Introduction
Muskel-sygdomme rammer millioner af mennesker i USA og nuværende alvorlige konsekvenser for de nationale og lokale sundhedssystemer 1. Disse lidelser er kendetegnet ved tab af knogle-og ledfunktion, som kræver omfattende behandling og lange perioder med genopretning. Sædvanligvis en relativ stigning i antallet og / eller aktiviteten af osteoklaster, specialiserede celler til resorbere knogler, osteoporose og gigt er observeret 2. Under fysiologiske betingelser antallet og aktiviteten af osteoklaster reguleres af receptor aktivator af nuklear faktor κ-B ligand (RANKL), som produceres af osteoblaster. Osteoprotegerin (OPG), er en lokkedue receptor for RANKL også produceret af osteoblaster 3 In vivo dyremodeller, der involverer systemisk overekspression af sRANKL, eller sletning af OPG er meget værdifulde i osteoporose forskning.; men disse metoder kræver frembringelsen af transgene mus 4,5. Her blev en hidtil ukendt alternativFremgangsmåde overudtrykke sRANKL til undersøgelse af muskel-relaterede lidelser er beskrevet. Specifikt blev minicircle (MC) DNA-teknologi og hydrodynamiske levering metoder anvendes til at opnå gen-overførsel af sRANKL in vivo og overekspression mus sRANKL systemisk 6.
Denne metode er også et supplement til andre in vivo modeller af osteoporose, såsom hormonelle graduering af osteoklaster efter ovariektomi 7 og kostintervention ved lavt calcium kost 8. Disse modeller er meget nyttigt at studere forskellige aspekter af muskuloskeletale lidelser, men de kræver kirurgiske procedurer og kan tage op til flere måneder, med væsentlige omkostninger 9. Ovariektomerede (OVX) gnaver model er en eksperimentel dyremodel, hvor fjernelse af æggestokke fører til østrogenmangel derved efterligne menneskelig postmenopausal osteoporose 10. Humant postmenopausal osteoporose, en tilstand, hvor østrogen deficihed fører til øget risiko for knoglebrud og osteoporose påvirker cirka otte millioner kvinder i USA alene. Selv OVX model er anvendelig til postmenopausal osteoporose tilbyder begrænsede fordele i at studere osteoporose i almindelighed. Østrogen undertrykker knogletab, ved at inducere osteoclast og hæmme osteoblast apoptose derfor i sit fravær en øget osteoklastaktivitet observeres 10-12. En RANKL-OPG forholdet ubalance, der favoriserer knogleresorption er også observeret 13. Imidlertid er østrogenmangel in vivo også ledsaget af reducerede niveauer af transformerende vækstfaktor β (TGF β), øget interleukin-7 (IL-7) og TNF, IL-1 og IL-6 14,15. Da disse cytokiner har kendt knogleremodellering modulatoriske funktioner uafhængigt af RANKL vej, er det umuligt at tilskrive nogen osteoklast aktivering udelukkende til RANKL-RANK akse. Det er beskrevet i dette papir model gør det muligt for forskerne at studere i vivo RANKL-RANK akse i osteoclastogenese og knogletab uden pro-inflammatoriske cytokiner i forhold til OVX gnavermodeller.
Derudover in vitro osteoclastogenese teknikker er vigtige redskaber til at studere osteoclast aktivering for potentielle terapeutiske behandlinger af sygdomme i bevægeapparatet. Tidligere undersøgelser har også vist, at dyrkning af muse knoglemarv afledte makrofager (BMMs) med muse-makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) og mus sRANKL kan føre til osteoklastdifferentiering 3,16,17. Her bliver de protokoller til at generere flerkernede osteoclast-lignende celler fra museknoglemarv samt fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) in vitro 18 beskrevet. De cellebaserede assays, der er nødvendige for at definere en moden terminalt differentieret og fuldt funktionel osteoklaster beskrives også kort. Disse in vitro-teknikker supplerer romanen in vivo tilgang og tilsammen er powerful efterforskningsmæssige redskaber til at studere osteoklastdifferentiering og aktivering. Ved hjælp af disse systemer, forskerne er i stand til at generere osteoklaster in vivo og in vitro og definere de stimuli og signaler, der er nødvendige for deres proliferation og aktivering samt teste effektiviteten af farmakologiske og biologiske hæmmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hydrodynamisk Levering af sRANKL MC-DNA
- Hydrodynamisk Levering via Mouse Tail Vein
- Mus vejes før haleveneinjektion. Fortynd sRANKL eller grønt fluorescerende protein (GFP) MC i Ringers opløsning (præ-varme ved 37 ° C) i et samlet volumen på ~ 10% af musens legemsvægt.
