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Medicine

एक उपन्यास Published: June 8, 2014 doi: 10.3791/51810
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 2, 3, 1,2
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

Introduction

Musculoskeletal रोगों राष्ट्रीय और स्थानीय स्वास्थ्य प्रणाली 1 के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका और वर्तमान गंभीर परिणाम में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं. इन विकारों की हड्डी का नुकसान और व्यापक उपचार और वसूली की लंबी अवधि की आवश्यकता है कि संयुक्त समारोह की विशेषता है. आमतौर पर, osteoclasts की संख्या और / या गतिविधि में एक रिश्तेदार वृद्धि, कोशिकाओं ऑस्टियोपोरोसिस में, हड्डी resorb के लिए विशेष और गठिया 2 मनाया जाता है. शारीरिक शर्तों के तहत osteoclasts की संख्या और गतिविधि अस्थिकोरक द्वारा निर्मित है जो परमाणु कारक κ बी ligand (RANKL), के रिसेप्टर उत्प्रेरक द्वारा नियंत्रित किया जाता है. Osteoprotegerin (OPG), RANKL के लिए एक प्रलोभन रिसेप्टर भी अस्थिकोरक 3 द्वारा निर्मित है प्रणालीगत sRANKL की overexpression, या OPG का विलोपन शामिल है में vivo पशु मॉडल ऑस्टियोपोरोसिस अनुसंधान में बहुत कीमती हैं.; हालांकि, इन तरीकों ट्रांसजेनिक चूहों 4,5 की पीढ़ी की आवश्यकता होती है. इधर, एक उपन्यास विकल्पmusculoskeletal संबंधी विकारों के अध्ययन के लिए sRANKL overexpressing की विधि का वर्णन किया है. विशेष रूप से, minicircle (एमसी) डीएनए प्रौद्योगिकी और hydrodynamic प्रसव के तरीके विवो में sRANKL का जीन स्थानांतरण प्राप्त करने और प्रणालीबद्ध 6 माउस sRANKL overexpress करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

इस विधि को भी इस तरह के कम कैल्शियम आहार 8 से ovariectomy 7 और पथ्य हस्तक्षेप के बाद osteoclasts के हार्मोनल मॉडुलन के रूप में ऑस्टियोपोरोसिस के अन्य vivo मॉडल, के लिए पूरक है. इन मॉडलों वे शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है और एक महत्वपूर्ण लागत 9 पर कई महीनों तक का समय लग सकता है लेकिन musculoskeletal संबंधी विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हैं. Ovariectomized (OVX) कृंतक मॉडल अंडाशय के हटाने जिससे मानव postmenopausal ऑस्टियोपोरोसिस 10 नकल उतार एस्ट्रोजन की कमी की ओर जाता है, जहां एक प्रयोगात्मक पशु मॉडल है. मानव रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस, जहां एस्ट्रोजन defici एक शर्तency अस्थि भंग का खतरा बढ़ जाता है और ऑस्टियोपोरोसिस संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में लगभग आठ लाख महिलाओं को प्रभावित करता है. OVX मॉडल रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस के लिए उपयोगी है हालांकि यह सामान्य रूप में ऑस्टियोपोरोसिस का अध्ययन करने में सीमित लाभ प्रदान करता है. एस्ट्रोजन इसलिए इसके अभाव में एक वृद्धि अस्थिशोषक गतिविधि 10-12 मनाया जाता है, अस्थिशोषक उत्प्रेरण और अस्थिकोरक apoptosis बाधा, हड्डी नुकसान को रोकता है. अस्थि अवशोषण के पक्ष में है कि एक RANKL-OPG अनुपात असंतुलन भी 13 मनाया जाता है. वृद्धि कारक β (TGF β), वृद्धि हुई इंटरल्यूकिन 7 (आईएल -7) और TNF, आईएल -1 और आईएल -6 14,15 बदलने के कम स्तर से हालांकि, विवो में एस्ट्रोजन की कमी भी साथ है. इन साइटोकिन्स RANKL मार्ग की हड्डी remodeling modulatory कार्यों स्वतंत्र जाना जाता है, यह केवल RANKL दर्जा अक्ष के लिए किसी भी अस्थिशोषक सक्रियण विशेषता के लिए असंभव है. इस पत्र में वर्णित मॉडल विव में अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओंओ समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स बिना osteoclastogenesis और हड्डी हानि में RANKL दर्जा अक्ष OVX कृंतक मॉडल की तुलना में.

