Abstract
Een breed scala aan werkwijzen zijn beschikbaar voor het bepalen van de dissociatieconstante tussen een eiwit en interactie kleine moleculen. De meeste van deze toegang tot gespecialiseerde apparatuur vereisen vaak een zekere mate van deskundigheid betrouwbare experimenten en effectief te analyseren. Differentiële scanning fluorimetrie (DSF) wordt steeds meer gebruikt als een robuuste methode voor de eerste screening van eiwitten voor interactie kleine moleculen, zowel voor het identificeren van fysiologische partners of voor hit ontdekking. Deze techniek heeft het voordeel dat het slechts een PCR machine voor kwantitatieve PCR, en dus geschikte instrumentatie is in de meeste organen vereist; een groot scala aan protocollen zijn reeds beschikbaar; en er sterke precedenten in de literatuur voor meerdere doeleinden van de werkwijze. Laatste werk voorgesteld verscheidene berekeningswijze dissociatieconstanten van DSF data, maar die mathematisch veeleisend. Hier, we demonstrate een werkwijze voor het schatten van dissociatieconstanten van een matige hoeveelheid DSF experimentele gegevens. Deze gegevens kunnen doorgaans worden verzameld en in een enkele dag geanalyseerd. We zien hoe verschillende modellen kunnen worden gebruikt om gegevens vanuit eenvoudige bindinggebeurtenissen past en wanneer coöperatieve binding of onafhankelijke bindingsplaatsen aanwezig zijn. Tenslotte geven we een voorbeeld van data-analyse in een geval waarin standaardmodellen niet gelden. Deze methoden worden geïllustreerd met gegevens die zijn verzameld op commercieel beschikbare controle-eiwitten, en twee eiwitten uit ons onderzoeksprogramma. Over het algemeen, onze methode biedt een eenvoudige manier voor onderzoekers om snel krijgen meer inzicht in eiwit-ligand interacties met behulp van DSF.
Introduction
Alle eiwitten binden, met verschillende affiniteiten, om een breed scala aan andere moleculen uit eenvoudige ionen met andere grote macromoleculen. In veel gevallen, eiwitten binden aan kleine moleculen partners als onderdeel van de normale functie (bijvoorbeeld een kinase binding aan ATP). Andere interacties kunnen los van functie, maar experimenteel zijn nuttig als hulpmiddelen (bijvoorbeeld kleine moleculen die eiwitten stabiliseren verbeteren kristallisatie succes of het behoud eiwitten in oplossing); terwijl kleine moleculen die binden aan actieve plaatsen en allosterische gebieden van eiwitten kunnen fungeren als remmers, enzovoort moduleren de activiteit van enzymen.
Er zijn diverse technieken die kunnen worden gebruikt om de affiniteit van eiwitten voor partner moleculen te bepalen. Isothermische titratie calorimetrie 1 wordt algemeen beschouwd als een "gouden standaard", omdat het rijke informatie over reacties is labelvrije en heeft beperkte kansen eenrtifacts van het experiment. Ondanks recente verbeteringen in de gevoeligheid van de instrumentatie en automatisering van experimentele set-up, is het nog steeds relatief duur qua eiwitbehoefte is hoogstens een lage tot middelgrote doorvoer en het best bij interacties met matige tot hoge affiniteiten (10 nM tot 100 uM K d) 2. Andere label-free methoden zoals oppervlakteplasmonresonantie of tweelaags interferometrie 3 aanbieding hoger doorzet, en de gevoeligheid hebben bereikt om kleinere moleculen zo laag als 100 Da detecteren. Echter, high throughput instrumenten voor deze methoden zijn relatief duur, alleen gerechtvaardigd indien er een continue doorstroming van relevante projecten zal zijn, en dus waarschijnlijk ontoegankelijk voor veel academische laboratoria.
Differentiële scanning fluorimetrie (DSF of thermofluor) werd eerst beschreven in 2001 4 als een werkwijze voor geneesmiddelenonderzoek. In deze method worden eiwitten geïncubeerd met een fluorescente kleurstof (aanvankelijk naftaleen-sulfonzuur kleurstoffen gebruikt), waarvan de fluorescentie na binding aan de hydrofobe gebieden van het eiwit verandert. De eiwit-kleurstof monster wordt vervolgens verwarmd en de fluorescentie gecontroleerd als de hitte stijgt. Het ontvouwen van het eiwit en blootstelling van hydrofobe delen van het eiwit, geeft aanleiding tot een karakteristiek patroon in de fluorescentie als een functie van de temperatuur (Figuur 1A). Het experiment kan worden uitgevoerd in kleine volumes bij commerciële kwantitatieve PCR instrument, en dus in een enkel experiment, kan een groot aantal monsters tegelijkertijd getest (gewoonlijk 48, 96 of 384 monsters, afhankelijk van het model instrument). Experimenten kan meestal worden uitgevoerd in ongeveer een uur, de mogelijkheid biedt high throughput analyse van de monsters 5.
Verdere verbeteringen in de methodologie hebben de goedkeuring van kleurstoffen gezien met betere spectrale eigenschappen 6,7 8,9. Het aantal toepassingen van de methode is uitgebreid, met een bijzondere aandacht voor de ontwikkeling optimale omstandigheden voor de bereiding en de opslag van eiwitten 10, en op het identificeren van potentiële bindende partners om te helpen kristallisatie 11. De relatief hoge doorvoersnelheid van de werkwijze relatief lage kosten in proteïne (-2 ug per reactie), en de toepasbaarheid te bestuderen zwak bindende moleculen heeft DSF erg waardevol hulpmiddel fragment based drug design, vooral in een academische context 12-14.
Ondanks de brede toepassing van DSF aan de studie eiwit-ligand interacties zijn enkele studies beschreven bepaling van dissociatieconstanten van deze studies. Echter, deze hebben de neiging om gedetailleerde vergelijkingen die het ontvouwen van het eiwit, met een aantal parameters die de schaarse gegevens of in sommige gevallen e moet voorzien producerenstimated 7,15-17. Deze methoden zijn van bijzonder belang in moeilijke gevallen, zoals strak bindende verbindingen, of eiwitten tonen van ongewone overgangen. Echter, voor veel laboratoria, deze gedetailleerde analyses zijn te omslachtig voor routinematig gebruik. Daarom alternatieve behandelingen voorgesteld voor verschillende scenario's en tonen hoe deze kan worden gebruikt om gegevens uit verschillende eiwit-ligand interacties passen. Onze werkwijze gebruikt StepOne qPCR instrument waarvoor maat gegevensanalyse software beschikbaar; Hoewel dit versnelt de data analyse kan resultaten van andere instrumenten worden verwerkt met eerder gepubliceerde werkwijzen 9 en dezelfde downstream analyse kan worden uitgevoerd.