- Varm op med musen i et bur i 10 minutter før injektion med henblik på at udvide blodkarrene og gøre laterale vener (LVS) synlige. Overvåg musen omhyggeligt for at undgå dehydrering og hypertermi.
- Så snart LVS er forstørrede og synlig, overføre mus til fastholdelsesanlæg og sæt stikket langt nok ind i cylinderen for at begrænse bevægelsen. Overvåg musen til normal aktivitet såsom vejrtrækning. Juster stikket på restrainer hvis nødvendigt.
- Desinficere injektionsstedet 3/4 fra spidsen af halen med en spritserviet. Brug en 27-30 G nål til mus haleveneinjektion. Hold halen fast med den ene hånd og indfør nålen ihalevenen. Lægge pres på sprøjten og fuldføre injektion inden for 5-7 sek.
- Fjern nålen fra halevenen og pres med et stykke vat mod injektionsstedet for at stoppe blødningen. Overvåg musen til 15-30 minutter, og derefter overføre musen tilbage til vivarium når vejrtrækning reduceres til dens normale hastighed.
- Bekræftelse af Systemisk Mouse sRANKL Expression og kvantificering af Mouse Serum TRACP5b Indlæg Gene Transfer
- Opvarm mus i et bur i 5-10 minutter for at dilatere blodkar og gøre LVS synlige. Overvåg musen omhyggeligt for at undgå dehydrering og hypertermi.
- Lave et lille snit med en kniv til at musens hale på et sted en frem fra spidsen af halen.
- Saml ca 100 ul blod i serumseparationsglas.
- Inkuber serumseparationsglas ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Centrifugér prøver på 10.000 xg i 5 min og indsamle serum. Store serum i -80 ° C til yderligere analyse.
- Udfør sRANKL ELISA og mus serum TRACP5b assay på serumprøver ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit.
2.. In vitro Osteoclast Generation fra Mouse BMMs
- Isolering og dyrkning af BMMs
- Isolering af skinneben og lårben knogler: Afliv donor mus med CO 2, og desinficere benene med 70% ethanol. Dissekere fra skambenet til calcaneus knogle, at fjerne lårben og skinneben knogler intakte.
- Fjern huden og musklen forsigtigt uden at beskadige knoglen. Placer forarbejdet lårben og skinneben knogle i en petriskål, der indeholder phosphatbufret saltvand (PBS).
- Fjernelse af knoglemarv: Skær spidsen på den ene side af lårben og skinneben knogler og skyl knoglemarven i et 50 ml rør ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 25 G kanyle, lastet med α-MEM indeholdende 1% penicillin / streptomycin (Osteoclast Culture Medium / OCM).
- Kultur Makrofager
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
- Plate 1 x 10 6 celler pr brønd i en 6-brønds plade eller 3 x 10 5-celler til dækglas (5 mm) eller dentin skiver placeret i 96-brønds plade og inkuber ved 37 ° C.
- Aspirer alle medier, der indeholder ikke-adhærente celler, og inkuber cellerne ved 37 ° C med frisk OCM (+) indeholdende 25 ng / ml muse-M-CSF i 48 timer.
- Aspirer alle medier og inkuberes celler ved 37 ° C med frisk OCM (+) medium indeholdende 25 ng / ml muse-M-CSF og 30 ng / ml muse sRANKL at indlede osteoclastogenese. Efterfyld medier hver 3 dage, som krævet.
- Grow cellerca 6-8 dage til dannelse af gigantiske multi-nukleare celler, som kan resorberende knogle. Så snart flerkernede celler vises, udføre TRAP (tartrat resistent sur phosphatase) farvning anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit, og når det er fuldt modnet, udføre funktionelle assays. Visualisere F-actin ringe på dækglas under anvendelse af phalloidin pletten og billedet cellerne knyttet til dentin skiver ved scanning elektronmikroskopi (SEM) som beskrevet tidligere 19..
