Abstract
هناك مجموعة واسعة من وسائل متاحة لتحديد التفكك المستمر بين البروتين والتفاعل الجزيئات الصغيرة حاليا. ومع ذلك، فإن معظم هذه تتطلب الوصول إلى معدات متخصصة، وغالبا ما تتطلب قدرا من الخبرة لإقامة فعالية تجارب موثوقة وتحليل البيانات. وتستخدم بشكل متزايد التفاضلي fluorimetry المسح (DSF) كوسيلة من وسائل قوية لفرز أولي من البروتينات للتفاعل جزيئات صغيرة، إما لتحديد الشركاء الفسيولوجية أو لاكتشاف ضرب. هذا الأسلوب له ميزة أنه يتطلب سوى آلة PCR مناسبة للالكمي PCR، ومناسبة حتى الأجهزة متاح في معظم المؤسسات. مجموعة ممتازة من البروتوكولات متاحة بالفعل؛ وهناك سوابق قوية في الأدب لاستخدامات متعددة من طريقة. وقد اقترح العمل السابق عدة وسائل لحساب ثوابت التفكك من البيانات مهرجان دبي للتسوق، ولكن هذه هي تطلبا رياضيا. هنا، نحن ماركاonstrate طريقة لتقدير ثوابت التفكك من كمية معتدلة من البيانات التجريبية مهرجان دبي للتسوق. يمكن عادة هذه البيانات يتم جمعها وتحليلها في غضون يوم واحد. علينا أن نظهر كيف نماذج مختلفة يمكن استخدامها لتتناسب مع البيانات التي تم جمعها من الأحداث ملزمة بسيطة، وحيث المواقع التعاونية ملزمة، أو مستقلة ملزمة موجودة. وأخيرا، نقدم مثالا لتحليل البيانات في حالة حيث لا تنطبق النماذج القياسية. يتم توضيح هذه الأساليب مع البيانات التي تم جمعها على البروتينات تحكم المتاحة تجاريا، واثنين من البروتينات من برنامج البحوث لدينا. وعموما، يوفر طريقة لدينا وسيلة مباشرة للباحثين للحصول على مزيد من التبصر بسرعة تفاعلات البروتين يجند باستخدام مهرجان دبي للتسوق.
Introduction
سيتم ربط جميع البروتينات، مع الانتماءات متفاوتة، لمجموعة متنوعة من الجزيئات الأخرى من أيونات بسيطة لالجزيئات الكبيرة الأخرى. في كثير من الحالات، والبروتينات ربط للشركاء جزيء صغير كجزء من وظيفتها الطبيعية (على سبيل المثال، كيناز ملزمة لATP). قد تكون التفاعلات الأخرى لا علاقة لها وظيفة، ولكنها مفيدة تجريبيا كأدوات (مثل الجزيئات الصغيرة التي استقرار البروتينات لتحسين نجاح تبلور، أو المساعدة في الحفاظ البروتينات في الحل). بينما الجزيئات الصغيرة التي تربط إلى مواقع نشطة والمواقع تفارغي من البروتينات يمكن أن تكون بمثابة مثبطات، وهكذا تعدل من نشاط الانزيمات.
هناك مجموعة واسعة من التقنيات التي يمكن استخدامها لتحديد تقارب من البروتينات لجزيئات الشريكة. وينظر متساوي الكالوري المعايرة 1 على نطاق واسع بأنه "معيار الذهب"، لأنه يقدم معلومات غنية على ردود الفعل، والتسمية خالية، وفرص محدودة لrtifacts التجربة. ومع ذلك، على الرغم من التحسينات الأخيرة في حساسية الأجهزة وأتمتة التجريبية مجموعة المتابعة، فإنه لا يزال مكلفا نسبيا من حيث الاحتياجات من البروتين، وعلى أحسن تقدير إنتاجية المنخفضة والمتوسطة، والأنسب لتفاعلات مع معتدلة إلى الانتماءات عالية (10 نانومتر إلى 100 ميكرومتر K د) 2. طرق تسمية أخرى مجانية مثل الرنين مأكل السطح أو طبقة ثنائية التداخل 3 عرض الانتاجية العالية، وحققت حساسية للكشف عن جزيئات أصغر منخفضة تصل إلى 100 دا. ومع ذلك، وأدوات الإنتاجية العالية لهذه الطرق مكلفة نسبيا، لها ما يبررها فقط حيث سيكون هناك الإنتاجية المستمرة للمشاريع ذات الصلة، وذلك يحتمل أن تكون بعيدة عن متناول العديد من المختبرات الأكاديمية.
وكان أول وصف الفرق fluorimetry المسح (مهرجان دبي للتسوق، أو thermofluor) في عام 2001 4 كطريقة لاكتشاف الأدوية. في هذا methoد، يتم تحضين البروتينات مع صبغة الفلورسنت (استخدمت الأصباغ في البداية، النفثالين السلفونيك)، الذي يغير مضان طلبها ملزمة للمناطق مسعور من البروتينات. العينة البروتين صبغة ثم هي ساخنة، ومضان مراقبة مع ارتفاع الحرارة. تتكشف من البروتين، والتعرض لأجزاء مسعور من البروتين، يؤدي إلى وجود نمط مميز في مضان بوصفها وظيفة من درجة الحرارة (الشكل 1A). التجربة يمكن أن يؤديها في كميات صغيرة في أي صك PCR الكمي التجاري، وذلك في تجربة واحدة، وعدد كبير من العينات يمكن اختبار في وقت واحد (عادة 48، 96 أو 384 عينات، اعتمادا على نموذج الصك). يمكن عادة أن يؤديها في التجارب حول وجود ساعة، وتوفير إمكانية تحليل إنتاجية عالية من العينات 5.
شهدت تحسينات أخرى لمنهجية اعتماد الأصباغ مع أفضل الخصائص الطيفية 6،7 8،9. وقد تم تمديد نطاق التطبيقات للأسلوب، مع التركيز بشكل خاص على إيجاد الظروف المثلى لإعداد وتخزين البروتينات 10، وعلى تحديد الشركاء المحتملين ملزم لمساعدة تبلور 11. على إنتاجية عالية نسبيا من طريقة، منخفضة التكلفة نسبيا بالبروتين (~ 2 ميكروغرام في رد الفعل) جعلت، وتطبيق لدراسة الجزيئات ملزمة ضعيفة DSF أداة قيمة لجزء يستند تصميم المخدرات، لا سيما في سياق أكاديمي 12-14.