Protocol
1 Bepaling van een benaderende waarde voor de dissociatieconstante (dwz binnen een orde van grootte)
- Bereid het mengsel in tabel 1.
- Bereid de voorraden van het ligand van de belangstelling op de hoogst beschikbare concentratie, en dan om zes decimale verdunningen van dit. Wanneer een geschatte Kd is bekend uit eerdere gegevens, gericht aan ten minste twee concentraties boven en onder de Kd hebben.
- Aliquot 18 ul van het mengsel in acht putjes in een qPCR plaat. Voeg 2 pi van oplosmiddel tot het eerste putje. Voeg 2 pi van elk lid van het ligand verdunningsreeks (stap 1.2) een goed elk van de zeven putjes.
- Plaats een qPCR afdichting over de plaat. Om een goede afdichting van de plaat, plaatst een handapplicator (zie tabel specifieke reagentia) in het midden van de plaat. Gladstrijken van de afdichting aan de ene kant, en herhaal aan de andere helft van dede plaat.
- Centrifugeer de plaat bij 500 xg gedurende twee minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Plaats de plaat in een StepOne qPCR instrument. Selecteer de optie "Melt curve ', de ROX filters, en kiezen voor de snelle helling snelheid (dit levert een 2 minuten pauze bij 25 ° C, gevolgd door een helling tot 99 ° C in 40 min, en dan een 2 minuten pauze). Voer een thermische denaturatie.
OPMERKING: Script-bestanden voor het uitvoeren van een run zijn online beschikbaar op http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Aan het einde van het instrument lopen, klik op de "Analyze" knop op het scherm. Sla het resultaat bestand.
- Open de Protein Thermal Shift software.
- Maak een nieuwe studie; in het tabblad eigenschappen, geef deze een naam, en in het tabblad Voorwaarden, detail van de liganden.
- Ga naar het tabblad Experiment Files, en importeer de opgeslagen resultaten bestand (XXX.eds), en zet de inhoud van elk putje (template files zijn verkrijgbaar bij de auteurs).
- Ga naar het tabblad Analyse, en druk op de knop "Analyseren".
OPMERKING: Dit zal de resultaten te analyseren. Het is mogelijk om de resultaten van verder onderzoek met Excel via het tabblad Export exporteren. De resultaten worden uitgevoerd in een tab afgebakend formaat. Het beste is om het geëxporteerde bestand in Excel te openen en direct op te slaan in Excel-formaat.
- Controleer dat het eiwit in aanwezigheid van alleen oplosmiddel tot een resultaat soortgelijk aan die getoond in figuur 1A. Vervolgens onderzoekt de smelttemperatuur waargenomen in de resultaten in het "repliceren" venster. Zorg ervoor dat dit toont een duidelijke verhoging van de smelttemperatuur met toenemende concentratie ligand.
OPMERKING: Idealiter zal een duidelijk maximum smelttemperatuur (aangenomen dat het eiwit volledig ligand gebonden) en een geschatte Kd verstrekken indien de smelttemperatuur ligt halverwege tussen de ligand-vrij proteïne enhet maximum.
2 experimentele opstelling voor het bepalen van de dissociatieconstante
- Bereid het mengsel in tabel 2 als een master mix.
- Bereid voorraden van de ligand vijftien verschillende concentraties, die wordt verdund tienvoudig in het laatste experiment. Idealiter bevatten concentraties ten minste twee orden van grootte boven en onder de geschatte Kd en centreren de concentraties op de geschatte Kd. Focus op zeven van de punten in een orde van grootte van de geschatte Kd, met nog vier punten aan weerszijden van; als er een keuze bevatten meer punten waarden verzadigen.
OPMERKING: Indien nodig is het mogelijk om de experimentele condities zodanig dat het ligand van bestanden in twee experimentele concentratie, waarbij ligand oplosbaarheid beperkend veranderen. - Voeg 120 ul van de masterMeng acht putjes in een U-bodem plaat met 96 putjes, om als een reservoir voor gemakkelijke afgifte van de master mix. Gebruik een 8 kanaals pipet tot 18 pi afzien in een kolom van een PCR-plaat. Herhaal met vijf kolommen, in totaal 48 gevulde putjes geven in een 6 x 8 patroon op de plaat.
- Voeg 20 ul van de ligand bestanden of het oplosmiddel afzonderlijke putjes in een U-bodem plaat met 96 putjes. Met een 8 kanaals pipet aspiratie 2 ui acht verschillende ligand bestanden (of oplosmiddel). Voeg deze aan een kolom van de PCR-plaat, dat was gevuld met master mix in stap 2.3. Herhaal dit met dezelfde acht ligand / oplosmiddel voorraden voor twee extra kolommen. Zuig 2 ui van de resterende acht ligand of oplosmiddel bestanden en voeg deze een vierde kolom van de plaat. Herhaal dit voor de twee andere kolommen. Dit drievoudige monsters geven voor alle 16 ligand en oplosmiddel monsters.
- Plaats een qPCR afdichting over de plaat (zie stap 1.4).
- Centrifugeer de plaat bij 500 xg gedurendetwee min.
- Plaats de plaat in de qPCR instrument. Voer een thermische denaturatie met behulp van de parameters die zijn opgegeven in stap 1.6.
- Aan het einde van het instrument lopen, klik op de "Analyze" knop op het scherm. Sla het resultaat bestand.
- Open de Protein Thermal Shift software. Maak een nieuwe studie; in het tabblad eigenschappen, geef deze een naam, en in het tabblad Voorwaarden, detail van de liganden.
- Ga naar het tabblad Experiment Files, en importeer de opgeslagen resultaten bestand (XXX.eds), en zet de inhoud van elk putje.
OPMERKING: template bestanden zijn online beschikbaar op http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - Ga naar het tabblad Analyse, en druk op de knop "Analyseren".
- Kies het tabblad "repliceert" uit het menu aan de linkerkant van het scherm om de resultaten als triplicaten tonen. Beoordelen van de betrouwbaarheid van de gegevens op basis van hoe strak de triplo zijn. Should de triplo slechte reproduceerbaarheid, nauw onderzoekt de ruwe data.