3.. In vitro Osteoclast Generation fra human PBMC'er
- Isolering af human PBMC'er
- Der tilsættes 10 ml forvarmet Histopaque-1077 i et 50 ml rør.
- Tomme leukocyt filter opnået fra blodbanken med sterilt PBS i et 50 ml rør (i forholdet 1:1 blod med PBS). Lag det fortyndede blod over HISTOPAQUE løsning meget langsomt, og sørg for, at blodet ikke blandes med HISTOPAQUE.
- Centrifugér prøver ved 1000 xg i 20 min ved 18 ° C. Følgning centrifugering omhyggeligt isolere den hvide buffy coat lag, der indeholder de hvide blodlegemer og overføre til en ny 50 ml rør.
- Fortynd cellerne med PBS og centrifugeres igen ved 650 x g i 5 minutter for at opsamle cellerne.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne i OCM (-) medier og tælle celler ved hjælp af celle tæller.
- Plating og dyrkning PBMC'er
- Resuspender cellerne i OCM (+) medier plade 8 x 10 6 celler / ml per brønd i en 6-brønds plade eller 1 x 10 6 celler / ml per brønd i 96-brønds plade. Plate celler på dækglas (5 mm), som er nødvendige for immunfluorescens billeddannelse samt knogle skiver egnede til knogleresorptionssygdomme assays som tidligere beskrevet 20.
- Skift kultur medier, påfyldning celler med human M-CSF hver 2-3 dage eller efter behov. Fortsæt derefter til differentiering skridt på dag 5 ved at tilsætte 30 ng / ml humant sRANKL sammen med 25 ng / ml human M-CSF i OCM (+) medier til at indlede osteoclastogeneser.
- Grow celler til cirka 14 til 21 dage til at danne gigantiske multi-nukleare celler. Så snart flerkernede celler vises, kan disse celler derefter mærket til TRAP, og når de er fuldt modnet, kan funktionelle assays udføres. F-actin-ringe kan visualiseres på dækglas under anvendelse af phalloidin pletten. Cellemorfologien kan undersøges i celler, der er knyttet til dentin skiver af SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her er en ny genoverførsel teknik til differentiering af osteoklaster in vivo og cellekultur-protokoller til at differentiere prækursorceller i osteoklaster in vitro som en metode til at studere effekterne af cytokiner på osteoclastogenese beskrevet. I figur 1 er repræsentative resultater af succesfulde genoverførsel af GFP og mus sRANKL MC i mus vist. I figur 2 er de repræsentative billeder af museknoglemarvs eller humane PBMC celledifferentieringsfaktorer tidsforløb kulturer af precursorceller til osteoklaster ved lysfeltmikroskopi vist. Figur 3, er de repræsentative billeder fra tre uafhængige fremgangsmåder til karakterisering af muse knoglemarvafledte osteoklaster vist . Tilstedeværelsen af muse sRANKL aktiverer ekspressionen af TRAP (figur 3A og B), og dannelsen af F-actin ringe (figurerne 3C og D). Scanning elektron mikroskopi (SEM) viser, at muse sRANKL inducerer dannelsen af kæmpeceller i stand til resorberende knogle (figur 3E og F). figur 4, de samme karakteriseringsmetoder på humane PBMC afledt osteoklaster er vist.
Figur 1.. SRANKL in vivo gen-overførsel fører til øget osteoclastogenese. Anterior visning af A, B) muselever eksplanteret og C, D) helkrops billeder af 12-uger gamle C57BL / 6 hanmus injiceret med 5 ug GFP eller sRANKL MC DNA. Pilen angiver GFP-ekspression in vivo i GFP genoverførsel mus. RANKL genoverførsel mus tjener som nogen baggrundsfluorescens. Billeder taget af Maestro 2 Imager, én dag efter gen-overførsel (rød og grøn deNote baggrund og GFP, henholdsvis). E) Plasmid kort over sRANKL MC-DNA-konstruktion og F) sRANKL niveau i serum analyseret ved 1, 5 og 11 dage efter GFP eller sRANKL genoverførsel. G) museserum TRACP5b niveau analyseret 11 dage efter GFP eller sRANKL genoverførsel. Skalapanelerne angiver 5 mm i A, B, og 10 mm i C, D.
