Introduction
Заболевания опорно-двигательного затрагивают миллионы людей в Соединенных Штатах и нынешних тяжелых последствий для национальных и местных систем здравоохранения 1. Эти расстройства характеризуются потерей костной и функции суставов, которые требуют серьезного лечения и длительные периоды восстановления. Как правило, относительное увеличение числа и / или активности остеокластов, клеток, специализирующихся на резорбируют кости, при остеопорозе и артрит наблюдается 2. В физиологических условиях количество и активность остеокластов регулируется рецептора активатора ядерного фактора κ-B лиганда (RANKL), который получают путем остеобластов. Остеопротегерин (ОПГ), рецептор приманка для RANKL также производится остеобластов 3 IN VIVO модели на животных, которые включают системную сверхэкспрессию sRANKL, или удаление ОПГ очень ценны в остеопороза исследований.; Однако эти способы требуют создания трансгенных мышей 4,5. Здесь, роман альтернативаМетод избыточной экспрессии sRANKL для изучения нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных описывается. В частности, minicircle (MC) ДНК-технология и гидродинамические методы доставки были использованы для достижения перенос генов из sRANKL в естественных условиях и сверхэкспрессировать мыши sRANKL системно 6.
Этот метод также дополняет другие естественных условиях моделей в остеопороза, например, гормональной модуляции остеокластов следующих овариэктомию 7 и диетического вмешательства диету с низким содержанием кальция 8. Эти модели очень полезны для изучения различных аспектов нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных, однако, они требуют хирургических процедур и может занять до нескольких месяцев, в значительной стоимости 9. Удаленными яичниками (OVX) модель грызуна является экспериментальной модели на животных, где удаление яичников приводит к дефицита эстрогенов, тем самым подражая человеческой постменопаузе остеопороза 10. Человека после менопаузы остеопороз, заболевание, при котором эстроген deficiency приводит к повышенному риску переломов костей и остеопороз поражает около восьми миллионов женщин в одних только Соединенных Штатах. Хотя OVX модель полезна для постклимактерического остеопороза предлагает ограниченные преимущества при изучении остеопороза в целом. Эстроген подавляет потерю костной массы, путем индукции остеокластов и остеобластов ингибирования апоптоза, поэтому в его отсутствие увеличился остеокластов активность наблюдается 10-12. Соотношение RANKL-ОПГ дисбаланс, который способствует резорбции кости наблюдается 13. Тем не менее, дефицит эстрогенов в естественных условиях также сопровождается снижением уровня трансформирующий фактор роста β (TGF β), увеличение интерлейкина-7 (IL-7) и TNF, IL-1 и IL-6 14,15. Поскольку эти цитокины известно костного ремоделирования функции модулирующие зависит от RANKL пути, невозможно приписать никакой активации остеокластов исключительно к оси RANKL-RANK. Модель, описанная в этой статье позволяет исследователям изучать в Львовео ось RANKL-ранг в остеокластогенеза и потери костной массы без провоспалительных цитокинов по сравнению с OVX моделях грызунов.
Кроме того, в пробирке методы остеокластогенеза являются важными инструментами для изучения активации остеокластов для потенциальных терапевтического лечения заболеваний опорно-двигательного. Предыдущие исследования также показали, что культивирование костного мозга мыши, полученные макрофагов (BMMs) с мышь макрофагов колониестимулирующего фактора (M-CSF) и мыши sRANKL может привести к остеокластов дифференциации 3,16,17. Здесь, протоколы для генерации многоядерные остеокластов-подобных клеток из костного мозга мыши, а также из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в пробирке 18 описаны. Анализы на основе клеток, необходимых для определения зрелую терминально дифференцированных и полностью функциональный остеокластов также кратко описаны. Эти методы в пробирке дополняют роман в естественных условиях подхода и вместе служить рowerful инструменты следственные учиться остеокластов дифференциации и активации. С помощью этих систем, ученые способны генерировать остеокласты ин виво и ин витро и определить стимулы и сигналы, необходимые для их пролиферации и активации, а также проверить эффективность фармакологических и биологических ингибиторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Гидродинамическая Доставка sRANKL MC ДНК
- Гидродинамическая Доставка через Mouse хвостовую вену
- Взвесьте мыши до инъекции в хвостовую вену. Развести sRANKL или зеленый флуоресцентный белок (GFP) MC в растворе Рингера (предварительно теплой при 37 ° С) в общем объеме ~ 10% от массы тела мыши.
