찰 된 결과에 용융 온도를 조사한다. 이 증가 리간드 농도 용융 온도에서 명확한 증가가 표시되는지 확인합니다. 주 : 용융 온도가 리간드없이 단백질과의 중간 어디 이상적으로,이 (단백질이 완전히 리간드 바인딩되는 것으로 가정) 맑은 최대 용융 온도 및 대략 K d를 제공한다최대. 해리 상수 결정을위한 2 실험 장치 마스터 믹스로 표 2에 설명 된 혼합물을 준비합니다. 마지막 실험에서 열 배 희석 될 것이다 십오 서로 다른 농도에서 리간드의 주식을 준비합니다. 이상적으로, 농도보기 예상 K d를 상하 크기 중 적어도 두 개의 명령을 포함하고, 상기 추정 된 K D의 농도를 가운데. 이 양쪽에 또 다른 4 점, 추정 K (D)의 크기 순서 내에서 점의 칠에 초점; 선택의 여지가있는 경우, 포화 된 값에 더 많은 포인트를 포함한다. 주 : 필요한, ​​그것은 리간드 주식 리간드의 용해도가 제한되는 이중 실험 농도에 있는지 실험 조건은 변경하도록하면 가능하다. 마스터의 120 μl를 추가마스터 믹스의 편리한 분배를위한 저장소 역할을하도록, U 바닥 96 웰 플레이트에 웰 팔에 혼합한다. PCR 플레이트의 한 컬럼에 18 μl를 분배하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 접시에 6 × 8 패턴 48 가득 우물의 총을주고, 또 다른 다섯 열을 반복합니다. U-바닥 96 웰 플레이트에 우물을 분리, 20 리간드 주식 μL, 또는 용매를 추가합니다. 8 채널 피펫, 기음 8 개의 서로 다른 리간드 주식 (또는 용매)의 2 μl를 사용. 단계 2.3에서 마스터 믹스로 가득 차 있었다 PCR 플레이트의 한 컬럼이 추가. 이 더 컬럼에 대해 동일한 팔 리간드 / 용매 주식으로 반복합니다. 대기음이 나머지 8 리간드 또는 용매 주식 μL, 그리고 접시에 네 번째 열에 추가 할. 이 더 컬럼에 대해이 작업을 반복합니다. 이것은 모든 16 리간드 및 용매 샘플 세중의 샘플을 제공 할 것입니다. 접시 위에 qPCR에 실을 배치한다 (단계 1.4 참조). 500 XG에서 접시를 원심 분리기두 분. qPCR에 상품에 접시를 놓습니다. 단계 1.6에서 지정된 파라미터를 이용하여 열 변성을 실행. 악기 실행의 결론에서, 화면에 "분석"버튼을 클릭합니다. 결과 파일을 저장합니다. 단백질 열 시프트 소프트웨어를 엽니 다. 새로운 연구를 만들기; 속성 탭에서이 이름을 지정하고, 조건 탭에서, 세부 사항 리간드. 실험 파일 탭으로 이동하고, 저장된 결과 파일 (XXX.eds)를 가져, 잘 각각의 내용을 설정합니다. 참고 : 템플릿 파일은 HTTP에서 온라인으로 사용할 수 있습니다 // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. 분석 탭으로 이동하고 "분석"버튼을 누릅니다. 에서 삼중 같은 결과를 표시하는 화면의 좌측에 메뉴 "를 복제"탭을 선택한다. 에서 삼중 얼마나 타이트에 기초하여 데이터의 신뢰성을 평가한다. Shoul에서 삼중 가난한 재현성을 보여 D 밀접하게 원시 데이터를 검사합니다. 용융 온도를 평가하는 방법 볼츠만 파생물 또는 모두를 사용하여 데이터를 분석한다. "결과를 복제"탭을 선택하고 "로 플롯"을 전환, "결과 플롯을 복제"의 사이 버튼 "TM – 볼츠만"와 "TM – 파생 상품". 샘플에 대한 더 큰 재현성을 제공하는 방법을 선택합니다. 엑셀 내보내기 탭을 사용하여 함께 추가 조사에 대한 결과를 내 보냅니다. NOTE : 여러 전이를 보여주는 샘플의 경우, 다수의 모드에서 용융 파생물 방법을 사용하는 것이 거의 항상 최적이다. 결과는 탭 서술 형식으로 수출하고 있습니다. 그것은 Excel에서 내 보낸 파일을 열고 즉시 엑셀 형식으로 저장하는 것이 가장 좋습니다. 결과의 재현성을 보장하기 위해, 별도의 일 반복을 포함한 적어도 두 번 실험을 반복한다. 데이터 분석은 (아래 단계 3 참조)해야K (D)의 값이 원래의 추정치와 크게 차이가 있음을 나타내는, K D의 주위 값의 양호한 범위를 보장하기 위해 (단계 2.2 참조) 따라서 리간드 농도를 변경. 3 데이터 분석 열 변성에서 해리 상수를 확인하는 리간드 농도 Excel의 테이블 및 용융 온도를 만든다. 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 열고 XY 테이블을 만들 수 있습니다. 리간드 농도 및 온도 결과를 용융 Y 열의 X 컬럼을 사용하여, 데이터를 입력한다. 참고 : 나타내는 예는 그림 1B이다. 사전로드 된 수식 및 SPSS 통계 패키지를 사용하여 대체 지침 스크립트는 HTTP에서 온라인으로 사용할 수 있습니다 // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. 분석 탭에서 분석 매개 변수를 변경하는 옵션을 선택합니다의합니다 (Ctrl + T). 올바른 모델을 입력 "새"를 선택하고 "새 방정식을 만들기"를합니다. "단일 사이트 리간드가 결합"으로 표 3에 설명 된 방정식을 삽입합니다. 참고 :이 단계의 예는 그림 1C에 표시됩니다. 방정식 사전로드와 스크립트를 사용하는 경우, 관련 식은리스트보다는로부터 선택 지시를 입력 할 수있다. 이 방정식의 유도는 부록에 제공됩니다. 상자 "초기 값에 대한 규칙"을 선택하고 표 3에 설명 된대로 초기 값에 대한 규칙을 입력합니다. (리간​​드에 주어진 것과 동일한 단위) 및 단백질의 최종 농도를 입력 "을 같은 상수"로서, 파라미터 P 구속. 분석을 수행하기 위해 OK를 선택합니다. 참고 :이 단계의 예는 그림 1D에 표시됩니다. 