على الرغم من تطبيق واسع من مهرجان دبي للتسوق لدراسة تفاعلات البروتين يجند، ووصف عدد قليل من الدراسات تحديد ثوابت التفكك من هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد اتجهت هذه المعادلات لإنتاج مفصلة تصف تتكشف من البروتين، مع العديد من المعلمات التي يجب تركيبها على البيانات متفرق أو في بعض الحالات البريدstimated 7،15-17. هذه الأساليب هي ذات أهمية خاصة في الحالات الصعبة، مثل المركبات ملزمة بإحكام، أو البروتينات التي تظهر التحولات غير عادية. ومع ذلك، بالنسبة لكثير من المختبرات، وهذه التحليلات التفصيلية هي مرهقة جدا للاستخدام الروتيني. لذا نقترح العلاجات البديلة لسيناريوهات مختلفة، وإظهار كيف يمكن استخدام هذه البيانات لتناسب مختلف التفاعلات الناتجة عن البروتين يجند. يستخدم أسلوب لدينا الصك StepOne QPCR، التي برمجيات تحليل البيانات مفصل متاح. بينما هذا يسرع تحليل البيانات، ويمكن معالجة النتائج من الأدوات الأخرى باستخدام أساليب نشرت سابقا 9، ويمكن إجراء نفس التحليل المصب.
Protocol
1. تحديد قيمة تقريبية للثابت التفكك (أي ضمن واحدة أمر من حجم)
- إعداد خليط مفصل في الجدول 1.
- إعداد مخزونات يجند الاهتمام على أعلى تركيز المتاحة، وبعد ذلك في ستة عشرة أضعاف التخفيفات من هذا. حيث يعرف على K تقريبي د من البيانات السابقة، نهدف إلى أن اثنين على الأقل من تركيزات أعلى وأسفل K د.
- قسامة 18 ميكرولتر من الخليط في ثمانية آبار في لوحة QPCR. إضافة 2 ميكرولتر من المذيبات لأول بئر. إضافة 2 ميكرولتر من كل عضو من سلسلة يجند التخفيف (الخطوة 1.2) إلى جانب واحد من كل سبعة آبار المتبقية.
- وضع ختم QPCR على طبق من ذهب. لتحقيق ختم جيدة من لوحة، وضع يده قضيب (انظر الجداول من الكواشف محددة) في منتصف اللوحة. سلس أسفل ختم على جانب واحد، ثم كرر على النصف الآخر منلوحة.
- لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
- وضع لوحة في صك StepOne QPCR. حدد "منحنى تذوب" الخيار، المرشحات ROX، واختيار سريع سرعة المنحدر (وهذا يوفر وقفة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية، تليها منحدر إلى 99 درجة مئوية خلال 40 دقيقة، ومن ثم وقفة 2 دقيقة). تشغيل تمسخ الحراري.
هي ملفات البرامج النصية لأداء شوط على شبكة الإنترنت في http: ملاحظة // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - في ختام المدى الصك، انقر على زر "تحليل" على الشاشة. حفظ الملف نتيجة.
- فتح البروتين برامج التحول الحراري.
- إنشاء دراسة جديدة؛ في علامة التبويب خصائص، وإعطاء هذا الاسم، وفي علامة التبويب الشروط، بالتفصيل بروابط.
- الانتقال إلى علامة التبويب ملفات التجربة، واستيراد الملفات المحفوظة نتائج (XXX.eds)، وتحديد محتويات كل بئر (قالب فيلهي العناوين المتاحة من المؤلفين).
- الانتقال إلى علامة التبويب تحليل، ثم اضغط على زر "تحليل".
ملاحظة: هذا تحليل النتائج. فمن الممكن لتصدير النتائج لمزيد من التحقيق مع Excel باستخدام علامة التبويب تصدير. ويتم تصدير النتائج في شكل علامة التبويب المحددة. فمن الأفضل لفتح الملف الذي تم تصديره في Excel، وعلى الفور حفظها في تنسيق Excel.
- تحقق من أن البروتين في وجود المذيبات وحده يعطي نتيجة مشابهة لتلك التي تظهر في الشكل 1A. المقبل، فحص درجات الحرارة وذوبان لوحظ في النتائج في "تكرار" جزء. تأكد من أن هذا يظهر زيادة واضحة في درجة حرارة انصهار مع زيادة تركيز يجند.
ملاحظة: من الناحية المثالية، وهذا سيوفر درجة الحرارة القصوى ذوبان واضحة (على افتراض أن البروتين هو تماما ملزمة يجند)، وK تقريبي د حيث درجة حرارة انصهار هو منتصف الطريق بين البروتين خالية من يجند والحد الأقصى.
2. التجريبية مجموعة المتابعة لتحديد ثابت التفكك
- إعداد خليط مفصل في الجدول رقم 2 بأنها مزيج الرئيسي.
- إعداد مخزون من يجند في خمسة عشر تركيزات مختلفة، والتي سوف تضعف عشرة أضعاف في التجربة النهائية. من الناحية المثالية، وتشمل تركيزات اثنين على الأقل من حيث الحجم فوق وتحت تقدر K د، وتوسيط تركيزات على قدر K د. التركيز على سبع نقاط في أمر من حجم يقدر K د، برصيد أربع نقاط أخرى على جانبي ذلك؛ إذا كان هناك اختيار، وتشمل المزيد من النقاط في القيم التي تشبع.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، فمن الممكن لتغيير الظروف التجريبية مثل أن مخزون يجند هي في ضعف التركيز التجريبي، حيث يجند الذوبان يحد. - إضافة 120 ميكرولتر من سيدمزيج لثمانية آبار في قاع U-96 لوحة جيدا، ليكون بمثابة خزان للصرف مناسب من مزيج الرئيسي. استخدام ماصة 8 قنوات للاستغناء 18 ميكرولتر في عمود واحد من لوحة PCR. تكرار لخمسة أعمدة أخرى، لإعطاء ما مجموعه 48 بئرا شغل في نمط 6 × 8 على لوحة.
- إضافة 20 ميكرولتر من الأسهم يجند، أو المذيب، لفصل الآبار في قاع U-96 لوحة جيدا. باستخدام ماصة 8 قنوات، نضح 2 ميكرولتر من ثمانية أسهم يجند مختلفة (أو المذيبات). إضافة هذه إلى عمود واحد من لوحة PCR التي كانت مليئة مزيج الرئيسي في الخطوة 2.3. كرر بنفس ثمانية يجند / الأسهم مذيب للمزيد من عمودين. نضح 2 ميكرولتر من ثمانية يجند أو المذيبات الأسهم المتبقية، وإضافة هذه إلى العمود الرابع في اللوحة. كرر هذا لمدة أعمدة أخرى. وهذا يعطي عينات ثلاث نسخ لجميع يجند 16 والعينات المذيبات.
- وضع ختم QPCR خلال لوحة (راجع الخطوة 1.4).
- لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدةاثنين دقيقة.
- وضع لوحة في الصك QPCR. تشغيل تمسخ الحراري باستخدام المعايير المحددة في الخطوة 1.6.
- في ختام المدى الصك، انقر على زر "تحليل" على الشاشة. حفظ الملف نتيجة.
- فتح البروتين برامج التحول الحراري. إنشاء دراسة جديدة؛ في علامة التبويب خصائص، وإعطاء هذا الاسم، وفي علامة التبويب الشروط، بالتفصيل بروابط.
- الانتقال إلى علامة التبويب ملفات التجربة، واستيراد الملفات المحفوظة نتائج (XXX.eds)، وتحديد محتويات كل بئر.
هي ملفات القالب على شبكة الإنترنت في http: ملاحظة // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - الانتقال إلى علامة التبويب تحليل، ثم اضغط على زر "تحليل".