Figur 2. In vitro osteoclastogenese i både murine og humane celle dyrkningssystemer. Bright-field mikroskopi af muse-celler isoleret fra knoglemarv og dyrket i nærvær af 25 ng / ml muse-M-CSF og 30 ng / ml muse sRANKL viser en differentiering tidsforløb på dage A), 2 b) 5, og C) 8.. Bright-field mikroskopi af humane celler isoleretfra perifert blod og dyrkes i nærvær af 25 ng / ml human M-CSF og 30 ng / ml human sRANKL viser en differentiering tidsforløb på dag D) 4 E) 14, og F) 21. Skalapanelerne angiver 20 pm.
Fig. 3. Generation og karakterisering af muse osteoklaster. TRAP farvning (lyserød) af muse-celler isoleret fra knoglemarv og dyrket i 6 dage i nærvær af a) 25 ng / ml muse-M-CSF eller B) 25 ng / ml muse-M -CSF og 30 ng / ml mus sRANKL. Phalloidin (grøn) og DAPI (Blue) farvning af muse-celler isoleret fra knoglemarv og dyrket i 8 dage i nærvær af C) 25 ng / ml muse-M-CSF eller D) 25 ng / ml muse-M-CSF og 30 ng / ml mus sRANKL viser dannelsen af FaCtIN ring i flerkernede celler. SEM-mikrofotografier af muse-celler isoleret fra knoglemarv og dyrket i 8 dage i nærværelse af E) 25 ng / ml muse-M-CSF eller F) 25 ng / ml muse-M-CSF og 30 ng / ml muse sRANKL viser dannelsen af resorptions områder på knogle som angivet med pilene. Skalapanelerne angiver 40 pm i AD, og 30 um i E, F.
Fig. 4. Generation og karakterisering af humane osteoklaster. TRAP farvning (lyserød) af humane celler isoleret fra PBMC'er og dyrket i 15 dage i nærværelse af a) 25 ng / ml human M-CSF eller B) 25 ng / ml human M- CSF og 30 ng / ml human sRANKL. Phalloidin (grøn) og DAPI (Blue) farvning af humane celler isoleret fra PBMC og dyrket i 19 dage i nærværelse af C) D) 25 ng / ml human M-CSF og 30 ng / ml human sRANKL viser dannelsen af F-actin ringe i flerkernede celler. SEM-mikrofotografier af humane celler isoleret fra PBMC og dyrket i 18 dage i nærværelse af E) 25 ng / ml human M-CSF eller F) 25 ng / ml human M-CSF og 30 ng / ml human sRANKL viser dannelsen af resorption områder på knogle som angivet med pilene. Skalapanelerne angiver 10 um i A, B, 20 um i C, D 15 um i E, F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskuloskeletale forhold er blandt hovedårsagerne til sygelighed og invaliditet og består af over 150 sygdomme og syndromer; påvirker cirka 90 millioner amerikanere i dag. Ledbetændelse og knoglenedbrydning er fremherskende træk ved muskuloskeletale forhold, herunder gigt og knogleskørhed. Osteoporose er en tilstand, der svækker knogle integritet, der ofte fører til brud på knoglen. Gigt er en kronisk, invaliderende sygdom karakteriseret ved betændelse i leddene, der bliver hævet, ømt og stiv-begrænse normal bevægelse og kan føre til handicap. Skønt patogenesen af muskuloskeletale sygdomme i høj grad adskiller sig fra hinanden, knoglenedbrydning er det overordnede fælles træk. Ødelæggelse i muskuloskeletale forhold Bone er primært forårsaget af en ubalance mellem knogleresorption og knogledannelse 21,22. En terapeutisk fremgangsmåde er at forsøge at blokere evnen af disse celler til at ødelægge knogle
In vivo-model beskrevet her bruger minicircles, som er små episomale DNA-vektorer (~ 4KB) befriet fra bakteriel rygrad, der også tjener som transgene bærere 24. Minicircles udtrykke transgener 10-1,000 gange højere end normale bakterielle plasmider med en stabil ekspression i op til flere måneder. Den mindre molekylære størrelse minicircles bidrager til en mere effektiv transfektion sats og væsentlig udtryk sammenligne til normale bakterieplasmider 24. Derfor er minicircles nu almindeligt anvendt i prækliniske genoverførsel studier 25,26. Hydrodynamisk levering er en veludviklet metode baseret på hydrodynamisk tryk i kapillærerne til at levere plasmid DNA i hele kroppen af en mus. Hydrodynamisk gen levering