그래프 소프트웨어는 데이터 모델에 대한 착용감을 나타내는 수치를 생성한다. t의 예HESE 분석은 대표 데이터에 표시됩니다. 협동 모델에 4 피팅 데이터 단순한 협력 모델 또는 두 개의 별도의 해리 상수가 정의 된 모델 중 하나를 선택할 협동 조합 모델에 데이터를 맞게합니다. 첫 번째 방법은 네거티브 협동성의 경우에 바람직한, 또는 초기 조사 등이다. 그러나 원칙적으로는 두 가지가 18 해리 상수 모델링 긍정적 협동성 가지 경우에 더 좋다. 이 경우, 모델링은 리간드의 순차적 결합 또는 리간드의 결합 독립적를 가정 진행할 수 있습니다. , "단순 협력 모델"로 나열 표 3 식 중 하나를 삽입 단계 3.3에서, 그러나 프로토콜 3과 "이 리간드의 연속 바인딩을"같은 초기 단계를 따르거나 18 "독립적 인 두 개의 리간드의 결합". 초기 값에 대한 적절한 규칙을 선택표 3에 이들 방정식의 각각과 연관된. 데이터 모델의 적합성을 검사합니다. 데이터가 제대로 맞는 경우, 다른 모델을 생각해 볼 수 있습니다. NOTE : 그것은 또한 신중 단백질 열 시프트 소프트웨어 (스텝 2.9)에 의해 데이터에 용융 온도의 피팅을 조사하는 것이 중요하다 : 때때로 최상의 결과를 얻을 수 있도록 위치 파라미터를 변경하는 것이 필요하다. K (D)의 양쪽에서 데이터의 한정된 세트 또는 (특히 높은 리간드 농도에서) 단일 변칙 점 역시 상당히 영향을 줄 수있다 : 또 다른 고려 사항은 데이터 포인트의 범위가 적합하고, 어떤 변칙적 포인트가 있는지 여부이다 결과. 재현성을 보장하기 위해 적어도 두 배 (단계 2.12 참조) 실험을 반복한다. 녹는 온도에서 이진 교대보기 곡선에 5 피팅 데이터 때때로, 오히려 리간드에 등급을 매긴 응답보다 단백질왔다바인딩 샘플을 명확하게 결합되지 않은 샘플로부터 분리되어있는 이진 응답을 채택 관찰했다. 예는 대표적인 결과 (그림 4)에서 제공됩니다. 이 경우, 용융 온도의 피팅 K D에 대해 좋은 착용감을 제공하지 않을 것이다. 단백질 열 시프트 소프트웨어의 원시 데이터 출력을 내 보냅니다. 각 포인트에 대한 온도, 리간드에 대한 제로 평균 형광 및 높은 리간드 농도를 계산한다. 이러한 옆 각 데이터 포인트로부터의 결과를 표로. NOTE : 여기서 작성된 에러가 장착 융점의 에러보다 작다. SPSS 통계 패키지를 엽니 다. SPSS에서 데이터 윈도우에 대한 각 실험 온도, 평균이 데이터 집합, 데이터를 복사한다. 변수 탭에서 "낮음"으로 더 리간드의 평균 데이터 집합, 그리고 "하이"로 가장 높은 리간드 농도에 대한 평균 데이터 집합을 설정합니다. 사용할 수있는 구문 파일을 다운로드온라인에서는 http : // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . "실행 → 실행을 모두"를 선택합니다. 관련 리간드 농도, 새 Excel 통합 문서에 비례에게 결합 된 결과를 복사합니다. 을 Graphpad 소프트웨어를 열고 XY 테이블을 만들 수 있습니다. 리간드 농도 및 온도 결과를 용융 Y 열의 X 컬럼을 사용하여, 데이터를 입력한다. 분석 탭에서 "변경 분석 매개 변수"를 선택합니다. 올바른 모델을 입력 "새"를 선택하고 "새 방정식을 만들기"를합니다. "용융 온도 이진 변화 분석"에 들어있는 표 3에 주어진 식을 입력합니다. "초기 값에 대한 규칙"상자를 선택하고 표 3에 설명 된 초기 값에 대한 규칙을 입력합니다. "에 같은 상수"로, 매개 변수 P를 구속하고, 리가와 같은 단위 (단백질의 최종 농도를 입력ND는)에서 제공됩니다. 주 : 제 3의 프로토콜이 상자를 완료의 예는 그림 1C, D로 표시됩니다. 좋은 착용감이 있다면, 결과가 무한 리간드 농도에서 예상되는 결과를 외삽함으로써 개선 될 수있다. 각 리간드 농도에서 바인딩 비율의 모델에서, 리간드 농도의 최대 값에 대한 값을 조사한다. 이 0.99 이상이면, 상기 분석 결과를 향상시키기 어렵다. 비율이 0.99보다 작 으면, 추가적인 공정은 높은 리간드 농도 샘플에 결합되지 않은 단백질의 효과를 보정하기 위해 요구된다. 단계 5.2에서, (다른 셀이 사용될 수 있고, R2는 표 3에 수학 식 적절히 대체) 셀 R2에 (단계 14.4로부터) 가장 높은 리간드 농도 시점에서 바인딩 리간드의 비율 물품. 가장 높은 리간드 농도 결과의 평균 후 여분의 열을 만듭니다. 전나무에서t 셀은 "리간드 농도 infinite로 외삽"로서 표 3의 방정식을 복사한다. 이 칼럼의 나머지 셀에이 수식을 복사합니다. 참고 :이 계산은 가장 높은 리간드 농도의 결합되지 않은 단백질의 효과를 제거합니다. 자유 리간드 단백질과 리간드 높은 농도의 차이는 각각의 온도 지점에서 완전히 결합 단백질과 결합되지 않은 상태 사이의 예상 차이를 제공하기 위해 가장 높은 농도로 리간드 바인딩 비율의 역수로 승산된다. 이 차이는 추가되거나 완전히 리간드 바인딩 단백질의 예상 형광을 수득 바운드 상태로부터 감산된다. 이 새로운 열이있는 SPSS의 데이터 시트에서 최대의 리간드 농도에 대한 컬럼을 교체 및 데이터 피팅을 반복합니다. NOTE : – 모델에서 최대 concentrati 리간드 바인딩 비례 더 큰 변화를 제안하는 경우 5.9 반복 될 필요가있다 5.7 단계(이 경우, 아마도 더 포함 리간드 농도 점으로 실험을 반복 이상적 일 것이다)에. 단백질 이진 시프트 및 디스플레이 협동 동작을 도시의 경우는 수학 식 4.1로부터 단계들로 치환한다 단계 5.5에 제시 하였다. "상위"및 "하부"파라미터는 각각 1과 0으로 대체되어야한다. 재현성을 보장하기 위해 적어도 두 배 (단계 2.12 참조) 실험을 반복한다.