- اختيار "مكررات" علامة التبويب من القائمة على الجانب الأيسر من الشاشة لإظهار النتائج على النحو يثلث. تقييم موثوقية البيانات على أساس مدى ضيق ويثلث هي. شولد تظهر يثلث الفقراء استنساخ، فحص البيانات الخام عن كثب.
- تحليل البيانات باستخدام كل من بولتزمان أو أساليب المشتقة لتقييم درجة حرارة انصهار. اختيار "تكرار النتائج" علامة التبويب، وفي "تكرار النتائج مؤامرة" تبديل "مؤامرة من قبل:" بين زر "تيم - بولتزمان" و "تيم - المشتق". حدد الطريقة التي تعطي استنساخ أكبر للعينة. تصدير النتائج لمزيد من التحقيق مع Excel باستخدام علامة التبويب تصدير.
ملاحظة: للحصول على العينات التي تظهر التحولات متعددة، هو دائما تقريبا أفضل لاستخدام أسلوب المشتق في وضع متعددة ذوبان. ويتم تصدير النتائج في شكل علامة التبويب المحددة. فمن الأفضل لفتح الملف الذي تم تصديره في Excel، وعلى الفور حفظها في تنسيق Excel. - تكرار التجربة مرتين على الأقل، بما في ذلك تكرار في يوم منفصل، لضمان استنساخ النتائج. يجب تحليل البيانات (انظر الخطوة 3 أدناه)تشير إلى أن قيمة K د مختلفة إلى حد كبير في التقدير الأصلي، تغيير تركيزات يجند وفقا لذلك (راجع الخطوة 2.2) لضمان وجود مجموعة جيدة من القيم حول K د.
3. تحليل البيانات لتحديد ثابت التفكك تحت تمسخ الحراري
- إنشاء جدول في Excel لتركيزات يجند ودرجة حرارة انصهار.
- افتح البرنامج GraphPad بريزم، وإنشاء جدول XY. إدخال البيانات، وذلك باستخدام العمود X للتركيزات يجند والعمود Y للذوبان نتائج درجة الحرارة.
ملاحظة: مثال المعروضة الشكل 1B. وهناك سيناريو مع معادلات مسبقة، والتعليمات البديلة لاستخدام الحزمة الإحصائية SPSS، متاحة على الإنترنت في http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - في علامة التبويب تحليل، حدد الخيار لتغيير تحليل المعلمةق (على Ctrl + T). للدخول إلى النموذج الصحيح، اختر "جديد"، و "إنشاء معادلة جديدة". إدراج المعادلة المفصلة في الجدول 3 ب "موقع واحد يجند ملزمة".
ملاحظة: ويرد مثال من هذه الخطوات في الشكل 1C. عند استخدام البرنامج النصي مع المعادلات تم تحميلها مسبقا، المعادلة ذات الصلة يمكن أن توجه اختيار من القائمة بدلا من إدخالها. وتقدم اشتقاق هذه المعادلة في الملحق. - حدد "قواعد القيم الأولية" مربع، وإدخال قواعد القيم الأولية على النحو المفصل في الجدول 3.
- تقييد المعلمة P، بأنه "ثابت يساوي" وأدخل تركيز النهائي من البروتين (في نفس الوحدات كما هو نظرا ليجند في).
- اختر موافق لإجراء التحليل.
ملاحظة: ويرد مثال من هذه الخطوات في الشكل 1D. برنامج الرسوم البيانية تنتج شخصية تظهر البيانات ويصلح لهذا النموذج. أمثلة روتظهر التحليلات ذات المناظر في بيانات تمثيلية.
4. تركيب البيانات لنماذج التعاونية
لتناسب البيانات إلى النموذج التعاوني، والاختيار بين إما النموذج التعاوني بسيط، أو نموذج حيث يتم تعريف اثنين ثوابت التفكك منفصلة. ويفضل النهج الأول في حالة cooperativity السلبية، أو التحقيق الأولي. ومع ذلك، من حيث المبدأ فمن الأفضل في حالات cooperativity إيجابية لنموذج اثنين من التفكك مختلف ثوابت 18. في هذه الحالة، يمكن نمذجة المضي قدما على افتراض إما متتابعة ملزم من يغاندس، أو مستقلة ملزم من يغاندس.
- اتبع نفس الخطوات الأولية كما في بروتوكول 3. ومع ذلك، في الخطوة 3.3، إدراج واحدة من المعادلات المدرجة في الجدول 3 ب "النموذج التعاوني بسيط"، "ملزمة متسلسل اثنين من يغاندس"، أو "المستقلة ملزمة اثنين بروابط" 18.
- تحديد القواعد ذات الصلة عن القيم الأوليةالمرتبطة بكل من هذه المعادلات في الجدول 3.
- دراسة نوبة من نموذج للبيانات. يجب احتواء البيانات بشكل سيئ، والنظر في نموذج آخر.
ملاحظة: من المهم أيضا أن تدرس بعناية المناسب من درجة حرارة انصهار للبيانات من قبل البروتين برامج التحول الحراري (الخطوة 2.9): في بعض الأحيان لا بد من تغيير المعلمات هنا للحصول على أفضل النتائج. وهناك اعتبار آخر هو ما إذا كانت مجموعة من نقاط البيانات مثالية، وإذا كانت هناك أي نقاط الشاذة: إما مجموعة محدودة من البيانات على جانبي K د، أو نقطة واحدة الشاذة (وخاصة على أعلى تركيزات يجند)، يمكن أن تؤثر بشكل كبير النتائج. - تكرار التجربة مرتين على الأقل (راجع الخطوة 2.12) لضمان التكاثر.
5. تركيب البيانات على منحنيات عرض تحولات الثنائية الانصهار في درجة الحرارة
في بعض الأحيان، وليس استجابة متدرجة ليجند، كانت البروتيناتلوحظ أن تعتمد استجابة الثنائية، حيث يتم فصل عينة ملزمة بوضوح من عينة غير منضم. وتقدم مثالا في نتائج ممثلة (الشكل 4). في هذه الحالة، سوف المناسب لدرجات الحرارة وذوبان لا تقدم مناسبا لK د.
- تصدير إخراج البيانات الخام من البروتين برامج التحول الحراري. لكل نقطة درجة الحرارة، وحساب متوسط مضان ليجند الصفر، وأعلى تركيزات يجند. جدولة النتائج من كل نقطة البيانات القادمة لهذه.
ملاحظة: الخطأ التي تم إنشاؤها هنا هو أقل من الخطأ في درجات الحرارة وذوبان المجهزة. - فتح الحزمة الإحصائية SPSS. نسخ درجات الحرارة، وهما قواعد البيانات يعني، والبيانات لكل تجربة لنافذة البيانات في SPSS. في علامة التبويب متغير، وتعيين مجموعة البيانات يعني لا ليجند بأنها "منخفضة"، ومجموعة البيانات سيلة لأعلى تركيز يجند بأنها "عالية".
- تحميل ملف تركيب متاحعلى الانترنت في في http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . حدد "تشغيل → تشغيل الكل".