साथ ही, इन विट्रो osteoclastogenesis तकनीक musculoskeletal रोगों के संभावित चिकित्सीय उपचार के लिए अस्थिशोषक सक्रियण अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं. पिछले अध्ययनों से भी माउस बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम सीएसएफ) और माउस sRANKL साथ माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMMs) संवर्धन अस्थिशोषक भेदभाव 3,16,17 का कारण बन सकता है दिखाया है. इधर, माउस अस्थि मज्जा से और साथ ही इन विट्रो 18 में मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) से multinucleated अस्थिशोषक की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. एक परिपक्व टर्मिनली विभेदित और पूरी तरह कार्यात्मक अस्थिशोषक को परिभाषित करने के लिए आवश्यक सेल आधारित assays भी संक्षेप में वर्णन किया गया हैं. ये इन विट्रो तकनीक विवो दृष्टिकोण में उपन्यास के पूरक हैं और एक साथ पी के रूप में सेवाowerful खोजी उपकरण अस्थिशोषक भेदभाव और सक्रियण अध्ययन करने के लिए. इन पद्धतियों का प्रयोग, वैज्ञानिकों vivo में इन विट्रो में osteoclasts उत्पन्न करने और उनके प्रसार और क्रियान्वयन के लिए आवश्यक उत्तेजनाओं और संकेतों को परिभाषित करने के साथ ही औषधीय और जैविक inhibitors की प्रभावकारिता का परीक्षण करने में सक्षम हैं.

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Protocol

SRANKL एम सी डीएनए की 1. द्रव्यगतिकी डिलिवरी

  1. माउस पूंछ नस के माध्यम से hydrodynamic डिलिवरी
    1. पूंछ नस इंजेक्शन से पहले माउस वजन. माउस के शरीर के वजन के 10% ~ की कुल मात्रा में sRANKL या घंटी समाधान में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एम सी (पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस) पतला.
    2. रक्त वाहिकाओं को चौड़ा करना और दिखाई पार्श्व नसों (LVS) बनाने के क्रम में इंजेक्शन के लिए पहले 10 मिनट के लिए एक पिंजरे में माउस को गर्म. निर्जलीकरण और अतिताप से बचने के लिए सावधानी से माउस मॉनिटर.
    3. जैसे ही LVS फैली हुई है और दिखाई दे रहे हैं, जैसा कि restrainer के लिए माउस को हस्तांतरण और आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए बैरल में काफी दूर तक प्लग डालें. ऐसी श्वास के रूप में सामान्य गतिविधि के लिए माउस मॉनिटर. अगर जरूरत restrainer के प्लग को समायोजित करें.
    4. पोंछ एक शराब के साथ पूंछ की नोक से इंजेक्शन क्षेत्र 3/4 कीटाणुरहित. माउस पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक 27-30 जी सुई का प्रयोग करें. एक हाथ से मजबूती से पूंछ पकड़ और में सुई डालनेपूंछ नस को. सिरिंज पर दबाव लागू करें और 5-7 सेकंड के भीतर इंजेक्शन को पूरा करें.
    5. पूंछ नस से सुई निकालें और रक्तस्राव रोकने के लिए इंजेक्शन साइट पर एक कपास की गेंद के साथ दबाव लागू होते हैं. साँस लेने की दर से अपनी सामान्य दर से कम है तो एक बार मछली पालने का बाड़ा को वापस माउस हस्तांतरण, 15-30 मिनट के लिए माउस मॉनिटर.
  2. सीरम माउस TRACP5b पोस्ट जीन स्थानांतरण की प्रणालीगत माउस sRANKL अभिव्यक्ति और मात्रा की पुष्टि
    1. रक्त वाहिकाओं को चौड़ा करना और LVS दिखाई बनाने के क्रम में 5-10 मिनट के लिए एक पिंजरे में माउस को गर्म. निर्जलीकरण और अतिताप से बचने के लिए सावधानी से माउस मॉनिटर.
    2. पूंछ की नोक से आगे एक साइट एक पर माउस पूंछ के लिए एक ब्लेड के साथ एक छोटा सा चीरा बनाओ.
    3. सीरम जुदाई नलियों में रक्त के लगभग 100 μl लीजिए.
    4. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सीरम जुदाई ट्यूब सेते हैं.
    5. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूने और सीरम इकट्ठा. Storआगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में ई सीरम.
    6. एक वाणिज्यिक उपलब्ध किट का उपयोग कर सीरम नमूनों पर sRANKL एलिसा और माउस सीरम TRACP5b परख प्रदर्शन.