- Analyseer de gegevens zowel met de Boltzmann of derivaat methoden om de smelttemperatuur beoordelen. Selecteer de "resultaten repliceren" tab, en in de "Repliceer resultaten plot", schakelt de "Plot door:" knop tussen "Tm - Boltzmann" en "Tm - Afgeleide". Kies de methode die het grotere reproduceerbaarheid van het monster geeft. De resultaten voor verder onderzoek met Excel via het tabblad Export exporteren.
OPMERKING: Voor monsters die meerdere overgangen vertonen, is het bijna altijd het beste om de Afgeleide methode in meerdere smelt-modus te gebruiken. De resultaten worden uitgevoerd in een tab afgebakend formaat. Het beste is om het geëxporteerde bestand in Excel te openen en direct op te slaan in Excel-formaat. - Herhaal het experiment ten minste tweemaal, met een herhaling op een afzonderlijke dag reproduceerbaarheid van de resultaten. Moet data-analyse (zie stap 3 hieronder)geven aan dat de waarde van Kd aanzienlijk verschillen van de oorspronkelijke raming weg ligand concentraties daarvan (zie stap 2.2) op een ruime waarden ongeveer Kd waarborgen.
3 Data Analysis aan de Dissociation Bepaal Constant onder Thermal Denaturatie
- Een tabel in Excel van de ligand concentraties en smelttemperatuur.
- Open de GraphPad Prism software, en maak een XY tafel. Voer de gegevens via de kolom X voor de ligand concentraties en de kolom Y smelttemperatuur resultaten.
OPMERKING: Een voorbeeld toont figuur 1B. Een script met vergelijkingen voorgeladen, en alternatieve instructies voor het gebruik van de SPSS statistische pakket, zijn online beschikbaar op http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular. - In het tabblad Analyse selecteert u de optie om te analyseren parameter veranderens (Ctrl + T). Om het juiste model in te voeren, selecteert u "Nieuw" en "Maak een nieuwe formule". Steek de vergelijking in tabel 3 als "Single website ligand binding".
OPMERKING: Een voorbeeld van deze stappen is weergegeven in figuur 1C. Bij het gebruik van het script met vergelijkingen voorgeladen, kunnen de relevante vergelijking worden gericht gekozen uit de lijst in plaats van ingevoerd. Afleiding van deze vergelijking is te vinden in een appendix. - Selecteer de "Regels voor Initial Waarden" en voer de regels voor de oorspronkelijke waarden zoals beschreven in tabel 3.
- Beperk de parameter P, als "Constant gelijk" en voert de uiteindelijke eiwitconcentratie (in dezelfde eenheden als de ligand in).
- Selecteer OK om de analyses uit te voeren.
OPMERKING: Een voorbeeld van deze stappen is weergegeven in figuur 1D. De grafische software produceert een figuur die de gegevens en de pasvorm van het model. Voorbeelden van teze analyses worden weergegeven in de representatieve gegevens.
4 Montage van gegevens aan Cooperative Modellen
Om gegevens aanpassen aan een coöperatief model, kiezen tussen een eenvoudige coöperatieve model, of een model waarbij twee afzonderlijke dissociatie constanten worden gedefinieerd. De eerste benadering de voorkeur in het geval van negatieve coöperativiteit of als een eerste onderzoek. In principe is het beter in geval van positieve coöperativiteit model twee verschillende dissociatieconstanten 18. In dit geval kunnen modelleren doorgaan, uitgaande van een sequentiële binding van liganden, of onafhankelijke binding van liganden.
- Volg dezelfde eerste stappen als in protocol 3 Echter, bij stap 3.3, plaatst u een van de vergelijkingen in tabel 3 vermeld als "Simple coöperatief model", "Sequential binding van twee liganden", of "Onafhankelijk binding van twee liganden" 18.
- Selecteer de relevante regels voor de beginwaardenaan ieder van deze vergelijkingen in tabel 3.
- Onderzoek de aanpassing van het model aan de data. Mochten de gegevens past slecht, overweeg een ander model.
NB: het is ook belangrijk om zorgvuldig de montage van de smelttemperatuur van de gegevens door de Protein Thermal Shift software (stap 2.9): soms is het nodig om de parameters te veranderen hier om de beste resultaten te krijgen. Een andere overweging is of het bereik van gegevenspunten is ideaal, en of er abnormale punten: ofwel een beperkte reeks gegevens aan weerszijden van Kd of een abnormale point (vooral bij de hoogste concentraties ligand), kunnen beïnvloeden de resultaten. - Herhaal het experiment ten minste tweemaal (zie stap 2.12) om reproduceerbaarheid te waarborgen.
5 Montage van gegevens naar Curves tonen Binary Verschuivingen in Melting Temperature
Soms, in plaats van geleidelijk op ligand, eiwitten zijnwaargenomen dat een binaire respons, waarbij gebonden monster duidelijk gescheiden van ongebonden monster vast. Een voorbeeld wordt gegeven in de representatieve resultaten (figuur 4). In dit geval het aanbrengen van de smelttemperatuur zal geen goede pasvorm voor K d.
- De ruwe data output van de Protein Thermal Shift-software te exporteren. Voor elke temperatuurmeting punt, berekent het gemiddelde fluorescentie van de nul ligand en hoogste ligand concentraties. Een tabel met de resultaten van elk gegevenspunt naast deze.
OPMERKING: De fout hier gemaakt is dan de fout in gemonteerde smelttemperaturen. - Open het SPSS statistisch pakket. Kopieer de temperaturen, de twee gemiddelde datasets, en gegevens voor elk experiment om een data-venster in SPSS. In het tabblad variabele, stel de gemiddelde dataset voor geen ligand als "laag", en de gemiddelde dataset voor de hoogste ligandconcentratie als "high".
- Download het syntax-bestand beschikbaaronline op http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Selecteer "Run → Run all".
- Kopieer de verhouding gebonden resultaten naar een nieuwe Excel-werkmap, met de relevante ligand concentraties.
- Open de Graphpad software, en het creëren van een XY tafel. Voer de gegevens via de kolom X voor de ligand concentraties en de kolom Y smelttemperatuur resultaten. In het tabblad analyse, selecteer "change analyse parameters". Om het juiste model in te voeren, selecteert u "Nieuw" en "Maak een nieuwe formule". Voer de vergelijking gegeven in tabel 3 vermeld als "analyse van binaire verschuivingen in smelttemperatuur".