- Разминка мышь в клетке в течение 10 мин до инъекции для того, чтобы расширять кровеносные сосуды и сделать боковые вены (LVS) видимые. Монитор мыши тщательно, чтобы избежать обезвоживания и гипертермии.
- Как только ПЗ расширены и видно, передавать мышь к фиксатор и вставьте вилку достаточно далеко в ствол сдерживать движение. Монитор мыши для нормальной деятельности, такие как дыхание. Отрегулируйте вилку фиксатор в случае необходимости.
- Дезинфицировать области впрыска 3/4 от кончика хвоста со спиртом салфеткой. Используйте 27-30 G иглу для мыши инъекции в хвостовую вену. Держите хвост твердо одной рукой и вставить иглу вв хвостовую вену. Надавите на шприц и завершить инъекции в пределах 5-7 сек.
- Удалите иглу из хвостовой вены и оказать давление с ватным тампоном на месте инъекции, чтобы остановить кровотечение. Монитор мыши в течение 15-30 мин, а затем перенести мышь обратно в виварий, как только частота дыхания снижается до нормальной скорости.
- Подтверждение выражения системных Мауса sRANKL и количественной оценки мышь Сыворотка TRACP5b Сообщение генного переноса
- Разминка мышь в клетке в течение 5-10 мин, чтобы расширять кровеносные сосуды и сделать ПЗ видно. Монитор мыши тщательно, чтобы избежать обезвоживания и гипертермии.
- Сделать небольшой надрез с лезвием к хвосту мыши на участке, один вперед от кончика хвоста.
- Сбор около 100 мкл крови в трубках разделения сыворотки.
- Инкубируйте пробирки разделения сыворотки при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуга образцов при 10000 мкг в течение 5 мин и собирают сыворотку. Storе сыворотки в -80 ° С для дальнейшего анализа.
- Выполните sRANKL ELISA и мыши сыворотки TRACP5b анализа на образцах сыворотки с использованием коммерческого доступного набора.
2. Экстракорпоральное остеокластов поколения от мыши BMMs
- Изоляция и культивирование BMMs
- Выделение берцовой и бедренной костей: Эвтаназии донорской мышь с CO 2, и дезинфицировать ноги с 70% этанола. Проанализируйте от лобковой кости к пяточной кости кости, удалить бедра и голени кости нетронутыми.
- Удалить кожу и мышцы осторожно, не повредив кость. Поместите обработанный бедра и голени кости в чашку Петри, содержащую забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
- Удаление костного мозга: Обрежьте кончик на одной стороне бедра и голени костей и промойте костный мозг в 50 мл трубки с помощью 1 мл шприц с 25 G иглы, загружается с α-MEM, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина (остеокластов Культура Средний / ОСМ).
- Культура макрофагов
- Граф клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
- Виброплиты 1 х 10 6 клеток на лунку для 6-луночный планшет или 3 х 10 5 клеток на покровных стеклах (5 мм) или дентина ломтиками, помещенных в 96-луночный планшет и инкубировать при 37 ° С
- Аспирируйте все носители, содержащие неприкрепленных клеток и инкубируют клетки при 37 ° С со свежим OCM (+), содержащей 25 нг / мл мыши M-CSF в течение 48 часов.
- Аспирируйте все носители и инкубировать клетки при 37 ° С со свежим OCM (+) носитель, содержащий 25 нг / мл мыши M-CSF, и 30 нг / мл мышиного sRANKL инициировать остеокластогенез. Пополнение СМИ каждые 3 дня по мере необходимости.
- Рост клетокдля примерно 6-8 дней, чтобы сформировать гигантские мульти-ядерные клетки, способные резорбции кости. Как только появляются многоядерные клетки, выполнить ловушке (тартратрезистентной кислой фосфатазы) окрашивания с использованием коммерческого доступного набора, и когда полностью созрел, выполнять функциональные анализы. Визуализация F-актин кольца на покровных использованием фаллоидином пятна и изображение клетки, прикрепленные к дентину ломтики с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), как описано выше 19.