माउस BMMs से 2. इन विट्रो अस्थिशोषक पीढ़ी

  1. अलगाव और BMMs के संवर्धन
    1. टिबिया और फीमर हड्डियों का अलगाव: सीओ 2 के साथ दाता माउस Euthanize, और 70% इथेनॉल के साथ पैर कीटाणुरहित. बरकरार फीमर और टिबिया हड्डियों को दूर करने, कैल्केनीयस हड्डी को जघन हड्डी से काटना.
    2. हड्डी को नुकसान पहुँचाए बिना ध्यान से त्वचा और मांसपेशियों निकालें. फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) युक्त एक पेट्री डिश में कार्रवाई की फीमर और टिबिया हड्डी रखें.
    3. अस्थि मज्जा का हटाया: फीमर और टिबिया हड्डियों के एक तरफ टिप कट और α-सदस्य 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन को रोकने के साथ भरी हुई एक 25 जी सुई के साथ एक 1ml सिरिंज का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अस्थि मज्जा बाहर निकलवाने (अस्थिशोषक संस्कृति मध्यम / ओसीएम).
  2. मैक्रोफेज की संस्कृति
    1. एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
    2. 96 अच्छी तरह से थाली में रखा गया है और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते कांच coverslips (5 मिमी) या दंती स्लाइस को 6 अच्छी तरह से थाली या 3 x 10 5 कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से प्रति प्लेट 1 x 10 6 कोशिकाओं
    3. महाप्राण गैर पक्षपाती कोशिकाओं से युक्त है और 48 घंटे के लिए 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ युक्त ताजा ओसीएम (+) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते सभी मीडिया.
    4. 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ, और osteoclastogenesis आरंभ करने के लिए 30 एनजी / एमएल माउस sRANKL युक्त महाप्राण सभी मीडिया और ताजा ओसीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते (+) मीडिया. आवश्यकता के रूप में हर 3 दिनों मीडिया की भरपाई होगी.
    5. कोशिकाओं को विकसितलगभग 6-8 दिनों हड्डी resorbing में सक्षम विशाल बहु परमाणु कोशिकाओं के रूप में लिए. जैसे ही multinucleated कोशिकाओं प्रकट रूप में, एक वाणिज्यिक उपलब्ध किट का उपयोग धुंधला ट्रैप (tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट) करते हैं, और पूरी तरह परिपक्व जब, कार्यात्मक assays के प्रदर्शन. Phalloidin दाग और छवि पहले से 19 के रूप में वर्णित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग द्वारा स्लाइस दंती से जुड़ी कोशिकाओं का उपयोग coverslips पर एफ actin के छल्ले कल्पना.