- Selecteer het vakje "Regels voor Initiële waarden", en regels voor de oorspronkelijke waarden in tabel 3 in te voeren. Beperk de parameter P, zoals "Constant gelijk aan" en voer de uiteindelijke concentratie van het eiwit (in dezelfde eenheden als de ligand wordt gegeven in).
OPMERKING: voorbeelden van het invullen van deze vakken voor het protocol in hoofdstuk 3 zijn weergegeven in figuur 1C, D. - Als er een goede pasvorm, kunnen de resultaten verbeterd worden door extrapolatie van het verwachte resultaat oneindige ligand concentratie. Uit het model van het percentage gebonden bij elke ligand concentratie, onderzoekt de waarde van de hoogste waarde van ligand concentratie. Als dit 0,99 of hoger, verder onderzoek waarschijnlijk resultaten te verbeteren.
- Als de hoeveelheid kleiner is dan 0,99, is een extra stap nodig te corrigeren voor het effect van de niet-gebonden eiwit in de hoogste concentratie ligand monster. In stap 5.2, schrijf de hoeveelheid ligand gebonden aan de hoogste ligand concentratiepunt (uit stap 5.7) in cel R2 (een andere cel kan worden gebruikt, en R2 vervangen passend in de vergelijking in tabel 3). Een extra kolom na het gemiddelde van de hoogste concentratie ligand resultaten. In de sparrenT-cel, kopieert u de formule in tabel 3 vermeld als "Extrapolatie naar ligandconcentratie oneindig". Kopieer de volgende formule om de resterende cellen in deze kolom.
NB: Deze berekening verwijdert het effect van niet-gebonden eiwit in de hoogste ligandconcentratie. Het verschil tussen de ligand vrij proteïne en de hoogste concentratie ligand wordt vermenigvuldigd met de reciproke van het percentage gebonden ligand bij de hoogste concentratie de verwachte verschil tussen volledig gebonden en ongebonden eiwit toestanden bij elke temperatuur onder verschaffen. Dit verschil wordt toegevoegd of afgetrokken van de ongebonden toestand het verwachte fluorescentie van volledig ligand gebonden eiwit geven. - Vervang de kolom voor maximale ligand concentratie in de SPSS datasheet met deze nieuwe kolom en herhaal de data fitting.
OPMERKING: De stappen van 5,7-5,9 moet mogelijk worden herhaald als het model suggereert een verdere significante verandering in het aandeel gebonden aan de maximale ligand concentrati(indien dit het geval is, zou het waarschijnlijk ideaal zijn om het experiment met een hogere ligand concentratiepunt herhalen en). - Wanneer het eiwit toont een binaire verschuiving en toont coöperatief gedrag, de vergelijking voorgesteld in stap 5.5 worden gesubstitueerd die uit stap 4.1. De "Top" en "Bottom" parameters moeten vervangen door respectievelijk 1 en 0.
- Herhaal het experiment ten minste tweemaal (zie stap 2.12) om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Representative Results
Een uitstekende test substraat voor deze methode is hexokinase. Dit heeft als voordeel dat het gemakkelijk commercieel verkrijgbaar en heeft twee substraten die worden gevonden in de meeste laboratoria en die duidelijke, reproduceerbare resultaten in de assay. Een beginconcentratie scherm (Protocol 1) met hexokinase en glucose (figuur 2A), suggereert dat de waarschijnlijke Kd zal in het traject 0,2-1,7 mM. Daarom is een groter scherm (protocol 2) werd uitgevoerd met de in Tabel 4 De resultaten (figuur 2B) concentraties vertonen een goede aansluiting op de enkele plaats ligandbindende vergelijking (Protocol sectie 3.3) [9], en gaf een K d 1,2 ± 0,1 mM.
De vermeende heptose-guanyl transferase WcbM 19,20 vertoont een sterke thermische verschuiving op binding aan GTP (Figuur 3A). Een eerste scherm gesuggereerd dat de Kd zou in het bereik van ongeveer 100 uM. Daarom werd een volledig scherm opstelling, met de in tabel 5 concentraties Montage van de resultaten van vergelijking 3.3 toonde een redelijk fit (R2 van 0,981 Figuur 3B). .Echter Is er een duidelijk verschil tussen de data en de model suggereert dat een ander vergelijking nodig. Zoeken van de Protein Databank 21 met WcbM sequentie bleek dat het dichtst homologen waarvoor structuren zijn bepaald formulier dimeren. De gegevens zijn dus geanalyseerd met behulp van de drie vergelijkingen voor coöperatie, sequentiële, en onafhankelijk van de binding van twee liganden (Protocol 4). De montage statistieken voor een coöperatief model gaf een R2 waarde van 0.998 en de standaarddeviatie van de residuen (Sy.x) van 0.215, terwijl zowel sequentiële en onafhankelijke bindende modellen gaf een R2 waarde van 0,992 en een Sy.x van 0,480 en 0,461 respectievelijk. Dit suggereert dat het modelhet geven van de beste pasvorm om de gegevens werd het coöperatieve model: hier, een K ½ van 230 ± 10 uM werd waargenomen, met een n-waarde van 0,52 ± 0,02 (Figuur 3C). Dit wees op een negatieve coöperativiteit om de binding. Merk op dat een ½ K werd in dit geval plaats Kd, omdat de eenheden voor Kd de eerder onbevredigend uM 0,52 zou zijn.
De vermeende BBP-6-deoxy-β-D-manno -heptopyranose 2-O -acetylase, WcbI 22, toont een nogal ongewone resultaat in differentiële scanning fluorimetrie. Bij afwezigheid van liganden, toont een duidelijk en eenvoudig denaturatie (Figuur 4A). Coenzym A (CoA) werd geïdentificeerd als een ligand van dit eiwit met DSF en de affiniteit van het eiwit voor deze partner werd onderzocht zoals beschreven in het protocol. In de aanwezigheid van hoge concentraties van CoA, een sterke shift een hogere temperatuur wordt waargenomen, met een verandering in de smelttemperatuur van 15 ° C. Echter, bij tussenliggende concentraties plaats van een verschuiving naar een monofasische smolt bij een tussenliggende smelttemperatuur, WcbI vertoonde een bifasisch smelten, met het eiwit lijkt te smelten ofwel de ligand-free temperatuur of de volledig gebonden smelttemperatuur (figuur 4A) . De verhoudingen van de twee soorten veranderd in een dosis afhankelijke wijze met toenemende substraatconcentraties het aandeel dat smolt bij hogere temperaturen (Figuur 4B). Directe analyse van deze gegevens was een uitdaging: het aanbrengen van de Boltzmann vergelijking gaf zeer slechte past, terwijl de afgeleide methoden naar voren dat twee smelten gebeurtenissen voorkwamen, maar niet te helpen bij het aantonen van een verandering met toenemende ligand concentratie.