- نسخ نسبة النتائج منضم إلى مصنف Excel جديد، مع تركيزات يجند ذات الصلة.
- افتح البرنامج Graphpad، وإنشاء جدول XY. إدخال البيانات، وذلك باستخدام العمود X للتركيزات يجند والعمود Y للذوبان نتائج درجة الحرارة. في علامة التبويب تحليل، حدد "المعلمات تحليل التغيير". للدخول إلى النموذج الصحيح، اختر "جديد"، و "إنشاء معادلة جديدة". أدخل المعادلة الواردة في الجدول 3، على النحو الوارد "تحليل التحولات ثنائية في درجة حرارة انصهار".
- حدد خانة "قواعد القيم الأولية"، وإدخال قواعد القيم الأولية بالتفصيل في الجدول 3. تقييد معلمة P، بأنه "يساوي ثابت ل" وأدخل تركيز النهائي من البروتين (في نفس وحدات الدوري الاسبانيوتعطى الثانية في).
ملاحظة: يتم عرض أمثلة لاستكمال هذه الصناديق للبروتوكول في قسم 3 في الشكل 1C، د. - إذا كان هناك مناسبا، يمكن تحسين النتائج وفقا لاستقراء النتيجة المتوقعة في تركيز يجند لانهائية. من النموذج من نسبة ملزمة في كل تركيز يجند، دراسة قيمة أعلى قيمة تركيز يجند. إذا كان هذا هو 0.99 أو أكثر، ومزيد من التحليل من غير المرجح أن تحسين النتائج.
- إذا كانت النسبة أقل من 0.99، مطلوب خطوة إضافية لتصحيح آثار البروتين غير منضم في أعلى تركيز عينة يجند. في خطوة 5.2، والكتابة نسبة يجند ملزمة في أعلى نقطة تركيز يجند (من الخطوة 5.7) في الخلية R2 (يمكن استخدام خلية مختلفة، والاستعاضة R2 مناسب في المعادلة في الجدول 3). إنشاء عمود إضافي بعد المتوسط من أعلى نتائج تركيز يجند. في التنوبر خلية، نسخ المعادلة المدرجة في الجدول 3 ب "استقراء لانهائي تركيز يجند". نسخ هذه الصيغة إلى الخلايا المتبقية في هذا العمود.
ملاحظة: هذا الحساب يزيل تأثير البروتين غير منضم في أعلى تركيز يجند. يتم ضرب الفرق بين الحرة والبروتين يجند أعلى تركيز يجند بواسطة معكوس نسبة الالتزام على أعلى تركيز يجند لتوفير الفرق المتوقع بين الدول بروتين ملزمة تماما وغير منضم في كل نقطة درجة الحرارة. يضاف هذا الفرق أو تطرح من دولة غير منضم لإعطاء مضان المتوقع للبروتين ملزمة يجند بالكامل. - استبدال عمود لأقصى تركيز يجند في ورقة البيانات SPSS مع هذا العمود الجديد، وكرر تركيب البيانات.
ملاحظة: الخطوات 5،7-5،9 قد تحتاج إلى تكرار إذا يوحي نموذج تغيير كبير آخر في نسبة الالتزام في أقصى concentrati يجندعلى (إذا كان هذا هو الحال، فإنه ربما يكون مثاليا لتكرار التجربة مع أعلى نقطة تركيز يجند مدرجة). - في الحالات التي يظهر البروتين السلوك التعاوني تحول ثنائي ويعرض، اقترحت المعادلة في الخطوة 5.5 ينبغي الاستعاضة مع تلك من الخطوة 4.1. "توب" والمعلمات "القاع" ينبغي الاستعاضة عن 1 و 0 على التوالي.
- تكرار التجربة مرتين على الأقل (راجع الخطوة 2.12) لضمان التكاثر.
Representative Results
اختبار الركيزة ممتازة لهذا الأسلوب هو هيكسوكيناز. وهذا له مزايا يجري بسهولة المتاحة تجاريا، وجود اثنين من ركائز التي وجدت في معظم المختبرات، والتي تقدم واضحة، والنتائج استنساخه في مقايسة. شاشة تركيز الأولية (بروتوكول 1)، وذلك باستخدام هيكسوكيناز والجلوكوز (الشكل 2A)، يشير إلى أن K المرجح د ستكون في نطاق 0،2-1،7 مم. ولذلك، تم تنفيذ أكبر شاشة (بروتوكول 2)، وذلك باستخدام تركيزات مبين في الجدول 4. النتائج (الشكل 2B) وتظهر مناسبا للمعادلة ملزمة الموقع يجند احد (بروتوكول القسم 3.3) [9]، وأعطى K د 1.2 ± 0.1 مم.
من المفترض هيبتوز-guanyl ترانسفيراز WcbM 19،20 يظهر التحول الحراري الشديد على ملزمة لGTP (الشكل 3A). اقترح على شاشة الأولية أن Kد أن يكون في حدود حوالي 100 ميكرومتر. وبالتالي، تم وضع كامل الشاشة تصل، وذلك باستخدام تركيزات مبين في الجدول 5 تركيب النتائج أظهرت أن المعادلة 3.3 نوبة معقول (R 2 من 0.981، الشكل 3B).. ومع ذلك، هناك فرق واضح بين البيانات و نموذج، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى معادلة مختلفة. البحث في بنك المعلومات بروتين 21 مع تسلسل WcbM أظهرت أن أقرب المتماثلات التي تم تحديد الهياكل dimers النموذج. كانت البيانات ومن ثم تحليلها باستخدام المعادلات الثلاث للتعاونية، متتابعة، ومستقلة ملزمة اثنين بروابط (بروتوكول 4). الإحصاءات المناسب لنموذج تعاوني أعطت قيمة R 2 من 0.998 والانحراف المعياري للمخلفات (Sy.x) من 0.215، في حين أن كلا النموذجين ملزمة متتابعة ومستقلة أعطت قيمة R 2 من 0.992 وSy.x من 0.480 و 0.461 على التوالي. هذا يشير إلى أن النموذجإعطاء الأنسب للبيانات والنموذج التعاوني: هنا، لوحظ وجود K ½ 230 ± 10 ميكرومتر، مع قيمة ن 0.52 ± 0.02 (الشكل 3C). وأشار هذا cooperativity السلبية إلى الربط. لاحظ أن K ½ تم استخدامه في هذه الحالة بدلا من K د، كما وحدات لK د ستكون غير مرضية بدلا ميكرومتر 0.52.