मानव PBMCs से 3. इन विट्रो अस्थिशोषक पीढ़ी

  1. मानव PBMCs का अलगाव
    1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूर्व गर्म Histopaque-1077 के 10 एमएल जोड़ें.
    2. खाली ल्युकोसैट फिल्टर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब (पीबीएस के साथ रक्त का 1:1 अनुपात) में बाँझ पीबीएस के साथ रक्त बैंक से प्राप्त किया. रक्त Histopaque के साथ मिश्रण नहीं करता है, यकीन है कि बहुत धीरे धीरे Histopaque समाधान पर पतला रक्त परत.
    3. 18 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने का पालन करेंcentrifugation आईएनजी, ध्यान से सफेद रक्त कोशिकाओं से युक्त सफेद बफी कोट परत को अलग करने और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण.
    4. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 650 XG पर फिर पीबीएस और अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं पतला.
    5. मीडिया और सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं गिनती (-) ओसीएम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें.
  2. PBMCs चढ़ाना और संवर्धन
    1. ओसीएम में कोशिकाओं Resuspend (+) मीडिया और प्लेट 8 X 10 / मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली या 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल प्रति अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली में में 6 कोशिकाओं. के रूप में immunofluorescence इमेजिंग के साथ ही अस्थि अवशोषण assays के लिए उपयुक्त हड्डी स्लाइस पर के लिए आवश्यकता के रूप में कांच coverslips (5 मिमी) पर प्लेट कोशिकाओं पहले 20 में वर्णित है.
    2. बदले संस्कृति मीडिया, मानव एम सीएसएफ हर 2-3 दिनों के साथ या के रूप में आवश्यक कोशिकाओं भरपाई. फिर osteoclastogenes आरंभ करने के लिए ओसीएम (+) मीडिया में 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ के साथ साथ मानव sRANKL की 30 एनजी / एमएल जोड़कर दिन 5 पर भेदभाव चरण पर आगे बढ़ेंहै.
    3. विशाल बहु परमाणु कोशिकाओं के रूप में लगभग 14 से 21 दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित. जैसे ही multinucleated कोशिकाओं दिखाई देते हैं, इन कोशिकाओं को फिर जाल के लिए लेबल किया जा सकता है, और पूरी तरह परिपक्व जब, कार्यात्मक assays प्रदर्शन किया जा सकता है. एफ actin के छल्ले phalloidin दाग का उपयोग coverslips पर देखे जा सकते हैं. सेल आकारिकी SEM द्वारा स्लाइस दंती से जुड़ी कोशिकाओं में जांच की जा सकती.

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Representative Results

इधर, osteoclastogenesis पर साइटोकिन्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि के रूप में इन विट्रो में osteoclasts में अग्रदूत फर्क कोशिकाओं के लिए vivo और सेल संस्कृति प्रोटोकॉल में osteoclasts के भेदभाव के लिए एक उपन्यास जीन स्थानांतरण तकनीक वर्णित हैं. चित्रा 1 में, चूहों में GFP और माउस sRANKL एम सी के सफल जीन स्थानांतरण के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं. चित्रा 2 में, माउस अस्थि मज्जा या उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा osteoclasts के लिए अग्रदूत साबित कोशिकाओं के मानव PBMC सेल भेदभाव समय पाठ्यक्रम संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियाँ दिखाई जाती हैं. चित्रा 3, माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न osteoclasts निस्र्पक के लिए तीन स्वतंत्र तरीकों से प्रतिनिधि छवियों दिखाए जाते हैं . माउस sRANKL की उपस्थिति ट्रैप की अभिव्यक्ति (आंकड़े 3 ए और बी) और एफ actin के छल्ले (आंकड़े -3 सी और डी) के गठन को सक्रिय करता है. स्कैनिंग चुनावTron माइक्रोस्कोपी (SEM) माउस sRANKL हड्डी (आंकड़े 3E और एफ) resorbing में सक्षम विशाल कोशिकाओं के निर्माण को प्रेरित करता है कि पता चलता है. 4 चित्रा, मानव PBMC पर एक ही लक्षण तरीकों osteoclasts दिखाए जाते हैं व्युत्पन्न.

चित्रा 1
चित्रा 1. SRANKL vivo में जीन स्थानांतरण में वृद्धि हुई osteoclastogenesis की ओर जाता है. एक के पूर्वकाल देखें, बी) माउस जिगर explants और सी, डी) 12 सप्ताह पुराने C57BL 6 / नर चूहों के पूरे शरीर छवियों GFP या sRANKL के 5 ग्राम के साथ इंजेक्शन एम सी डीएनए. तीर GFP जीन स्थानांतरण माउस में vivo में GFP अभिव्यक्ति को इंगित करता है. RANKL जीन स्थानांतरण चूहों कोई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के रूप में सेवा करते हैं. उस्ताद 2 Imager, एक दिवसीय डाक जीन स्थानांतरण (लाल और हरे डी द्वारा कब्जा कर लिया छवियोंeNote पृष्ठभूमि और क्रमशः GFP,). ई) प्लास्मिड 1, 5 पर विश्लेषण सीरम में sRANKL एम सी डीएनए का निर्माण और एफ) sRANKL स्तर का नक्शा और 11 दिनों GFP पोस्ट या sRANKL जीन स्थानांतरण. जी) माउस सीरम TRACP5b स्तर 11 दिनों का विश्लेषण GFP या sRANKL जीन स्थानांतरण के बाद. स्केल सलाखों ए, बी में 5 मिमी, और सी, डी में 10 मिमी से संकेत मिलता है