Een minder conventionele aanpak van deze gegevens te analyseren werd daarom aangenomen (protocol 5). De fluorescentie derivative resultaten zonder ligand en bij de hoogste concentratie ligand werden als die in hoofdzaak alle eiwitten in de lagere smelttemperatuur, of de hogere smelttemperatuur staat. De overige afgeleide gegevens werden aangebracht op elk punt als de som van een deel van elk van deze twee staten, met het aandeel opgeteld tot eenheid (Figuur 4C). De verkregen gegevens werden vervolgens gemonteerd voor een schijnbare Kd verkrijgen met dezelfde vergelijkingen als voorheen. Dit benadrukt dat de "high" ligand punt wordt waarschijnlijk slechts 95% gebonden ligand. De gegevens werden vervolgens geëxtrapoleerd naar een voorspelling van het resultaat voor een 100% gebonden eiwit, en de data fitting herhaald om een schijnbare Kd van 58 ± 2 uM. Dit leverde een uitstekende pasvorm van de experimentele resultaten aan de bindende model (Figuur 4D).
fo: content-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Figuur 1 Voorbeelden van experiment set-up en de analyse. (A) Voorbeeld van de verwachte vorm van een thermische denaturatie profiel (uit data voor gist hexokinase). De karakteristieke vorm van de ruwe gegevens blijkt een progressieve toename in fluorescentie tot een maximum, gevolgd door een ondiepe afname (in meer detail in 9). Dit gaat gepaard met een enkele piek in de eerste afgeleide van de fluorescentie. (B) Voorbeeld van gegevensinvoer in Graphpad. Ligand concentratie wordt gegeven op de X-as en waargenomen smelttemperaturen op de Y-as. (C) Voorbeeld van vergelijking definitie in Graphpad. (D) Voorbeelden van correct instellen van de initiële waarden van de variabelen en de vaststelling van de eiwitconcentratie, correcte bepaling van de dissociatieconstante inschakelen.m / files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 2 Interactie van hexokinase met glucose gemeten door differentiële scanning fluorimetrie (A) een eerste experiment getest uiteenlopende glucoseconcentraties suggereert dat de Kd waarschijnlijk in het traject van 0,2 -. 1,7 mM (B) Een gedetailleerde experiment, het testen van 16 concentraties van glucose, maakt het bepalen van de schijnbare Kd als 1,12 ± 0,05 mm. De data past zeer goed bij het model voor een enkele binding evenement (met de bodem (T1) en top (T2) temperaturen montage op 35,4 ± 0,2 º C en respectievelijk 49,3 ± 0,5 ° C). Merk op datDeze gegevens werden verzameld in de aanwezigheid van 10 mM MgCl2. Deze beelden werden bereid met GraphPad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Interactie van WcbM met GTP onthult een anti-coöperatieve binding. (A) een eerste experiment getest uiteenlopende GTP concentraties suggereert dat de Kd waarschijnlijk in het traject van 200 -. 500 uM (B) Een gedetailleerde experiment, testing 16 concentratie van GTP, stelt een waarde voor de schijnbare Kd van 120 ± 20 uM. Wanneer echter een logaritmische schaal wordt gebruikt voor de x-as, is er een significant discrepancy tussen model en data. (C) Analyse van dezelfde gegevens met een coöperatief model toont een uitstekende pasvorm voor de gegevens, indien een eenvoudige coöperatieve model gebruikt. Hier, een K ½ van 230 ± 20 uM werd bepaald, met de cooperativiteit coëfficiënt n = 0.52 ± 0.02 (met de bodem (T1) en top (T2) temperaturen montage op 69.63 ± 0.06 ° C en 79,9 ± 0,1 º C, respectievelijk). Zoals blijkt WcbM dimeer te zijn, betekent dit dat het enzym volledig anticooperative in haar binding aan GTP. Deze beelden werden bereid met GraphPad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 WcbI toont een bifasische melting patroonin aanwezigheid van de ligand coenzym A (CoA). (A) WcbI, in afwezigheid van ligand (blauw) weergegeven met een monofasische smeltpatroon. Bij hoge concentraties ligand (1 mM; groene lijn), wordt een vergelijkbaar patroon waargenomen. Echter, bij tussenliggende ligand concentraties. (60 uM; rode lijn), twee afzonderlijke smeltpieken, overeenkomend met ligand-vrij en gebonden ligand toestanden ontstaan (B) De overgang tussen de twee pieken is dosisafhankelijk over de volle concentratiebereik. (C) Modellering van de tweefasige smelten als een som van een deel van de vrije ligand en vrij ligand resultaat geeft een goede aansluiting op de data (onderbroken paarse lijn tegenover rode lijn). Deze pasvorm is verbeterd door extrapolatie van de waargenomen voor hoge ligand concentratie (waar het model suggereert ~ 95% bezetting) tot volledige bezetting (gestippelde blauwe lijn) resultaat. (D) De verkregen voor het aandeel van WcbI gebonden aan CoA sho gegevens ws uitstekend geschikt om een eenvoudige binding model, met een Kd van 58 ± 2 pM (deze gegevens stellen gegevens verzameld over twee dagen, met iets andere ligand concentraties gekozen voor de tweede dag op basis van de eerste set resultaten). Panelen. (A - C) werden bereid met behulp van Excel, en het paneel (D) met Graphpad Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1: Recept voor de eerste experimenten.
| Reagens | Volume in de mix (pl) |
| Eiwit | Om eindconcentratie van 0,11 mg / ml |
| 0,3 | |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 3.7 |
| 5 M NaCl | 5.6 |
| Water | Aan 180 pi |
Dit beschrijft de "master mix" van eiwitten, detectie reagens en buffer voor een eerste scouting experiment om een schatting van de K d te bieden, zoals beschreven in het protocol deel 1 Deze buffer mengsel is geschikt voor generieke eiwitten. Waar vorige resultaten suggereren andere buffers moeten worden gebruikt, moeten deze worden vervangen. Als het eiwit voorraad is bij een lage concentratie (bijvoorbeeld, minder dan 0,3 mg / ml), kan het nodig zijn de hoeveelheid extra buffer verminderen toegevoegd ter compensatie van buffer reeds in het eiwitmonster.