الناتج المحلي الإجمالي-6-ديوكسي-β-د- المفترض مانو -heptopyranose 2- يا -acetylase، WcbI 22، ويظهر نتيجة غير عادية إلى حد ما في المسح التفاضلي fluorimetry. في غياب أي بروابط، فإنه يظهر تمسخ واضح وبسيط (الشكل 4A). تم تحديد أنزيم (لجنة الزراعة)، ويجند لهذا البروتين باستخدام مهرجان دبي للتسوق، وتقارب من البروتين لهذا الشريك وكان التحقيق كما هو موضح في البروتوكول. في وجود تركيزات عالية من التميم، وق قويةويلاحظ hift إلى درجة حرارة أعلى، مع تغيير في درجة حرارة انصهار 15 درجة مئوية. ومع ذلك، في التركيزات المتوسطة، بدلا من التحول إلى الطور ذوبان في درجة حرارة انصهار وسيطة، أظهرت WcbI ذوبان ثنائي الطور، مع البروتين تظهر لتذوب في درجة الحرارة إما خالية من يجند أو ملزمة تماما درجة حرارة انصهار (الشكل 4A) . نسب هذين النوعين غيرت بطريقة تعتمد على الجرعة، مع زيادة تركيزات الركيزة زيادة نسبة التي ذابت في درجة حرارة أعلى (الشكل 4B). كان التحليل المباشر لهذه البيانات تحديا: المناسب للمعادلة بولتزمان أعطى نوبات سيئة للغاية، في حين أساليب المشتقة أبرزت أن حدثين ذوبان كانت تحدث، لكنها لم تساعد في إظهار تغيير مع زيادة تركيز يجند.
لذا اعتمد نهج أقل التقليدي لتحليل هذه البيانات (بروتوكول 5). مضان دأخذت النتائج erivative دون يجند وعلى أعلى تركيز يجند أنها تمثل أساسا عن البروتين في أقل درجة حرارة انصهار أو ذوبان الدولة أعلى درجات الحرارة. تم تركيب البيانات المشتقة المتبقية في كل نقطة كمجموع نسبة من كل من هاتين الدولتين، مع نسبة تلخيص للوحدة (الشكل 4C). البيانات التي تم الحصول عليها ثم تم تركيبها كما كان من قبل للحصول على K الظاهر د، وذلك باستخدام نفس المعادلات كما كان من قبل. وأبرز أن هذه "عالية" نقطة يجند من المرجح أن تكون 95٪ فقط يجند ملزمة. كانت البيانات ثم استقراء إلى التنبؤ نتيجة لبروتين ملزمة 100٪، والبيانات المتكررة المناسب لإعطاء K الظاهر د 58 ± 2 ميكرومتر. قدمت هذه نوبة ممتازة من النتائج التجريبية للنموذج ملزم (الشكل 4D).
FO: محتوى العرض = "5in" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" العرض = "500" />
الرقم 1. أمثلة من تجربة انشاء والتحليل. (A) مثال على الشكل المتوقع لمحة تمسخ الحراري (مأخوذة من بيانات الخميرة هيكسوكيناز). شكل سمة من البيانات الخام يظهر ارتفاعا تدريجيا في مضان إلى حد أقصى، يليه انخفاض الضحلة (مناقشتها بمزيد من التفصيل في 9). ويرافق هذا من ذروة واحدة في أول مشتق من مضان. (B) مثال لإدخال البيانات في Graphpad. يتم إعطاء تركيز يجند على المحور السيني، ويلاحظ ذوبان درجات الحرارة على المحور Y (C) مثال على تعريف المعادلة في Graphpad. (D) أمثلة على تحديد القيم الأولية من المتغيرات، وتحديد تركيز البروتين بشكل صحيح، لتمكين تحديد الصحيح ثابت التفكك.م / ملفات / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 2. تفاعل هيكسوكيناز مع الجلوكوز يقاس المسح التفاضلي fluorimetry (A) تجربة أولية اختبار مجموعة واسعة من تركيزات الجلوكوز تشير إلى أن K د من المرجح أن يكون في حدود 0.2 - 1.7 ملم (B) وتفصيلا التجربة، اختبار 16 تركيزات الجلوكوز، ويسمح تحديد K الواضح د و1.12 ± 0.05 ملم. البيانات يناسب بشكل جيد للغاية لنموذج لحدث ملزم واحد (مع الجزء السفلي (T1) وأعلى (T2) درجات الحرارة المناسب أن 35.4 ± 0.2 درجة مئوية و 49.3 ± 0.5 درجة مئوية على التوالي). لاحظ أنتم جمع هذه البيانات في وجود 10 ملم MgCl 2. تم إعداد هذه الصور باستخدام GraphPad. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. تفاعل مع WcbM GTP يكشف ملزمة مكافحة التعاونية. (أ) التجربة الأولي اختبار مجموعة واسعة من تركيزات GTP تشير إلى أن K د من المرجح أن يكون في حدود 200 - 500 ميكرومتر (B) تجربة مفصلة، واختبار 16 تركيزات GTP، يشير إلى وجود قيمة للظاهر د K من 120 ± 20 ميكرومتر. ومع ذلك، عند استخدام مقياس لوغاريتمي لمحور س، هناك discre كبيرpancy بين النموذج والبيانات. (C) تحليل البيانات نفسها مع النموذج التعاوني يظهر مناسبة ممتازة للبيانات حيث يتم استخدام النموذج التعاوني بسيط. هنا، K ½ 230 ± 20 ميكرومتر تم تحديدها، مع معامل cooperativity ن = 0.52 ± 0.02 (مع الجزء السفلي (T1) وأعلى (T2) درجات الحرارة المناسب ل69.63 ± 0.06 درجة مئوية و 79.9 ± 0.1 درجة مئوية على التوالي). كما WcbM يبدو أن مثنوي، وهذا يعني أن الإنزيم تماما في anticooperative لها صفة الإلزام للGTP. تم إعداد هذه الصور باستخدام GraphPad. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. WcbI يظهر نمط ذوبان ثنائي الطورفي وجود لها يجند أنزيم (لجنة الزراعة). (A) WcbI، في غياب يجند (الأزرق)، ويظهر نمط بسيط ذوبان الطور. بتركيزات عالية يجند (1 مم؛ الخط الأخضر)، لوحظ نمط مماثل. ومع ذلك، بتركيزات يجند وسيطة. (60 ميكرومتر؛ خط أحمر)، واثنين من قمم ذوبان متميزة، المقابلة لدول خالية من يجند ومحددة يجند لوحظ (B) الانتقال بين مجموعتين من قمم هو عبر كامل مرتبط بالجرعة مجموعة من تركيزات (C) نمذجة ذوبان ثنائي الطور في شكل مبلغ من نسبة من النتائج يجند يجند حرة وعالية يعطي مناسبا للبيانات (الخط الأرجواني متقطع، مقارنة مع خط أحمر). تم تحسين هذا يصلح عن طريق استقراء نتيجة لوحظ تركيز يجند عالية (حيث يشير النموذج ~ الإشغال 95٪) إلى الإشغال الكامل (الخط الأزرق متقطع). (D) البيانات التي تم الحصول عليها عن نسبة WcbI ملزمة لجنة الزراعة SHO WS نوبة ممتازة لنموذج ملزم بسيط، مع د K من 58 ± 2 ميكرومتر (وتمثل هذه البيانات البيانات التي تم جمعها على يومين منفصلين، مع تركيزات مختلفة قليلا يجند المختار لليوم الثاني على أساس أول مجموعة من النتائج). وحات. (A - C) تم إعدادها باستخدام إكسل، ولوحة (D) باستخدام Graphpad الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. وصفة للتجارب الأولية.