Representative Results

이 방법에 대한 훌륭한 테스트 기판은 헥소 키나제이다. 이는 용이하게 시판되고, 대부분의 실험실에서 발견 및 분석에서 분명, 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 두 기판을 갖는 장점이있다. 초기 농도 화면 (1 프로토콜), 헥소 키나제 및 글루코오스 (도 2A)를 사용하여, 예상 K (D)이 0.2 mm 내지 1.7 범위 일 것이라고 제시한다. 따라서, 큰 화면 (프로토콜 2) 표 4의 결과 (그림 2B)에 표시된 농도를 사용하여 수행 된 단일 사이트 리간드 결합 식에 잘 맞는 표시 (프로토콜 부분 3.3) [9]을 준 K 1.2 ± 0.1 mm의 D. 추정 heptose-guanyl 전이 WcbM (19, 20)는 GTP (그림 3A)에 결합에 강한 열 변화를 보여줍니다. 초기 화면이 제안하는 KD는 약 100 μM의 범위에있을 것이다. . 따라서, 전체 화면이 3.3 수학 식 결과 피팅 표 5에 나타내는 농도를 사용하여, 설정 합리적인 착용감 (0.981의 R 2,도 3B) 보였다 .however를을, 데이터 사이의 명백한 차이가있다 모델, 상이한 방정식이 필요하다는 것을 시사한다. WcbM 서열과 단백질 데이터 뱅크 (21)의 검색은 구조 양식 이량 체를 결정되었습니다있는 가장 가까운 상동 것으로 나타났다. 따라서 데이터는, 순차 협동하고 두 리간드 (4 프로토콜)의 독립적 인 결합을 위해 세 개의 방정식을 사용하여 분석 하였다. 순차적이고 독립적 바인딩 모델 모두 0.992의 R 2 값 0.480와 0.461의 Sy.x을 준 반면 협력 모델의 피팅 통계, R이 0.998의 가치와 0.215의 잔차 (Sy.x)의 표준 편차를 준 각각. 이 모델 제안협력 모델은 데이터에 가장 적합한되었다 제공 : 여기, 230 ± 10 μM의 K ½이 관찰되었다, 0.52 ± 0.02 (그림 3C)의 n 값으로. 이 바인딩에 부정적인 협동성을 지적했다. K!에 대한 단위가 좀 불충분 μM 0.52 것 같은 K ½이, 오히려 K (d)보다이 경우에 사용합니다. 추정 GDP-6-데 옥시-β-D-는 manno -heptopyranose 2 -acetylase O, WcbI (22)는 시차 주사 fluorimetry에서 다소 특이한 결과를 보여줍니다. 모든 리간드의 부재에서, 간단 명료 한 변성 (도 4a)를 도시한다. 프로토콜에 설명 된 코엔자임 A (CoA를가) DSF를 사용하여이 단백질의 리간드,이 파트너 단백질의 친 화성이 확인되었다 조사 하였다. CoA를 고농도, 강한 (S)의 존재하에높은 온도로 hift 15 °의 C의 용융 온도에 변화가 관찰된다. 그러나, 중간 농도에서 오히려 중간 용융 온도에서 단상 녹는 시프트보다 WcbI는 단백질 리간드없는 온도, 또는 완전히 구속 용융 온도 (도 4a) 중 하나에 녹아 나오는 상을 가진 용융 나타났다 . 더 높은 온도 (도 4b)에서 용융 비율을 증가 기질 농도가 증가함에 따라, 용량 의존적으로 변경이 종의 비율. 이러한 데이터를 직접 분석은 도전이었다 파생 방법이 녹는 이벤트가 발생하였으나, 증가 리간드 농도 변화를 보여주는 데 도움이되지 않았 음을 강조하면서 볼츠만 방정식에 피팅하는 것은 매우 가난한 맞는을 주었다. 이들 데이터를 분석하기위한 통상적 인 방법은 덜 따라서 (프로토콜 5)를 채택 하였다. 형광 D리간드없이 높은 리간드 농도 erivati​​ve 결과는 본질적으로 더 낮은 용융 온도의 모든 단백질, 또는 높은 용융 온도를 나타내는 상태로 촬영 하였다. 나머지 데이터는 화합 유도체 (도 4C)에 합산 비율,이 두 가지 상태의 각각의 비율의 합계로서 각 시점에서 장착되었다. 수득 된 데이터는 이전과 같은 방정식을 이용하여, 겉보기 K d를 구하는 전으로 장착 하였다. 이 "높은"리간드 점은 95 %의 리간드가 결합 될 가능성이 있음을 강조했다. 데이터는 100 % 단백질 결합의 결과를 외삽 예측하고, 데이터는 58 ± 2 μM의 겉보기 K d를주고 반복 피팅. 이 바인딩 모델 (그림 4D)에 실험 결과의 우수한 착용감을 제공했다. <img alt="그림 1" FO : 콘텐츠 너비 = "5 인치"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 51,809 / 51809fig1highres.jpg"너비 = "500"/> 실험 설정 및 분석의 1 예를 그림. (A) 열 변성 프로파일의 예상 된 형상의 예 (효모 헥소 키나제에 대한 데이터에서 촬영). 원시 데이터의 특징 형상은 얕은 감소 하였다 최대 형광 프로그레시브 상승 (도 9에서보다 상세하게 논의)를 나타낸다. 이것은 형광의 1 차 도함수에서 단일 피크를 동반한다.을 Graphpad로 데이터 입력 (B) 실시 예. 리간드 농도는 X 축에 주어지고, Y 축에 용융 온도를 관찰한다.을 Graphpad 수학 식 정의의 (C) 실시 예. (D) 예를 정확하게 및 단백질 농도의 고정 변수의 초기 값을 설정하는, 해리 상수의 올바른 판정을 활성화합니다.m / 파일 / ftp_upload / 51,809 / 51809fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. . 