| Reagens | Volume in de mix (pl) |
| Eiwit | Om eindconcentratie van 0,11 mg / ml |
| 5,000x SYPRO Oranje | 1.78 |
| 0,5 M HEPES pH 7,0 | 22.2 |
| 5 M NaCl | 33.3 |
| Water | Aan 180 pi |
Dit beschrijft de "master mix" van eiwitten, detectie reagens, en bUffer voor een volledige bepaling van Kd voor een eiwit monster, zoals beschreven in hoofdstuk 2 Dit protocol buffer mengsel is geschikt voor generieke eiwitten. Waar vorige resultaten suggereren andere buffers moeten worden gebruikt, moeten deze worden vervangen. Als het eiwit voorraad is bij een lage concentratie (bijvoorbeeld, minder dan 0,3 mg / ml), kan het nodig zijn de hoeveelheid extra buffer verminderen toegevoegd ter compensatie van buffer reeds in het eiwitmonster.
Tabel 3 Vergelijkingen en parameters voor gegevensanalyse.
| Stap in de experimentele protocol | Vergelijking vereist | Parameters die nodig zijn | Beschrijving van variabelen en parameters |
| 3.3 | </ Td> | ||
| Enkele site ligandbindend | Y = Bottom + ((Boven-Onder) * (1 - ((PK d X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P )))) | P: eiwitconcentratie. Kd: dissociatieconstante. P en Kd worden in dezelfde eenheden die werden gebruikt voor de ligand concentraties. Top, Bottom: smelttemperatuur bij oneindige ligand concentratie en geen ligandconcentratie respectievelijk. | |
| 3.4 | Onder = * YMIN | YMIN: Minimum waarde van Y (laagste experimenteel eiwit Tm, in dit geval) | |
| Top = * YMAX YMAX: Maximale waarde van Y (hoogste experimentele eiwit Tm) | |||
| Kd = * X bij ymid | Ymid: waarde van Y, dat overeenkomt met het gemiddelde van YMIN en YMAX. X is de overeenkomstige X-waarde (hier de relevante ligand concentratie) | ||
| P = (beginwaarde, om fit te zijn) | |||
| 4.1 | |||
| Eenvoudige coöperatieve model | Y = Bodem + ((Boven-Onder) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n)))) | n: Hill coëfficiënt. Dit beschrijft de coöperativiteit of andere biochemische eigenschappen van het eiwit, en is niet noodzakelijkerwijs een schatting van het aantal ligand bindingsplaatsen in het eiwit. Een Hill-coëfficiënt van een staat geen cooperativiteit; waarden lager dan een aan te geven negatieve coöperativiteit en waarden groter dan een positieve coöperativiteit. | |
| Onder = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| Kd = * X bij ymid | |||
| P = (beginwaarde, om fit te zijn ) | |||
| n = (beginwaarde, om fit te zijn) | |||
| Sequentiële binding van twee liganden | Y = Bodem + ((Boven-Onder) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2))) ) | K2: dissociatieconstante voor de tweede bindingsgebeurtenis. | |
| Onder = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| DTH: 123px; "> K d = * X bij ymid | |||
| K2 = * X bij ymid | |||
| P = (beginwaarde, om fit te zijn) | |||
| Onafhankelijke binding van twee liganden | Y = Bodem + ((Boven-Onder) * ((X ^ 2) / (K d * K2)) / (1 + (2 * X / K d) + ((X ^ 2) / (K d * K2) ))) | ||
| Onder = * YMIN | |||
| h: 123px; "> Top = * YMAX | |||
| Kd = * X bij ymid | |||
| K2 = * X bij ymid | |||
| P = (beginwaarde, om fit te zijn) | |||
| 5.5 | |||
| Analyse van binaire verschuivingen in smelttemperatuur | Y = 1 - ((PK d X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P)) | 23px; ">||
| Onder = * YMIN | |||
| Top = * YMAX | |||
| Kd = * X bij ymid | |||
| P = (beginwaarde, om fit te zijn) | |||
| 5.8 | |||
| Extrapolatie naar oneindige ligandconcentratie | (C2 - ((1-$ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2 | B2: cel die het resultaat zonder ligand. C2: cel die het resultaat met maximale ligand. $ R $ 2: cel die de hoeveelheid gebonden ligand bij maximale concentratie. |
Stappen 3, 4 en 5 vereist de toevoeging gedetailleerde vergelijkingen in de analysesoftware en nauwkeurige bepalen van het beginpunt parameters voor gegevensanalyse. De vergelijkingen voor elke belangrijke fase worden getoond, met de juiste selectie van de parameters. Een uitleg van de betekenis van variabelen en parameters wordt gegeven ter referentie.
Tabel 4 Concentraties voor het screenen van interactie van hexokinase met glucose.
| Bemonsteringspunt | Ligand (glucose) concentratie (mM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.001 |
| 3 | 0.005 |
| 4 | 0.01 |
| 5 | 0.03 |
| 6 | 0,1 |
| 7 | 0,3 |
| 8 | 0,4 |
| 9 | 0,7 |
| 10 | 1.1 |
| 11 | 2.1 |
| 12 | 3.7 |
| 13 | 5.3 |
| 14 | 7 |
| 15 | 9 |
| 16 | 11 |
Hexokinase van de gist Saccharomyces cerevisiae werd toegevoegd aan het master mix zoals beschreven in het protocol, aangevuld met 10 mM MgCl2 magnesium is een bekende cofactor. De eerste schatting van de Kd was tussen 0,5 en 2 mm. Experimenten werden tot de vermelde eindconcentraties van glucose verschaffen.
Tabel 5: Concentraties voor screening van interactie van WcbM met het BBP.
| Bemonsteringspunt | Ligand (GTP) concentratie (uM) |
| 1 | 0 |
| 2 | 0.5 |
| 3 | 1 |
| 4 | 5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 25 |
| 7 | 50 |
| 8 | 100 |
| 9 | 250 |
| 10 | 8px; "> 500|
| 11 | 1.000 |
| 12 | 2.500 |
| 13 | 5.000 |
| 14 | 7.500 |
| 15 | 10.000 |
| 16 | 20.000 |
WcbM van Burkholderia pseudomallei werd toegevoegd aan de master mix zoals beschreven in het protocol. De eerste schatting van de Kd was ongeveer 100 uM. Experimenten werden ingesteld om de aangegeven eindconcentraties van GTP verschaffen, gericht op ten minste twee orden van grootte bestrijken boven en onder K d.