चित्रा 2
माउस और मानव कोशिका संस्कृति प्रणालियों दोनों में चित्रा 2. इन विट्रो osteoclastogenesis. एक भेदभाव दिखा 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ और 30 एनजी / एमएल माउस sRANKL की उपस्थिति में अस्थि मज्जा और सुसंस्कृत से पृथक माउस कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी दिन में समय बेशक ए), 2 बी) 5, और सी) 8. पृथक मानव कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपीपरिधीय रक्त और 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ और दिनों डी में भेदभाव समय पाठ्यक्रम दिखा 30 एनजी / एमएल मानव sRANKL), 4 ई) 14, और एफ) 21 की उपस्थिति में सुसंस्कृत से. स्केल सलाखों 20 माइक्रोन से संकेत मिलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. जनरेशन और माउस osteoclasts के लक्षण वर्णन अस्थि मज्जा से अलग और एक की उपस्थिति में 6 दिन) के लिए सभ्य माउस कोशिकाओं की. जाल धुंधला (गुलाबी) 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ या बी) 25 एनजी / एमएल माउस एम सी.एस.एफ. और 30 एनजी / एमएल माउस sRANKL. Phalloidin (हरा) और अस्थि मज्जा से अलग और सी की उपस्थिति में 8 दिन) 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ या डी) 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ और 30 एनजी के लिए सभ्य माउस कोशिकाओं के DAPI (नीला) धुंधला सो. के गठन दिखा / एमएल माउस sRANKLmultinucleated कोशिकाओं में ctin अंगूठी. अस्थि मज्जा और ई की उपस्थिति में 8 दिनों के लिए सुसंस्कृत) 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ या एफ) के गठन दिखा 25 एनजी / एमएल माउस एम सीएसएफ और 30 एनजी / एमएल माउस sRANKL से पृथक माउस कोशिकाओं के SEM photomicrographs तीर द्वारा संकेत के रूप में हड्डी पर अवशोषण क्षेत्रों. स्केल सलाखों ई. में 40 माइक्रोन से संकेत मिलता है, और ई, एफ में 30 माइक्रोन

चित्रा 4
एक की उपस्थिति में 15 दिनों के लिए PBMCs और सुसंस्कृत से अलग मानव कोशिकाओं) का आंकड़ा 4. पीढ़ी और मानव osteoclasts की विशेषता. जाल धुंधला (गुलाबी) 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ या बी) 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ और 30 एनजी / एमएल मानव sRANKL. Phalloidin (हरा) और DAPI (नीला) सी की उपस्थिति में 19 दिनों के लिए PBMC और सुसंस्कृत से अलग मानव कोशिकाओं का धुंधला) डी) multinucleated कोशिकाओं में एफ actin के छल्ले के गठन दिखा 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ और 30 एनजी / एमएल मानव sRANKL. ई की उपस्थिति में 18 दिनों के लिए PBMC और सुसंस्कृत से अलग मानव कोशिकाओं) के SEM photomicrographs 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ या एफ) 25 एनजी / एमएल मानव एम सीएसएफ और 30 एनजी / एमएल मानव sRANKL अवशोषण के गठन दिखा तीर द्वारा संकेत के रूप में हड्डी क्षेत्रों पर. स्केल सलाखों ई, एफ में सी, डी 15 माइक्रोन में 20 माइक्रोन, ए, बी में 10 माइक्रोन से संकेत मिलता है