3. Экстракорпоральное остеокластов поколения от человека МНПК
- Выделение человека МНПК
- Добавьте 10 мл подогретого Histopaque-1077 в 50 мл пробирку.
- Пустой лейкоцитов фильтр, полученный из банка крови стерильной PBS в 50 мл пробирку (1:1 соотношение крови с PBS). Слой разбавленной крови над Histopaque решения очень медленно, убедившись, что кровь не смешивается с Histopaque.
- Центрифуга образцов при 1000 х г в течение 20 мин при 18 ° С. СледоватьING центрифугирование, тщательно изолировать белый слой светлого сгустка, содержащий лейкоциты и переход к новой 50 мл пробирку.
- Развести клетки с PBS и центрифуги снова при 650 х г в течение 5 мин, чтобы собрать клетки.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в ОПК (-) СМИ и подсчета клеток с помощью счетчика клеток.
- Покрытие и Культивирование МНПК
- Ресуспендируют клеток в OCM (+) средства массовой информации и пластина 8 х 10 6 клеток / мл на лунку в 6-луночный планшет или 1 х 10 6 клеток / мл на лунку в 96-луночный планшет. Пластина клеток на покровных стеклах (5 мм) в соответствии с требованиями для иммунофлуоресценции изображений, а также на кусочки костей, пригодных для костной резорбции анализов, как описано выше 20.
- Изменение питательных сред, пополняя клетки с человеческой M-CSF каждые 2-3 дней или по мере необходимости. Затем переходите к дифференциации шаг на 5-й день, добавляя 30 нг / мл человеческого sRANKL вместе с 25 нг / мл человеческого M-CSF в ОПК (+) СМИ, чтобы инициировать osteoclastogenesесть.
- Рост клеток в течение примерно 14 до 21 дней, чтобы сформировать гигантские мульти-ядерных клеток. Как только появляются многоядерные клетки, эти клетки могут быть помечены для ловушка, и когда полностью созрел, функциональные пробы может быть выполнена. F-актина кольца могут быть визуализированы на покровных стеклах с использованием фаллоидином пятно. Морфология клеток могут быть рассмотрены в клетках, прикрепленных к дентину ломтики с помощью СЭМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь, методика переноса генов роман для дифференциации остеокластов в естественных условиях и протоколов культивирования клеток для дифференциации клеток-предшественников в остеокласты в пробирке, как способ изучения влияния цитокинов на остеокластогенеза описаны. На рисунке 1, представительные результаты успешного переноса гена GFP и мыши sRANKL MC у мышей показаны. На рисунке 2, представительные образы мыши костного мозга или человека РВМС клеточной дифференцировки время курса культур клеток-предшественников в остеокластов яркими микроскопии показаны. Рисунок 3, представительные изображения из трех независимых методов для характеристики костного мозга мыши, полученные остеокластов показаны . Присутствие мыши sRANKL активирует экспрессию TRAP (фиг.3А и В) и образование F-актина кольца (фиг. 3C и D). Сканирование элекэлектронной микроскопии (SEM) показывает, что мышь sRANKL индуцирует образование гигантских клеток, способных к резорбции кости (фиг. 3E и F). фигуре 4, те же методы характеристики по РВМС человека происходит остеокласты показаны.
Рисунок 1. SRANKL в естественных условиях ген-передачи приводит к увеличению остеокластогенеза. Передней вид A, B) мыши экспланты печени и С, D) целые тела изображений из 12-недельных C57BL / 6 самцов мышей вводили 5 мкг GFP или sRANKL MC ДНК. Стрелка указывает GFP выражение в естественных условиях в генной GFP передачи мыши. Мышей переноса генов RANKL служить без фоновой флуоресценции. Изображения с Маэстро 2 Imager, один день после передачи генов (красный и зеленый дenote фон и GFP, соответственно). Е) карта плазмиды sRANKL конструкции МС-ДНК и F) уровне sRANKL в сыворотке анализируемого в 1, 5 и 11 дней после GFP или sRANKL ген передачи. G) Мышь уровень сывороточного TRACP5b проанализированы 11 дней после GFP или sRANKL переноса генов. Масштабные полоски показывают 5 мм A, B, и 10 мм в C, D.