| كاشف | حجم في مزيج (ميكرولتر) |
| البروتين | إلى تركيز النهائي من 0.11 ملغ / مل |
| 0.3 | |
| 0.5 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.0 | 3.7 |
| 5 M كلوريد الصوديوم | 5.6 |
| المياه | ل180 ميكرولتر |
هذا يصف "مزيج الرئيسي" من البروتين، والكشف عن كاشف والعازلة للتجربة الكشفية الأولية لتقديم تقدير K د، كما هو موضح في القسم بروتوكول 1. هذا الخليط عازلة مناسبة للبروتينات عامة. حيث تشير النتائج السابقة ينبغي أن تستخدم مخازن أخرى، ينبغي استبدال هذه. إذا كانت الأوراق المالية البروتين بتركيز منخفض (أي أقل من 0.3 ملغ / مل)، فإنه قد يكون من الضروري تقليل كمية عازلة إضافية تضاف إلى تعويض عازلة موجودة بالفعل في العينة البروتين.
| كاشف | حجم في مزيج (ميكرولتر) |
| البروتين | إلى تركيز النهائي من 0.11 ملغ / مل |
| 5،000X SYPRO أورانج | 1.78 |
| 0.5 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.0 | 22.2 |
| 5 M كلوريد الصوديوم | 33.3 |
| المياه | ل180 ميكرولتر |
هذا يصف "مزيج الرئيسي" من البروتين، والكشف عن كاشف، وبuffer لتقرير الكامل من د K لعينة من البروتين، كما هو موضح في القسم بروتوكول 2. هذا الخليط عازلة مناسبة للبروتينات عامة. حيث تشير النتائج السابقة ينبغي أن تستخدم مخازن أخرى، ينبغي استبدال هذه. إذا كانت الأوراق المالية البروتين بتركيز منخفض (أي أقل من 0.3 ملغ / مل)، فإنه قد يكون من الضروري تقليل كمية عازلة إضافية تضاف إلى تعويض عازلة موجودة بالفعل في العينة البروتين.
الجدول 3. المعادلات والمعلمات لتحليل البيانات.
| خطوة في بروتوكول تجريبي | المعادلة المطلوبة | المعلمات المطلوبة | وصف المتغيرات والمعلمات |
| 3.3 | </ td> | ||
| موقع واحد يجند ملزمة | Y = القاع + ((من أعلى إلى أسفل) * (1 - ((PK د -X + الجذر التربيعي (((P + X + K د) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P: تركيز البروتين. دينار: التفكك المستمر. يتم إعطاء P دينار وبنفس الوحدات التي استخدمت لتركيزات يجند. أعلى، أسفل: درجات الحرارة وذوبان في تركيز يجند لا حصر له ولا تركيز يجند التوالي. | |
| 3.4 | القاع = * YMIN | YMIN: الحد الأدنى قيمة Y (أدنى البروتين التجريبي TM، في هذه الحالة) | |
| أعلى = * YMAX YMAX: القيمة القصوى للY (أعلى بروتين التجريبي تيم) | |||
| د = K * X في YMID | YMID: قيمة Y الذي يتوافق مع متوسط YMIN وYMAX. X هي القيمة المقابلة X (هنا، وتركيز يجند ذات الصلة) | ||
| P = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا) | |||
| 4.1 | |||
| النموذج التعاوني بسيط | Y = أسفل + ((من أعلى إلى أسفل) * (((X / دينار كويتي) ^ ن) / (1 + ((X / دينار كويتي) ^ ن)))) | ن: Hمعامل مريضا. هذا يصف cooperativity أو الخصائص الكيميائية الحيوية الأخرى، من البروتين، وليس بالضرورة تقدير لعدد من مواقع يجند الملزمة في البروتين. قال هيل معامل واحد لا يمثل cooperativity. قيم أقل من واحد تشير cooperativity السلبية، والقيم الإيجابية cooperativity أكبر من واحد. | |
| القاع = * YMIN | |||
| أعلى = * YMAX | |||
| د = K * X في YMID | |||
| P = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا ) | |||
| ن = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا) | |||
| متتابعة ملزمة اثنين من يغاندس | Y = القاع + ((من أعلى إلى أسفل) * ((X ^ 2) / (K * د K2)) / (1+ (X / K د) + ((X ^ 2) / (K * د K2))) ) | K2: التفكك المستمر لهذا الحدث ملزم الثاني. | |
| القاع = * YMIN | |||
| أعلى = * YMAX | |||
| DTH: 123px؛ "> K د في YMID = * X | |||
| K2 = * X في YMID | |||
| P = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا) | |||
| مستقلة ملزمة اثنين من يغاندس | Y = القاع + ((من أعلى إلى أسفل) * ((X ^ 2) / (K * د K2)) / (1+ (2 * X / K د) + ((X ^ 2) / (K د K2 *) ))) | ||
| القاع = * YMIN | |||
| ح: 123px؛ "> الأعلى = * YMAX | |||
| د = K * X في YMID | |||
| K2 = * X في YMID | |||
| P = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا) | |||
| 5.5 | |||
| تحليل التحولات ثنائية في درجة حرارة انصهار | Y = 1 - ((PK د -X + الجذر التربيعي (((P + X + K د) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px؛ ">||
| القاع = * YMIN | |||
| أعلى = * YMAX | |||
| د = K * X في YMID | |||
| P = (القيمة الأولية، أن يكون لائقا) | |||
| 5.8 | |||
| استقراء لتركيز يجند لانهائي | (C2 - ((1- $ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: الخلية التي تحتوي على النتيجة مع أي يجند. C2: الخلية التي تحتوي على النتيجة مع أقصى يجند. $ R $ 2: الخلية التي تحتوي على نسبة الالتزام في أقصى تركيز يجند. |
الخطوات 3 و 4 و 5 تتطلب إضافة المعادلات مفصلة في برامج التحليل، وتعريف دقيق لبدء المعلمات لتحليل البيانات. وترد معادلات لكل خطوة ذات الصلة، مع التحديدات الصحيحة من المعلمات. وتقدم تفسيرا لمعنى المتغيرات والمعلمات كمرجع.
الجدول 4. تركيزات لفحص تفاعل هيكسوكيناز مع الجلوكوز.
| نقطة عينة | يجند (glucosه) التركيز (ملم) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0.005 |
| 4 | 0.01 |
| 5 | 0.03 |
| 6 | 0.1 |
| 7 | 0.3 |
| 8 | 0.4 |
| 9 | 0.7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
تمت إضافة هيكسوكيناز من مهدها خميرة الخباز إلى مزيج الرئيسي كما هو موضح في البروتوكول، على أن تستكمل مع 10 ملم MgCl 2 والمغنيسيوم هو العامل المساعد المعروفة. كان التقدير الأولي للK د بين 0.5 و 2 مم. أقيمت التجارب لتوفير تركيزات النهائية المشار إليها من الجلوكوز.