시차 주사 fluorimetry 의해 측정 글루코스 헥소 키나제의도 2의 상호 작용 (A) 글루코스 농도의 광범위한 테스트 초기 실험은 K (D)가 0.2의 범위에있을 가능성이 있음을 시사 -. 1.7 mM의 (B) 상세한 실험, 포도당의 16 농도를 테스트, 1.12 ± 0.05 밀리미터로 명백한 K (D)의 결정을 할 수 있습니다. 데이터는 (35.4 ± 0.2 ºC 및 49.3 ± 0.5 ºC 각각 피팅 바닥 (T1)와 최고 (T2) 온도가) 하나의 바인딩 이벤트에 대한 모델에 매우 잘 맞는다. 그 주이들 데이터는 10 mM의 MgCl2를 존재 하에서 수집 하였다. 이러한 이미지는 그래프 패드를 사용하여 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. GTP와 WcbM의 그림 3의 상호 작용은 방지 협력 바인딩을 알 수있다. (A) GTP 농도의 광범위한 테스트 초기 실험은 K (D)가 (200)의 범위에있을 가능성이 있음을 시사 -. 500 μM GTP 16 농도를 시험 (B) 상세한 실험은, 겉보기에 대한 값을 제안 120 ± 20 μM의 K d를. 그러나, 로그 스케일은 X-축에 사용되는 경우, 상당한 discre 거기모델 데이터 사이의 입주는. 협력 모델과 같은 데이터 (C) 분석은 단순한 협력 모델을 사용하는 데이터에 대한 우수한 착용감을 보여준다. 여기서, K 230 ± 20 μM의 ½은 (각각 69.63 ± 0.06 ºC 및 79.9 ± 0.1 ºC에 피팅 바닥 (T1)와 최고 (T2) 기온) 협동성 계수 N = 0.52 ± 0.02로 결정되었다. WcbM이 이량 것으로 보인다,이 효소는이 GTP에 결합에 완벽하게 anticooperative 것을 의미한다. 이러한 이미지는 그래프 패드를 사용하여 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4 WcbI는 이상성 녹는 패턴을 보여줍니다그 리간드 보효소 A (COA)의 존재. (A) WcbI은, 리간드 (청색)의 부재하에, 간단한 단상 융점 패턴을 나타낸다. 높은 리간드 농도 (1 ㎜, 녹색 라인)에서, 유사한 패턴이 관찰된다. 그러나, 중간 리간드 농도. (60 μM; 적색 선)이 뚜렷한 융점 피크는, 리간드 – 자유 리간드 – 결합 상태에 대응하는 관찰된다 (B)의 피크의 두 세트 사이의 천이는 용량 의존적 전체 건너편 농도의 범위는. 리간드 무료 높은 리간드 결과의 비율의 합으로 2 상 용융 (C) 모델링은 (빨간 선에 비해 점선 보라색 선) 데이터에 잘 맞는을 제공합니다. 이 적합 전체 인원 (파란색 파선)에 (모델이 제안 ~ 95 % 점유율)이 높은 리간드 농도에 대한 관찰 결과를 외삽에 의해 향상된다. (D) CoA를 소에 바인딩 WcbI의 비율 얻은 데이터를 WS 58 ± 2 μM의 K D 포함 간단한 결합 모델에 우수한 착용감 (이러한 데이터 결과들의 제 1 세트에 기초하여 제 2 일에 대해 선택된 약간 다른 리간드 농도로, 두 개의 분리 된 일에 수집 된 데이터를 표시). 패널. -을 Graphpad를 사용하여 (C) Excel을 사용하여 제조하고, 패널 (D) 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 초기 실험 표 1 레시피. 시약 믹스 볼륨 (μL) 단백질 0.11 ㎎ / ㎖의 최종 농도 ; "> 5000X SYPRO 오렌지 0.3 0.5 M HEPES pH를 7.0 3.7 5 M NaCl을 5.6 물 180 μL에 이것은 프로토콜 부 (1)이 버퍼 혼합물 일반 단백질 적합한에서 설명한 바와 같이, K (D)의 추정치를 제공하기 위해 초기 정찰 실험 단백질, 검출 시약 및 버퍼의 "마스터 믹스"를 설명한다. 이전의 결과는 다른 버퍼 표기 제안 여기서, 이들은 치환한다. 단백질 재고가 낮은 농도 (즉, 0.3 미만 ㎎ / ㎖)에있을 경우, 추가 버퍼의 양을 감소시킬 필요가있을 수도 단백질 샘플 버퍼에 이미 존재를 보상하기 위해 추가. <p클래스 = "jove_content"> K (D)의 결정을위한 표 2 레시피. 시약 믹스 볼륨 (μL) 단백질 0.11 ㎎ / ㎖의 최종 농도 5,000 배 SYPRO 오렌지 1.78 0.5 M HEPES pH를 7.0 22.2 5 M NaCl을 33.3 물 180 μL에 이는 단백질, 검출 시약, 및 (b)의 "마스터 믹스"를 설명uffer는 단백질 샘플에 대한 K (D)의 전체 측정을 위해, 프로토콜 부 (2)에 설명 된대로이 버퍼 혼합물은 일반 단백질에 적합합니다. 이전의 결과는 다른 버퍼 표기 제안 여기서, 이들은 치환한다. 단백질 재고가 낮은 농도 (즉, 0.3 미만 ㎎ / ㎖)에있을 경우, 추가 버퍼의 양을 감소시킬 필요가있을 수도 단백질 샘플 버퍼에 이미 존재를 보상하기 위해 추가. 표 3 식 및 데이터 분석을위한 파라미터. 