til hepatocytter via haleveneinjektion i mus er veletableret to udtrykke transgenet ved plasmid 6. I disse undersøgelser er overekspression mus sRANKL i in vivo musemodel opnås ved sRANKL MC og hydrodynamiske levering via haleveneinjektioner. Mus sRANKL ELISA kan anvendes til påvisning af serumniveauer af RANKL i mus. Signifikant stigning i museserum TRACP5b en knogleresorptionsmarkøren 27, er observeret i sRANKL genoverførsel mus. Især er denne teknik ikke begrænset til overekspression af sRANKL; det kan også anvendes yderligere at overudtrykke andre secernerede proteiner 28. Det primære tekniske vanskeligheder i denne procedure er den hydrodynamiske levering via halevenen. Bortset fra de regelmæssige haleveneinjektion, hydrodynamisk levering kræver levering af minicircles i store mængder fysiologisk opløsning i musene indenfor 5-7 sek. Således stabil håndtering og injektionsteknik er afgørende for succes med denne procedure. Generering sRANKL transgene mus er en anden tilgang til in vivo osteoclastogenesis. Et højt niveau af sRANKL kan imidlertid føre til embryonisk letalitet 4 og generere transgene mus er også dyrt og tidskrævende.
I OVX gnavermodel begge inflammatoriske cytokiner, såsom TNF, IL-1 og IL-6, og ikke-inflammatoriske cytokin sRANKL bidrager til in vivo osteoclastogenese og knogletab. sRANKL genoverførsel model fører til overekspression af kun ikke-inflammatorisk cytokin sRANKL. Derfor sRANKL genoverførsel model beskrevet her giver forskerne et kraftfuldt værktøj til at undersøge bidraget fra RANKL-Rank akse i knogleremodelleringen i fravær af inflammation.
En in vitro osteoclast dyrkningsmetode, som involverer co-dyrkning knoglemarvsceller og osteoblaster, blev etableret i slutningen af 1980'erne forud for opdagelsen af RANKL i slutningen af 1990 er 29,30. Rekombinant M-CSF og RANKL inducere osteoklastdifferentiering effektivt in vitro ennd metode er tidligere blevet beskrevet i andre undersøgelser 3,31. M-CSF er kendt for at stimulere RANK udtryk i begyndelsen osteoklastforstadiernes 32 og til at fungere som en overlevelse faktor for osteoklastforstadiernes og modne osteoklaster 33. RANKL er afgørende for osteoklastdifferentiering og aktivering 3. Her er fremgangsmåden af in vitro-osteoclastogenese beskrevet. Vellykket dyrkning og differentiering af precursorceller til osteoklaster kræver steril celleisolering og ordentlig plating teknikker samt omhyggelig forståelse af tidsstyret cellehøst. Beregnet udpladning af cellerne er afgørende, fordi osteoklastdifferentiering kræver fusion af osteoklast precursorceller 34 og et utilstrækkeligt antal osteoclast precursorceller vil ikke lette fusion og differentiering af precursorceller i osteoklaster. Ligeledes et overskydende antal osteoclast precursorceller, fører til at klumpe dannelse og eventuel celledød. Fjernelse af ikke-adhærente celler 2 timer efter udpladning af celler kan bidrage til at opretholde et optimalt celleantal. Endelig tidspunktet for cellehøst er afgørende, da osteoklaster er terminalt differentierede kortlivede celler med en levetid på cirka 48 hr 35. Således bør celler høstes indenfor 48 timer efter den første observation af flerkernede celler. Disse celler kan derefter karakteriseres ved TRAP og F-actin-farvning ved immunohistokemi og knogleresorption aktivitet kan påvises ved scanning elektronmikroskopi (SEM). Disse eksperimentelle tilgange muliggøre klar definition af osteoklaster i form af deres fænotype og funktion.
Den in vivo og in vitro-teknikker, der beskrives her, vil fremme udviklingen af osteoklast inhibitorer i øjeblikket i prækliniske studier, der fører til effektive terapeutiske strategier for de millioner af osteoporose og gigt patienter på verdensplan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