الجدول 5. تركيزات لفحص تفاعل WcbM مع الناتج المحلي الإجمالي.
| نقطة عينة | يجند (GTP) تركيز (ميكرومتر) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8PX؛ "> 500|
| 11 | 1،000 |
| 12 | 2،500 |
| 13 | 5،000 |
| 14 | 7،500 |
| 15 | 10،000 |
| 16 | 20،000 |
تمت إضافة WcbM من بيركولديريا الراعومية إلى مزيج الرئيسي كما هو موضح في البروتوكول. كان التقدير الأولي للK د حوالي 100 ميكرومتر. أقيمت التجارب لتوفير تركيزات النهائية المشار إليها من GTP، وتهدف لتغطية اثنين على الأقل من حيث الحجم فوق وتحت K د.
Discussion
وقد أثبت المسح التفاضلي fluorimetry قوتها كوسيلة قوية وتنوعا لوصف البروتينات، وتحديد البروتين بروابط المحتملة. جعلت من وسيلة جذابة لفرز أولي من المركبات النجاحات موثقة جيدا في التعجيل استقرار البروتين، واكتشاف الأدوية (خصوصا في المختبرات أقل ممولة جيدا) وتبلور 10،23-25. مركبات تضاف إلى البروتينات تظهر جرعة زيادة واضحة تعتمد في الظاهر درجة حرارة انصهار 7،9. ومع ذلك، كانت هناك بعض المحاولات لاستخدام نتائج هذه التجارب لتحديد ثوابت ملزمة واضحة للمساعدة في ترتيب المركبات للتقارب بهم. هنا، نقدم طريقة لتحديد منهجية ثابتة والتفكك الظاهر للبروتينات في وجود يجند.
توضح النتائج المعروضة هنا أن مهرجان دبي للتسوق يمكن أن بسرعة وبقوة تقديم تقديرات ثابت التفكك لمزيج من البروتين يجند. يمكن التلاعب البيانات لاحظ مع الأدوات المتاحة تجاريا لتقديم تقرير سريع للK د، دون الحاجة إلى وضع افتراضات بشأن القيمة المحتملة من المعلمات. طريقة ديه ميزة كبيرة على بعض أساليب مماثلة من كونه شديد البخل في كل من البروتين والوقت المطلوب. فإن التجربة الموصوفة هنا تستهلك 0.13 ملغ من البروتين لكل تجربة (تقريبا 0.4 ملغم للتجارب المتكررة في ثلاث نسخ). هذا يقارن ايجابيا مع الكالوري المعايرة متساوي الحرارة (ITC)، حيث تجربة واحدة بمتوسط 40 كيلو دالتون البروتين سوف تستهلك كمية مماثلة. ان مجموعة كاملة من التجارب المطلوبة لهذا البروتوكول تستهلك حوالي 4 ساعة، بما في ذلك إعداد، لمجموعة واحدة من التجارب. مرة أخرى، هذا من المرجح أن يكون أسرع بكثير من الطرق مثل ITC أو مأكل سطح الرنين، والتي غالبا ما تتطلب قوة في حين الأمثل كبيرا لتحقيق أفضل البيانات.
وتظهر نتائجنا أنه ما زال هناك شرط أن تدرس بعناية البيانات الخام، وتناسب هذه البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار، ونوبة من البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار ثابت التفكك. والتحدي الأول هو شكل من البيانات الخام المنتجة في ذوبان البروتين. في بعض الحالات، قد لا الشكل التقريبي لتلك التي لوحظت في الشكل 1A. وتشمل القضايا المشتركة نوبات انخفاض درجة الحرارة على يجند ملزمة، وارتفاع مضان الخلفية، والتحولات متعددة غير عادية في درجات الحرارة. وينظر إلى التحولات على درجة حرارة منخفضة ملزمة عددا من يغاندس. لهذا الأسلوب، المعلمة الأكثر أهمية هو الخطأ في قياس T م، مقارنة مع التحول في درجة الحرارة. يمكن عادة البيانات تركيبها بشكل معقول عندما يكون الانحراف المعياري للقياسات ثلاث نسخ لا تتجاوز 10٪ من التحول درجة حرارة انصهار بين البروتين غير منضم والمربوطة بالكامل. تجربتنا هو أن مثل هذه حيث درجة الحرارةالتحولات erature هي فقط 2 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يكون كافيا لتركيب البيانات، إذا كانت نقاط البيانات الفردية هي دقيقة للغاية. يتشكل المسألة الثانية غير عادي المنحنيات. هذه غالبا ما تختلف بين الحرة وأشكال البروتين يجند ملزمة، كما يجند ملزم يؤثر تتكشف وسائط من البروتين. في هذه الحالات، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كانت البيانات يمكن استخدامها مع الاعتبار المناسب من النماذج التي ستستخدم لتحديد درجة حرارة انصهار وثابت التفكك. قضية مشتركة أخرى هي أن إضافة العامل المساعد للبروتين (على سبيل المثال، MgCl 2 في مثالنا مع هيكسوكيناز) مطلوب للحصول على البيانات الأكثر موثوقية. كانت تجربتنا أن دراسة متأنية لجميع العوامل المحتملة في التجربة في مرحلة أخذ القراءات الأولية لا بد من الحصول على أفضل النتائج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن العلاجات البديلة النظرية تكشف عن ملامح هذه البيانات 15،17. وأخيرا، فإنه ليس من غير المألوف بالنسبة لبعض البروتينات التي جontain أصلا تتعرض المناطق مسعور لإظهار عالية مضان الخلفية. هناك عدد من الحلول لهذه المشاكل، والتي تم استعراضها على نطاق واسع في أماكن أخرى 6،9.
على وجه الخصوص، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كان استخدام بولتزمان أو النماذج المشتقة (مثل الشكل 4)، وفي حالة استخدام المشتقات، سواء يذوب متعددة يجب أن تكون على غرار. طريقتين للنمذجة الحرارية التي تتكشف تختلف في أن طريقة بولتزمان يناسب البيانات التجريبية للمعادلة بولتزمان، على افتراض شكل السيني منتظم لمنحنى تتكشف. في المقابل، فإن طريقة المشتقة يأخذ أول مشتق من البيانات التجريبية عند كل نقطة (اللوحة السفلى في الشكل 1A)، وتعتبر درجة حرارة انصهار لتكون وجهة الأعلى أولا مشتق. طريقة المشتقة يعود عموما درجة حرارة انصهار أعلى بنحو 2 - 3 درجات مئوية. فإن معظم البروتينات بإرجاع أكثر اتساقانتيجة (أي الخطأ المعياري لدرجة حرارة انصهار للتجارب ثلاث نسخ أقل) في واحدة من طريقتين. هذا هو عادة ترتبط ارتباطا وثيقا الشكل الدقيق للبروتين تتكشف منحنى، وأنه من الضروري لتحديد أفضل طريقة تجريبيا في كل حالة. حيث يتم استخدام نموذج مشتق، من المهم أيضا النظر إلى الأحداث ذوبان متعددة. تظهر بعض البيانات بوضوح الأدلة على التحولات متعددة، وفي هذه الحالات نتائج من المحتمل أن يكون من الأسهل لتفسير إذا غرار هذه الأحداث ذوبان متعددة. في سياق هذا البروتوكول، هو حالة أن إضافة يجند يمكن أن يسبب البروتين ليتحول من وجود التحولات ذوبان متعددة لانتقال واحد (على سبيل المثال، عن طريق تثبيت فرعي الأكثر هشاشة حراريا)، أو العكس في كثير من الأحيان. ولذلك فإننا ندعو إلى أن البيانات الأولية يتم فحص معا قبل النظر في النهج الذي سوف يكون من الأفضل للاستخدام.