실험 프로토콜의 단계 식 요구 매개 변수가 필요 변수 및 매개 변수에 대한 설명 3.3 </ TD> 바인딩 단일 사이트 리간드 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * (1 – ((PK D – X +의 SQRT (((P + X + K d를) ^ 2) – (4 * P * X))) / (2 * P )))) P : 단백질 농도. KD : 해리 정수. P 말하고 Td는 리간드 농도에 사용 된 동일한 단위로 제공됩니다. 위쪽, 아래쪽 : 무한 리간드 농도와 각각 어떤 리간드 농도에서 녹는 온도. 3.4 바닥 = * YMIN YMIN : (이 경우 낮은 실험 단백질 TM) Y의 최소값 최고 = * Ymax 순 </td> Ymax 순 : Y의 최대 값 (가장 높은 실험 단백질 TM) K의 D = * X YMID에서 YMID : YMIN 및 Ymax 순의 평균에 해당하는 Y의 값입니다. X는 (여기서, 중요한 리간드 농도) 대응하는 X 값이고 P = (초기 값, 적합 할 수) 4.1 단순 협력 모델 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * (((X / Kd를) ^ N) / (1 + ((X / Kd를) ^ N)))) N : H아픈 계수. 이는 단백질의 협동성 또는 기타 생화학 적 특성을 설명하고, 반드시 단백질 리간드 결합 부위의 수를 추정하지 않다. 하나의 언덕 계수는 협동성을 나타내는 없습니다 보다 낮은 값은 음의 협동성을 표시하고보다 큰 양의 협동성 값. 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 P = (초기 값, 적합 할 수 있습니다 ) N = (초기 값, 적합 할 수) 이 리간드의 결합 순차 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2)) / (1 ​​+ (X / K의 D) + ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2))) ) K2 : 초 바인딩 이벤트에 대한 해리 정수. 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 DTH : 123px; "> K의 D = * X YMID에서 YMID에서 K2 = * X P = (초기 값, 적합 할 수) 독립이 리간드의 결합 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2)) / (1 ​​+ (2 * X / K의 D) + ((X ^ 2) / (K D의 * K2) ))) 바닥 = * YMIN 시간 : 123px; "> 인기 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 YMID에서 K2 = * X P = (초기 값, 적합 할 수) 5.5 융점 이진 시프트 분석 Y = 1 – ((PK-X + D의 SQRT (((P + X + K D) ^ 2) – (4 * P * X))) / (2 * P의)) 23px; "> 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 P = (초기 값, 적합 할 수) 5.8 무한 리간드 농도로 외삽 (C2 – ((1 $ R 2달러) * B2)) / $ R 2달러 B2 : 없음 리간드 결과를 포함하는 세포. C2 : 최대 리간드 결과를 포함하는 세포. $ R 2달러 : 최대 농도로 리간드 바인딩 비율로 함유 세포. 4, 3 단계 및 (5)는 분석 소프트웨어로 상세한 방정식 외에, 데이터 분석을위한 매개 변수를 개시 정확한 정의를 필요로한다. 각각의 중요한 단계를위한 방정식은 파라미터의 정확한 선택에 도시된다. 변수와 파라미터의 의미를 설명은 참조 용으로 제공된다. 표 포도당 헥소 키나제의 상호 작용의 스크리닝 (4) 농도. 샘플 포인트 리간드 (glucosE)의 농도 (㎜) 1 0 이 0.001 3 0.005 4 0.01 5 0.03 6 0.1 7 0.3 8 0.4 9 0.7 10 1.1 11 2.1 12 3.7 13 5.3 14 7 15 9 16 11 프로토콜에 기술 된 바와 같이 마그네슘 공지 보조 인자이기 때문에 신진 효모 사카로 미세스 세 레비 시아에로부터 헥소 키나제는 10 mM의 MgCl2를 보충, 마스터 믹스에 첨가 하였다. K (D)의 초기 추정치는 0.5와 2 mM의 사이에 있었다. 실험은 글루코스 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 설정되었다. 표 GDP와 WcbM의 상호 작용의 선별 5 농도. <table border="1" cellpadding= "0"cellspacing = "0"> 샘플 포인트 리간드 (GTP) 농도 (μM) 1 0 이 0.5 3 1 4 5 5 10 6 25 7 50 8 100 9 250 10 8px; "> 500 11 1000 12 2500 13 5000 14 7500 15 10000 16 20000 프로토콜에 설명 된대로 부르크 홀데 pseudomallei부터 WcbM 마스터 믹스에 첨가 하였다. K (D)의 초기 추정치는 약 100 μM이었다. 실험은 상기와 K D의 크기보다 적어도 두 개의 명령을 포함하는 것을 목표로, GTP의 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 설정되었다.