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Discussion

Musculoskeletal शर्तों रुग्णता और विकलांगता के कारणों का नेतृत्व कर रहे हैं और 150 से अधिक बीमारियों और syndromes के शामिल हैं, आज लगभग 90 लाख अमेरिकियों को प्रभावित. संयुक्त सूजन और हड्डी विनाश गठिया और हड्डियों की कमजोरी सहित musculoskeletal शर्तों के प्रमुख विशेषताएं हैं. ऑस्टियोपोरोसिस अक्सर हड्डी के फ्रैक्चर के लिए अग्रणी, हड्डी अखंडता को कमजोर है कि एक शर्त है. गठिया सूजन, निविदा और कड़ी सीमित सामान्य आंदोलन बन गया है और विकलांगता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि जोड़ों की सूजन की विशेषता दुर्बल करने वाली बीमारी, एक पुरानी है. Musculoskeletal रोगों के रोगजनन काफी एक दूसरे से अलग हैं, हड्डी विनाश व्यापक आम सुविधा है. Musculoskeletal शर्तों में हड्डी विनाश मुख्य रूप से अस्थि अवशोषण और हड्डी गठन 21,22 के बीच असंतुलन के कारण होता है. एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण हड्डी को नष्ट करने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता को ब्लॉक करने के लिए प्रयास करने के लिए है vivo में इन विट्रो में दोनों osteoclasts के अध्ययन की अनुमति.

यहाँ वर्णित में vivo मॉडल भी transgene वाहक 24 के रूप में सेवा है कि बैक्टीरियल रीढ़ की हड्डी से मुक्त छोटे episomal डीएनए वैक्टर (~ 4kb), जो कर रहे हैं minicircles, का उपयोग करता है. Minicircles कई महीने तक के लिए एक स्थिर अभिव्यक्ति के साथ सामान्य जीवाणु plasmids तो गुना अधिक transgenes 10-1,000 व्यक्त करते हैं. minicircles के छोटे आणविक आकार और अधिक कुशल अभिकर्मक दर और पर्याप्त अभिव्यक्ति सामान्य जीवाणु plasmids 24 की तुलना करने के लिए योगदान देता है. इसलिए, minicircles अब व्यापक रूप से पूर्व नैदानिक ​​जीन स्थानांतरण पढ़ाई 25,26 में लागू कर रहे हैं. Hydrodynamic वितरण एक माउस के पूरे शरीर में प्लास्मिड डीएनए देने के लिए केशिकाओं में hydrodynamic दबाव के आधार पर एक अच्छी तरह से विकसित विधि है. चूहों में पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से hepatocytes को hydrodynamic जीन डिलीवरी अच्छी तरह से स्थापित टी हैओ प्लास्मिड डीएनए 6 से transgene व्यक्त करते हैं. इन अध्ययनों में, vivo माउस मॉडल में माउस sRANKL overexpressing sRANKL एम सी और पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से hydrodynamic वितरण द्वारा हासिल की है. माउस sRANKL एलिसा चूहों में RANKL के सीरम स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माउस सीरम TRACP5b, एक अस्थि अवशोषण मार्कर 27 की महत्वपूर्ण ऊंचाई sRANKL जीन स्थानांतरण चूहों में मनाया जाता है. उल्लेखनीय है कि इस तकनीक sRANKL की overexpression तक सीमित नहीं है; यह भी आगे अन्य स्रावित प्रोटीन 28 overexpress के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रक्रिया में प्राथमिक तकनीकी कठिनाई पूंछ नस के माध्यम से hydrodynamic वितरण है. इसके अलावा नियमित रूप से पूंछ नस इंजेक्शन से, hydrodynamic वितरण 5-7 सेकंड के भीतर चूहों में शारीरिक समाधान के लिए बड़ी मात्रा में minicircles के वितरण की आवश्यकता है. इस प्रकार, स्थिर हैंडलिंग और इंजेक्शन तकनीक इस प्रक्रिया के साथ सफलता के लिए आवश्यक हैं. SRANKL ट्रांसजेनिक चूहों को पैदा करने में विवो osteoc के लिए एक और दृष्टिकोण हैlastogenesis. हालांकि, sRANKL का एक उच्च स्तरीय भ्रूण मारक 4 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और ट्रांसजेनिक चूहों पैदा भी महंगा है और समय लेने वाली है.