Discussion
Differentiële scanning fluorimetrie heeft zijn kracht bewezen als een robuuste en veelzijdige methode voor het karakteriseren van eiwitten, en het identificeren van potentiële eiwitliganden. De goed gedocumenteerde successen in bespoedigen eiwitstabilisatie, drug discovery (vooral in minder goed gefinancierde laboratoria) en kristallisatie 10,23-25 hebben het een aantrekkelijke methode voor de eerste screening van verbindingen gemaakt. Verbindingen toegevoegd aan eiwitten een duidelijke dosis-afhankelijke toename in de schijnbare smelttemperatuur 7,9. Er zijn echter weinig pogingen om de resultaten van deze experimenten tegen duidelijk bindingsconstanten op steun als verbindingen op hun affiniteit was bepaald. Hier presenteren we een werkwijze voor het systematisch bepalen van een schijnbare dissociatieconstante voor eiwitten in aanwezigheid van een ligand.
De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat DSF snel en stevig kunnen schattingen van de dissociatie constante vooreen eiwit-ligand combinatie. De waargenomen gegevens kunnen worden gemanipuleerd met commercieel beschikbare hulpmiddelen een snelle bepaling van Kd verschaffen, zonder aannames betreffende de waarschijnlijke waarde van parameters maken. De werkwijze heeft een belangrijk voordeel ten opzichte van een vergelijkbare methoden door spaarzaam in zowel eiwitten en doorlooptijd. De hier beschreven experiment verbruikt 0,13 mg eiwit per experiment (ongeveer 0,4 mg voor experimenten in drievoud herhaald). Dit steekt gunstig af bij isothermische titratie calorimetrie (ITC), waar een enkel experiment met een gemiddelde 40 kDa eiwit een vergelijkbaar bedrag verbruikt. De volledige reeks van experimenten die nodig zijn voor dit protocol zou rond 4 uur, inclusief voorbereiding verbruiken, voor een enkele set van experimenten. Nogmaals, dit is waarschijnlijk aanzienlijk sneller dan methoden zoals ITC of oppervlak plasmon resonantie, die, hoewel krachtige vereist vaak aanzienlijke optimalisatie beste data bereiken.
Onze resultaten tonen aan dat er nog een eis om de ruwe gegevens zorgvuldig onderzoeken, de pasvorm van deze gegevens aan de smelttemperatuur te bepalen, en de pasvorm van de smelttemperatuur gegevens aan de dissociatieconstante te bepalen. Een eerste probleem is de vorm van de ruwe data die in het eiwit smelten. In sommige gevallen kan de vorm niet nader aan dat van figuur 1A. Veelvoorkomende problemen zijn lage temperatuurveranderingen op ligandbinding, hoge achtergrond fluorescentie, en ongewone meerdere overgangen in temperatuur. Lage temperatuur verschuivingen worden gezien op binding een aantal liganden. Voor deze werkwijze de meest kritische parameter is de fout in de Tm meting vergeleken met de temperatuurverandering. De data kan gewoonlijk redelijk zijn gemonteerd bij de standaardafwijking van drievoudige metingen niet meer dan 10% van de smelttemperatuur verschuiving tussen gebonden en volledig gebonden eiwit. Onze ervaring is dat wanneer dergelijke temperatuur verschuivingen zijn slechts 2 ° C, dit kan voldoende zijn voor de montage van de gegevens, als de individuele gegevens punten zijn zeer nauwkeurig. Een tweede probleem is ongewoon gevormde rondingen. Deze vaak verschillend voor vrij proteïne en ligand gebonden vormen, zoals de ligand binding beïnvloedt ontvouwing vormen van het eiwit. In die gevallen moet de gebruiker nagaan of de gegevens kunnen worden gebruikt met de juiste behandeling van de modellen worden gebruikt om de smelttemperatuur en de dissociatieconstante. Een ander veel voorkomend probleem is dat toevoeging van een cofactor aan het eiwit (bijvoorbeeld MgCl2 in ons voorbeeld met hexokinase) is vereist om de meest betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze ervaring is dat een zorgvuldige afweging van alle mogelijke factoren in het experiment in het stadium van het nemen beginwaarden essentieel voor het verkrijgen van de beste resultaten. Bovendien kunnen alternatieve behandelingen theoretische eigenschappen van deze gegevens 15,17 onthullen. Tenslotte is het niet ongewoon voor sommige eiwitten die contain native hydrofobe gebieden blootgesteld aan hoge achtergrond fluorescentie vertonen. Er zijn een aantal oplossingen voor deze problemen, die uitvoerig elders 6,9 hebben beoordeeld.
In het bijzonder moet de gebruiker nagaan of de Boltzmann of derivaat modellen (bijvoorbeeld figuur 4) en bij gebruik van derivaten of meerdere smelten gemodelleerd moet worden gebruikt. De twee methoden van modelleren thermische ontvouwing verschillen dat de Boltzmann methode past bij de experimentele gegevens aan de Boltzmann vergelijking, uitgaande van bijvoorbeeld een sigmoïdale vorm van de curve ontvouwen. Daarentegen neemt de derivatenmethode de eerste afgeleide van de experimentele gegevens op elk punt (onderste paneel in figuur 1A), en beschouwt de smelttemperatuur tot het beginpunt aflopend derivaat. De afgeleide werkwijze retourneert algemeen een hogere smelttemperatuur van ongeveer 2-3 ° C. De meeste eiwitten zal terugkeren een meer consistenteresultaat (dat wil zeggen, de standaardfout van de smelttemperatuur van experimenten in drievoud lager) voor een van de twee methoden. Meestal is nauw verbonden met de precieze vorm van het eiwit ontvouwen curve en moet empirisch bepalen van de beste methode deelneemt. Wanneer de afgeleide model wordt gebruikt, is het ook belangrijk om te overwegen meerdere smelten events. Sommige gegevens duidelijk bewijs voor meerdere overgangen, en in deze gevallen de resultaten waarschijnlijk gemakkelijker te interpreteren wanneer deze meerdere smelten gebeurtenissen gemodelleerd. In het kader van dit protocol is het vaak het geval dat de toevoeging van ligand kan leiden tot een eiwit om van het hebben van meerdere smelten overgangen naar een overgang (bijvoorbeeld door het stabiliseren van de thermisch meest kwetsbare subdomein), of vice versa. We zouden dan ook pleiten dat de ruwe data samen alvorens te overwegen welke aanpak het beste te gebruiken zal worden onderzocht.