Discussion

시차 주사 fluorimetry 단백질을 특성화하고, 잠재적 인 단백질 리간드를 식별하기위한 강력하고 다양한 방법으로 그 능력을 보여 주었다. (특히 덜 자금 실험실에서) 단백질의 안정화, 신약 개발을 촉진 결정화 ^{10,23-25에서} 잘 문서화 성공은 화합물의 초기 선별 매력적인 방법을 만들었습니다. 단백질에 추가 화합물은 명백 융점 ^7,9 분명 농도 의존적 증가를 보여준다. 그러나, 그들의 선호도 화합물 순위에 도움 겉보기 결합 상수를 결정하기 위해 이들 실험 결과를 사용하는 몇 가지 시도가있어왔다. 여기서는 체계적 리간드의 존재하에 단백질 겉보기 해리 상수를 결정하기위한 방법을 제시한다.

여기에 제시된 결과는 DSF 신속하고 견고 대한 해리 상수의 추정치를 제공 할 수 있음을 입증단백질 – 리간드 결합. 관측 데이터는 파라미터의 가능한 값에 관한 가정을 할 필요없이, K _(D)의 신속한 결정을 제공하는 상업적으로 이용 가능한 도구를 조작 할 수있다. 이 방법은 필요한 단백질과 시간 모두에서 간략한되는 일부 유사한 방법에 비해 상당한 이점을 갖는다. 여기서 설명하는 실험은 실험 당 (중으로 반복 실험 약 0.4 ㎎)의 0.13 mg의 단백질을 소비한다. 이것은 평균 40 kDa의 단백질을 가진 단일 실험이 유사한 양을 소비 할 등온 적정 열량 측정 (ITC), 필적하는. 이 프로토콜에 필요한 실험 풀세트 실험의 단일 세트에 대해, 제제를 포함하여 약 4 시간을 소비 할 것이다. 다시, 이것은 예컨대 강력한 동안 가장 자주 데이터를 얻기 위해 상당한 최적화를 필요 ITC 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 방법보다 상당히 빠를 것으로 예상된다.