بعد مodelling من درجات الحرارة وذوبان الفردية، يمكن أن تنشأ المزيد من القضايا في ملاءمتها مع النماذج المعروضة في قسم البروتوكول. لا بد أن تدرس بعناية صالح إلى التفكك معادلة ثابتة باستخدام مقياس لوغاريتمي، وهذا التحليل غالبا ما يبرز تناقضات بين البيانات احظ ونموذج (ه .G.، الشكل 3). في حين أن النتائج التي تم الحصول عليها هي قوية بشكل عام والرعاية في التفسير يتيح الفرصة لاستخلاص أفضل النتائج، والأكثر معنى، من البيانات.
وهناك قضية معينة تثيرها هذه البيانات هو التفسير الذي ينبغي أن توضع على البروتينات التي تظهر cooperativity، أو الأحداث ملزمة متعددة، في مهرجان دبي للتسوق. قمنا حتى الآن، لاحظ فقط هذه الظاهرة في البروتينات التي من المتوقع أن يكون لديك عدة أحداث ملزمة محددة (على سبيل المثال، WcbM، وهو بروتين الذي هو متعدد القسيمات 26 نديد أفضل، والذي يعمل بمثابة متعدد القسيمات على استبعاد حجم اللوني [البيانات لاأظهرت]). فإنه ليس من الواضح على الإطلاق أن cooperativity السلبية التي لوحظت في مهرجان دبي للتسوق تمسخ إلى أن إنزيم سوف تظهر في نهاية المطاف cooperativity سلبية: بدلا من ذلك، وهذا قد يكون مؤشرا ملزمة مجمع التي يجب استكشافها أكثر شمولا باستخدام مجموعة واسعة من الأساليب. هذا لا يوحي لنا، مع ذلك، أن دراسات أوسع لهذه البروتينات من المحتمل أن تحديد تأثيرات مثيرة للاهتمام.
القيم المعطاة للثابت التفكك باستخدام هذه الطريقة عادة ما تكون من نفس النظام وتلك التي توفرها أساليب أخرى، مثل قياس الكالوري المعايرة متساوي الحرارة ومأكل سطح الرنين. ومع ذلك، فإن القيم المطلقة لوحظ أعلى كثيرا مما لوحظ استخدام هذه الأساليب. هذا هو على الأقل جزئيا نتيجة لحقيقة أن لوحظ ثابت التفكك في درجة حرارة انصهار من البروتين مع يجند. هذا K د عموما أعلى من ذلك في درجات حرارة الفسيولوجية. وdissociatioن الثابت هي ذات الصلة إلى درجة حرارة رد فعل من جانب المعادلات:
[1]
[2]
(حيث c θ هو تركيز المرجعية القياسية، Δ ص G هو التغيير طاقة جيبس الحرة للتفاعل، R هو ثابت الغاز المولي، Δ H هو التغير في المحتوى الحراري للتفاعل، وΔ S هو التغيير الكون في رد فعل .)
سوف ردود الفعل مع ثوابت التفكك في نطاق قياس هذه الطريقة عادة يكون سلبي Δ ص G، وبالتالي فإن تأثير زيادة في درجة الحرارة على المعادلة [1] سيكون لزيادة التفكك المستمر. كل من Δ H Δ S والمصطلحات التي تشكل الطاقة الحرة جيبس (المعادلة [2]) ودرجة حرارةسوف يعتمد 27 ه، والتأثير على ثابت التفكك تعتمد على حجم وعلامة من هذه التبعيات درجة الحرارة، وسيكون بالضرورة إحداث تفاعل بين الجسيمات التابع. وبالتالي، فإنه ليس من غير المتوقع أن ثوابت التفكك تحددها هذه الطريقة هي أكبر أحيانا من تلك التي يحددها الأساليب التي تعمل على RT. درجة حرارة الاعتماد هو، بطبيعة الحال، أيضا التحذير من طرق أخرى كثيرة، والتي تميل إلى توفير ثابت التفكك في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الفسيولوجية.
تحذير آخر من طريقة مهرجان دبي للتسوق هو أنه وسيلة المسمى، خلافا ITC. التسمية الفلورسنت المستخدمة (SYPRO البرتقال) هي مسعور، وحتى في بعض الحالات يمكن أن تتنافس مع ربط بروابط مسعور إلى البروتينات. وبالتالي، فمن المرجح أنه في بعض الحالات، ثابت التفكك الحصول عليها سيتم رفع مصطنع بسبب المنافسة مع التسمية. ومع ذلك، لمقارنة بروابط متنوعة، (الاستخدام الرئيسي للDSF)، من غير المرجح أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية للتأثير على الترتيب من المركبات التي تقارب الاختلافات.
والعيب المحتمل لهذا الأسلوب هو الحد من الكشف الذي يمكن تحقيقه. من حيث المبدأ، فإنه لا ينبغي أن يكون من الممكن قياس بدقة قيمة K د أن أقل من 50٪ من تركيز البروتين، وحتى القيم في هذا النطاق من المحتمل أن تكون ذات دقة مشكوك فيها. في حين أن الحد من الكشف في نهاية هذا النطاق يمكن تمديدها قليلا عن طريق خفض تركيزات البروتين وصبغ، فإن حساسية الصك منع مزيد من الانخفاض في تركيز البروتين. وبالمثل، سيتم تحديد نهاية العلوي من حساسية من قبل ذوبان يجند. للحصول على تقدير قوي رياضيا لK د، ومن المهم للغاية للحصول على البيانات مع 90٪ من البروتين موجودة في شكل محدد يجند، الأمر الذي يتطلب تركيز يجند أن تكون تقريبيةلاي عشر مرات K د (بافتراض عدم cooperativity). وبالتالي فإن الحد من الكشف بالضرورة عشر ذوبان يجند في المخزن المؤقت ذات الصلة. هذا يعني أن حدود الكشف عن الطريقة سوف تتراوح عادة بين 1 ميكرومتر وبين 1 و 100 ملم، اعتمادا على البروتين ويجند.
في الختام، المسح التفاضلي fluorimetry هي تقنية متعددة الاستعمالات التي تنطبق على مجموعة واسعة من البروتينات. باستخدام الأساليب المعروضة هنا، فمن الممكن لتحديد بسرعة وبتكلفة زهيدة تقارب من البروتين للبروابط مختلفة. هذه لديها امكانات كبيرة لتطبيقها في تنقية البروتين والاستقرار، توضيح وظيفة أو خصوصية الانزيمات من metagenomes، واكتشاف المخدرات، وخاصة في المختبرات الصغيرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