Naar aanleiding van de modelling van de individuele smelttemperatuur, kunnen verdere problemen ontstaan bij het aanbrengen van deze aan de in de sectie protocol modellen. Het is noodzakelijk om zorgvuldig de fit aan de dissociatie constante vergelijking met behulp van een logaritmische schaal, omdat deze analyse wijst vaak verschillen tussen de geobserveerde data en het model (e .g., Figuur 3). Terwijl de verkregen resultaten zijn algemeen robuust, zorg interpretatie biedt de mogelijkheid om betere resultaten te extraheren en de betekenis van de data.
Een specifieke vraag van deze gegevens is de interpretatie die op eiwitten die cooperativiteit tonen, of meerdere bindende gebeurtenissen moeten worden geplaatst, in DSF. We hebben tot nu toe alleen waargenomen dit verschijnsel in eiwitten die naar verwachting meerdere specifieke binding gebeurtenissen (bijvoorbeeld WcbM een proteïne waarvan best homoloog is een multimeer 26, en dient als een multimeer van grootte-uitsluitingschromatografie [gegevens nietgetoond]). Het is helemaal niet duidelijk dat de negatieve cooperativiteit waargenomen in DSF denaturatie geeft aan dat het enzym uiteindelijk zal blijken negatieve cooperativiteit: plaats, dit kan een indicatie zijn van complexe binding die grondiger moeten worden onderzocht met behulp van een breder scala aan methoden. Dit suggereert ons echter dat meer uitgebreide studies van dergelijke eiwitten waarschijnlijk interessante effecten te identificeren.
De waarden voor de dissociatieconstante deze methode algemeen van dezelfde orde als die van andere methoden, zoals isothermische titratie calorimetrie en oppervlakte plasmon resonantie. De absolute waarden liggen vaak hoger dan waargenomen met behulp van deze werkwijzen. Dit is ten dele een gevolg van het feit dat de dissociatieconstante is waargenomen bij de smelttemperatuur van het eiwit met ligand. Dit Kd algemeen hoger dan die bij fysiologische temperaturen. De dissociation constante is gerelateerd aan de temperatuur van de reactie door de vergelijkingen:
[1]
[2]
(C waarbij θ de standaard referentieconcentratie, Δ r G de Gibbs vrije energie verandering van het reactiemengsel, R de molaire gasconstante, Δ H is de enthalpie verandering in de reactie en Δ S de entropie verandering in het reactiemengsel .)
Reacties met dissociatieconstanten in het meetbare bereik van deze werkwijze zal in het algemeen een negatieve Δ r G, en dus het effect van een stijging van de temperatuur op vergelijking [1] wordt de dissociatieconstante verhogen. Zowel de Δ H en Δ S termen die de Gibbs vrije energie vormen (vergelijking [2]) zijn temperature afhankelijke 27, en het effect op de dissociatie constante zal afhangen van de grootte en het teken van deze temperatuur afhankelijkheden, verschijnt interactie afhankelijk noodzakelijkerwijs. Bijgevolg is het niet onverwacht dat de dissociatie constanten bepaald volgens deze methode soms groter zijn dan die bepaald door werkwijzen die werken bij kamertemperatuur. Temperatuurafhankelijkheid is uiteraard ook een nadeel van vele andere methoden, die trachten het dissociatieconstante leveren bij temperaturen lager dan de fysiologische temperatuur.
Een ander nadeel van de DSF werkwijze is dat het een label methode tegenstelling ITC. De fluorescerende label gebruikt (SYPRO Orange) is hydrofoob, en dus in sommige gevallen kan concurreren met de binding van hydrofobe liganden aan eiwitten. Derhalve is het waarschijnlijk dat in sommige gevallen, de dissociatieconstante verkregen worden opgespoten door concurrentie met het label. Voor de vergelijking van verschillende liganden, (het primaire gebruik vanDSF), de verschillen waarschijnlijk voldoende belangrijk om de classificatie van verbindingen beïnvloeden door affiniteit te zijn.
Een mogelijk nadeel van deze methode is de detectiegrens kan worden bereikt. In beginsel zou het niet mogelijk zijn een waarde voor Kd die lager is dan 50% van de eiwitconcentratie, en zelfs waarden in dit gebied zullen waarschijnlijk van twijfelachtige nauwkeurigheid correct te meten. Hoewel de detectielimiet in dit marktsegment iets worden verlengd dat de concentraties van eiwit en kleurstof, de gevoeligheid van het instrument te voorkomen verdere verlaging eiwitconcentratie. Evenzo zal het boveneinde van de gevoeligheid wordt bepaald door de oplosbaarheid van het ligand. Een mathematisch robuuste schatting voor Kd verkrijgen is het meest belangrijk voor gegevens 90% van het eiwit in de ligand-gebonden vorm, die ligand concentraties vereist approximate te verkrijgenly tien keer K d (ervan uitgaande dat er geen cooperativiteit). De detectiegrens zal dus noodzakelijkerwijs een tiende van de oplosbaarheid van het ligand in de desbetreffende buffer. Dit betekent dat de detectielimieten van de werkwijze zal typisch liggen tussen 1 uM en 1 tot 100 mM, afhankelijk van het eiwit en ligand.
Concluderend, differentiële scanning fluorimetrie is een veelzijdige techniek voor een groot aantal eiwitten. De hier voorgestelde methode is het mogelijk om snel en goedkoop bepalen van de affiniteit van een proteïne voor verschillende liganden. Dit heeft een groot potentieel voor toepassing in eiwitzuivering en stabilisering ophelderen van de functie of specificiteit van enzymen uit metagenomes en in drug discovery, vooral in kleine laboratoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | Other statistics packages will provide similar functionality | |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
References
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
- Ladbury, J. E. Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design. Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).
- Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering. Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).
- Davis, B. J., Erlanson, D. A. Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening. Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).
- Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery. Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).
- Scott, D. E., et al. Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions. Chembiochem. 14, 332-342 (2013).
- Cimmperman, P., et al. A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands. Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).
- Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).
- Zubriene, A., et al. Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII. Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11, 835-841 (1997).
- Cuccui, J., et al. Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region. Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).
- DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant. Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).
- Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme. IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).
- Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein. J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).
- Uniewicz, K. A., et al. Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity. Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).
- Wan, K. F., et al. Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL. Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).
- Koropatkin, N. M., Holden, H. M. Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi. J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).
- Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB. J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).