우리의 결과는 심하게 원시 데이터를 검사 할 필요가 남아 있음을 입증, 이들 데이터의 착용감 용융 온도를 결정하고, 용융 온도 데이터의 착용감 해리 상수를 결정하기 위해. 첫 번째 과제는 단백질 용해 제조 원시 데이터의 형태이다. 일부 경우에, 형상은도 1a에서 관찰 된 것과 대략 수 없다. 일반적인 문제는 리간드 결합에 낮은 온도 변화, 높은 배경 형광 및 온도에서 특이한 여러 변이를 포함한다. 저온 시프트는 리간드의 결합 수에 보인다. 이 방법의 경우, 가장 중요한 매개 변수는 온도 변화에 비해, T _{m의 측정에서의} 오차이다. 삼중 측정의 표준 편차가 충분히 결합되지 않은 결합 단백질 사이의 용융 온도 변화의 10 %를 초과하지 않을 때, 데이터는 일반적으로 합리적으로 장착 할 수있다. 우리의 경험은 그 곳과 같은 온도입니다erature 이동은 개별 데이터 포인트가 매우 정확 경우에만 2 ° C, 이것은 데이터를 피팅에 충분 될 수 있습니다. 두 번째 문제는 비정상적으로 커브를 형성한다. 바인딩 리간드 단백질의 모드에 영향을 주므​​로 이러한 전개는 종종 자유 단백질과 리간드 바인딩 형태간에 다르다. 이러한 경우, 사용자는 데이터가 용융 온도와 해리 상수를 결정하기 위해 사용되도록 적절한 모델을 고려하여 사용될 수 있는지 여부를 고려해야한다. 또 다른 일반적인 문제는 단백질 공동 인자의 첨가 (예를 들면, 헥소 키나제와의 예를 MgCl ₂₎ 가장 신뢰성있는 데이터를 얻기 위해 필요하다는 것이다. 우리의 경험은 초기 판독을 복용하는 것이 가장 좋은 결과를 얻기에 필수적인의 단계에서 실험에 모든 가능성 요인의주의 깊은 고려하고있다. 또한, 대안 이론 치료는 이러한 데이터 ^15,17의 기능을 표시 할 수 있습니다. 마지막으로, 그 일부 C 단백질 드물지 않다ontain 기본적으로 높은 배경 형광을 보여 소수성 영역을 노출. 광범위하게 다른 ^6,9 검토 한 이러한 문제에 대한 솔루션은 여러 가지가있다.

특히, 사용자는 (예를 들어,도 4), 및 그 유도체를 사용하는 경우에, 복수의 용융물 모델링되어야하는지 여부 또는 유도체 볼츠만 모델을 사용할지 여부를 고려해야한다. 전개 열 모델링 두 가지 방법 볼츠만 방법 전개 곡선에 정규 S 자형 형상을 가정하면, 볼츠만 방정식에 실험적 데이터 맞는지 다르다. 대조적으로, 유도체 방법은 각 점 (도 1a의 하부 패널)에서 실험 데이터의 1 차 도함수를 취하고, 가장 높은 제 유도체의 포인트로 용융 온도를 고려한다. 3 °의 C – 파생 방법은 일반적으로 약 2에 의해 더 높은 용융 온도를 반환합니다. 대부분의 단백질은 일관성을 반환합니다두 가지 방법 중 하나의 결과 (즉, 삼중 실험에 대한 용융 온도의 표준 오차가 낮다). 이것은 보통 속속들이 곡선 펼쳐진 단백질의 정확한 형상과 관련된이며 경험적으로 각각의 경우에 가장 좋은 방법을 결정하는 것이 필요하다. 유도체 모델이 사용되는 경우, 이는 다수의 용융 사건을 고려하는 것도 중요하다. 일부 데이터는 분명히 여러 변이 증거를 보여주고, 이러한 경우에 이러한 결과는 여러 용융 이벤트가 모델링되는 경우 쉽게 해석 될 가능성이있다. 이 프로토콜의 문맥에서, 리간드의 첨가는 단백질이 반대 (가장 열적으로 깨지기 서브 도메인을 안정화하여, 예를 들어) 하나의 트랜지션에 복수의 용융 전이를 갖는으로부터 전환하거나, 발생할 수있는 경우가 종종있다. 따라서 우리는 원시 데이터가 사용하기 가장 좋은되는 방법 고려하기 전에 함께 조사하는 것을 옹호한다.

m 다음개별 융점의 odelling, 상기 문제는 프로토콜 섹션에 제시된 모델이 피팅에서 발생할 수있다. 그것은 이러한 분석은 종종 관측 데이터와 모델 사이의 차이를 강조 신중, 대수 스케일을 사용하여 해리 상수 방정식 착용감을 조사하는 것이 필수적이다 (예를 .g.,도 3). 수득 된 결과는 일반적으로 견고 반면, 해석에주의 데이터에서 더 나은 결과를 추출 할 수있는 기회 및 가장 의미를 제공한다.

이러한 데이터에 의해 제기 된 특정 문제가 DSF에, 협동성을 보여 단백질, 또는 여러 이벤트 바인딩에 배치해야 해석이다. 우리는 지금까지, 오직 다중 특이 적 결합 이벤트 (예 WcbM, 크기 배제 크로마토 그래피에 다량 체의 역할을 가장 상동 ²⁶ 다량 체이며 단백질, 및 [데이터를하지 않은 것으로 예상된다 단백질이 현상을 관찰참조]). 그것은 전혀 분명 DSF 변성에서 관찰 된 음의 협동성이 효소가 궁극적으로 부정적인 협동성을 보여 나타냅니다 것이 아니다 : 오히려,이 방법의 넓은 범위를 사용하여보다 철저하게 탐구해야합니다 복잡한 결합의 표시 일 수있다. 이 단백질의 더 광범위한 연구가 흥미로운 효과를 식별 할 가능성이 있다는 점은 우리에게 시사 않습니다.