OVX कृंतक मॉडल में, भड़काऊ ऐसे TNF, आईएल -1 और आईएल -6 के रूप में साइटोकिन्स और गैर भड़काऊ साइटोकाइन sRANKL दोनों में विवो osteoclastogenesis और हड्डी हानि के लिए योगदान करते हैं. sRANKL जीन स्थानांतरण मॉडल केवल गैर भड़काऊ साइटोकाइन sRANKL की overexpression की ओर जाता है. इसलिए, यहाँ वर्णित sRANKL जीन स्थानांतरण मॉडल शोधकर्ताओं सूजन के अभाव में हड्डी remodeling में RANKL दर्जा अक्ष के योगदान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

सह संवर्धन अस्थि मज्जा की कोशिकाओं और अस्थिकोरक शामिल है जो एक में इन विट्रो अस्थिशोषक संस्कृति विधि, पूर्व देर से 1990 के 29,30 में RANKL की खोज करने के लिए देर से 1980 में स्थापित किया गया था. संयोजक एम सीएसएफ और RANKL अस्थिशोषक भेदभाव प्रेरित कुशलता में इन विट्रो एकएन डी पद्धति पहले से अन्य अध्ययनों 3,31 में वर्णित किया गया है. एम सीएसएफ जल्दी अस्थिशोषक व्यापारियों 32 में रैंक अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने और अस्थिशोषक व्यापारियों और परिपक्व osteoclasts 33 के लिए एक अस्तित्व कारक के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है. RANKL अस्थिशोषक भेदभाव और सक्रियण 3 के लिए आवश्यक है. इधर, इन विट्रो osteoclastogenesis की विधि का वर्णन किया है. Osteoclasts को सफल संवर्धन और अग्रदूत साबित कोशिकाओं के भेदभाव बाँझ सेल अलगाव और उचित चढ़ाना तकनीक के साथ ही समय पर सेल फसल की सावधान समझ की आवश्यकता होती है. अस्थिशोषक भेदभाव अस्थिशोषक अग्रदूत साबित कोशिकाओं 34 के विलय की आवश्यकता है और अस्थिशोषक अग्रदूत साबित कोशिकाओं की एक अपर्याप्त संख्या osteoclasts में अग्रदूत साबित कोशिकाओं के विलय और भेदभाव की सुविधा नहीं होगी क्योंकि कोशिकाओं की गणना चढ़ाना महत्वपूर्ण है. इसी तरह, अस्थिशोषक अग्रदूत साबित कोशिकाओं की एक अतिरिक्त संख्या, गठन और अंततः कोशिका मृत्यु पेड़ों का झुरमुट की ओर जाता है. गैर का हटायाकोशिकाओं चढ़ाना के बाद पक्षपाती कोशिकाओं 2 घंटा एक इष्टतम सेल नंबर को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं. Osteoclasts लगभग 48 घंटा 35 की उम्र के साथ टर्मिनली विभेदित अल्पकालिक कोशिकाओं के रूप में अंत में, सेल फसल के समय महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, कोशिकाओं multinucleated कोशिकाओं की पहली टिप्पणी के बाद 48 घंटे के भीतर काटा जाना चाहिए. इन कोशिकाओं को फिर immunohistochemistry और अस्थि अवशोषण गतिविधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग से पता लगाया जा सकता द्वारा जाल और एफ actin धुंधला द्वारा होती जा सकता है. इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण उनके phenotype और समारोह के संदर्भ में osteoclasts की स्पष्ट परिभाषा सक्षम.

vivo में और यहां वर्णित विट्रो तकनीक में दुनिया भर में ऑस्टियोपोरोसिस और गठिया के रोगियों के लाखों लोगों के लिए प्रभावी चिकित्सकीय रणनीति के प्रमुख के लिए वर्तमान में पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन में अस्थिशोषक inhibitors के विकास की सुविधा होगी.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
alpha-MEM Life Technologies  12561-056
Human M-CSF Miltenyi Biotec 130-096-492
Mouse M-CSF Miltenyi Biotec 130-094-643
Human RANK-Ligand - soluble Miltenyi Biotec 130-094-631
Mouse RANK-Ligand - soluble Miltenyi Biotec 130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice Braintree TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit  R&D systems MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma 387A
MouseTRAP assay  immunodiagnostic systems SB-TR103

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References

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चिकित्सा अंक 88 अस्थिशोषक गठिया minicircle डीएनए मैक्रोफेज सेल संस्कृति hydrodynamic वितरण
एक उपन्यास<em&gt; में विवो</em&gt; जीन स्थानांतरण तकनीक और<em&gt; इन विट्रो</emMusculoskeletal विकारों में हड्डी हानि के अध्ययन के लिए&gt; सेल आधारित assays
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