이 방법을 사용하여 해리 상수에 대해 주어진 값은 일반적으로 등온 적정 열량계, 표면 플라즈몬 공명 등의 다른 방법에 의해 제공되는 것과 동일한 순서로한다. 그러나, 관찰 된 절대 값이 이러한 방법을 사용하여 관측보다 높은 경우이다. 이것은 적어도 부분적으로 해리 상수가 리간드와 단백질의 용융 온도에서 관찰된다는 사실의 결과이다. 이 K _d를 생리적 온도에서보다 일반적으로 높다. dissociation은 정수 방정식에 의한 반응의 온도와 관련이 :

[1]

[2]

(c의 ^θ가 표준 기준 농도이고, Δ는 G 반응의 깁스 자유 에너지 변화이다 _R, R은 몰 기체 상수이고, Δ H는 반응 엔탈피 변화이고, Δ S는 반응 엔트로피 변화 .)

이 방법의 측정 범위의 해리 상수와 반응은 일반적으로 부정적인 Δ _r에 G를 가질 것이고, 그래서 식에 온도 상승의 효과는 [1] 해리 상수를 증가시키는 것이다. 모두 깁스 자유 에너지를 구성하는 Δ H와 Δ S 기간은 (식 [2]) 그리고 온도 아르즉 종속 ²⁷ 및 해리 상수에 영향이 온도 의존성의 크기 및 부호에 의존 할 것이며, 반드시 상호 작용에 의존한다. 따라서,이 방법에 의해 결정 해리 상수가 RT에서 작동 방법에 의해 결정된 것보다 종종 더 큰 것을 예상하지 못한 것이다. 온도 의존성은 또한, 물론, 생리 온도보다 낮은 온도에서 해리 상수를 제공하는 경향이 많은 다른 방법의주의이다.

이 ITC 달리 표시 방법임을 DSF 방법의 또 다른주의 할 것이다. (SYPRO 오렌지) 이용 형광 라벨은 소수성이며, 따라서 일부 경우에 단백질 소수성 리간드의 결합과 경쟁 할 수있다. 따라서, 어떤 경우에는, 수득 해리 상수 인위적으로 인해 라벨 경쟁 발생 될 가능성이있다. 그러나, 다양한 리간드의 비교 (중 주 사용DSF)는, 친 화성 차이에 의해 화합물의 순위에 영향을 미칠 정도로 충분히 크지 않을 수있다.

이러한 방법의 잠재적 인 단점은 달성 될 수있는 검출 한계이다. 원칙적으로, 정확하게 단백질의 농도가 50 % 이하이며,이 범위 내의 값이 모호한 경우에도 정밀도가 될 가능성이 K의 _D의 값을 측정 할 수이어야한다. 이 범위의 끝의 검출 한계는 단백질 및 염료의 농도를 감소시킴으로써 약간 연장 할 수있는 동안, 기기의 감도는 단백질 농도에서 추가 감소를 방지한다. 마찬가지로, 감도의 상단부는 리간드의 용해도에 의해 결정된다. K _d를위한 수학적 강력한 추정치를 획득하기 위해서는 대략 것으로 리간드 농도를 필요 리간드 – 결합 형태로 존재하는 단백질의 90 %의 데이터를 얻기 위해 가장 중요한LY 열 번 K _d를 (더 협동성 없다고 가정). 검출 한계는 따라서 반드시 중요한 버퍼 리간드의 용해도가 10 분의 1이 될 것이다. 이 방법의 검출 한계는 일반적으로 단백질과 리간드에 따라, 1 ㎜ 내지 1 μM 내지 100 범위 일 것이라는 것을 의미한다.

결론적으로, 시차 주사 fluorimetry 단백질의 넓은 범위에 적용 가능한 다용도 기술이다. 여기에 제시된 방법을 사용하여, 신속하고 저렴하게 다른 리간드에 대한 단백질의 친화도를 결정하는 것이 가능하다. 특히 작은 실험실에서, 단백질 정제 및 안정화 응용 프로그램 metagenomes에서 효소의 기능 또는 특이성을 해명하기위한 큰 잠재력을 가지고 있으며, 신약 개발에서.

Materials

StepOne real time PCR instrument	Life Technologies	4376357	DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.
Protein thermal shift software v1.0	Life Technologies	4466037
MicroAmp Fast optical 48-well plates	Life Technologies	4375816
Optical sealing tape	Life Technologies	4375323	Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier
U-bottomed 96-well plates	Fisher	11521943
SYPRO Orange	Life Technologies	S6650	For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692
SPSS statistics version 20	IBM	N/A	Other statistics packages will provide similar functionality
GraphPad Prism 6.02	GraphPad	N/A	Other statistics packages will provide similar functionality
Hand applicator (PA1)	3M	75-3454-4264-6
Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	H5000
Glucose	Fisher scientific	10141520