В остеокластогенеза в обоих мыши и систем культивирования клеток человека Рисунок 2. Пробирке. Ярко-поле микроскопия из мышиных клеток, выделенных из костного мозга и культивировали в присутствии 25 нг / мл мышиного M-CSF и 30 нг / мл мышиного sRANKL показывающий дифференциацию Время Конечно, в дни), 2 Б) 5 В и С) 8. Яркий поля микроскопия клеток человека, выделенныхиз периферической крови и культивировали в присутствии 25 нг / мл человеческого M-CSF и 30 нг / мл человеческого sRANKL, показывающий временной ход дифференциации в дней D), 4 E) 14 и F) 21. Масштабные полоски показывают 20 мкм.
Рисунок 3. Генерация и характеристика остеокластов мыши. TRAP окрашивание (розовый) из мышиных клеток, выделенных из костного мозга и культивировали в течение 6 дней в присутствии 25) нг / мл мышь M-CSF или B) 25 нг / мл M мышь -CSF и 30 нг / мл мышиного sRANKL. Фаллоидином (зеленый) и DAPI (синий) окрашивание клеток мыши, выделенных из костного мозга и культивировали в течение 8 дней в присутствии С) 25 нг / мл мышь M-CSF или D) 25 нг / мл мышь M-CSF и 30 нг / мл мышиного sRANKL, показывающую образование FaCTIN кольцо в многоядерные клетки. SEM микрофотографии клеток мыши, выделенных из костного мозга и культивировали в течение 8 дней в присутствии Е) 25 нг / мл мышь M-CSF или F) 25 нг / мл мышь M-CSF и 30 нг / мл мышиного sRANKL, показывающую образование резорбции кости области на как показано стрелками. Масштабные полоски показывают 40 мкм в нашей эры, и 30 мкм в Е, F.
Рисунок 4. Формирование и характеристика человека остеокластов. TRAP окрашивание (розовый) из клеток человека, выделенных из РВМС и культивировали в течение 15 дней в присутствии 25) нг / мл человеческого M-CSF или B) 25 нг / мл человеческого M- CSF и 30 нг / мл человеческого sRANKL. Фаллоидином (зеленый) и DAPI (синий) окрашивание клеток человека, выделенных из РВМС и культивируют в течение 19 дней в присутствии С) D) 25 нг / мл человеческого M-CSF и 30 нг / мл человеческого sRANKL, показывающую образование F-актина колец в многоядерных клеток. SEM микрофотографии клеток человека, выделенных из РВМС и культивировали в течение 18 дней в присутствии Е) 25 нг / мл человеческого M-CSF или F) 25 нг / мл человеческого M-CSF и 30 нг / мл человеческого sRANKL, показывающую образование резорбции областей на кости как показано стрелками. Масштабные полоски показывают 10 мкм в А, В, 20 мкм в С, D 15 мкм в Е, F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опорно-двигательного аппарата, являются основными причинами заболеваемости и инвалидности и состоят из более чем 150 заболеваний и синдромов; влияя на приблизительно 90 миллионов американцев сегодня. Воспаление суставов и разрушения кости являются преобладающими особенности опорно-двигательного аппарата, в том числе артрит и остеопороз. Остеопороз является состоянием, которое ослабляет целостность костей, что часто приводит к переломам костей. Артрит является хроническим, изнурительным заболевание, характеризующееся воспалением суставов, которые становятся опухшими, нежная и жесткая ограничивающих нормальное движение и может привести к инвалидности. Хотя патогенез заболеваний опорно-двигательного сильно отличается друг от друга, разрушение костной ткани является главной общей чертой. Разрушение кости в опорно-двигательного аппарата, прежде всего, вызвано дисбалансом между костной резорбции и формирования костной ткани 21,22. Один терапевтический подход, чтобы попытаться блокировать способность этих клеток, чтобы уничтожить кости
Естественных модель в описанный здесь использует minicircles, представляющие собой небольшие эписомные ДНК-векторы (~ 4kb) освобожденные от бактериальной позвоночника, что также служат в качестве трансгенных носителей 24. Minicircles выразить трансгены 10-1000 раз выше, чем обычно, бактериальных плазмид с стабильной экспрессии на срок до нескольких месяцев. Чем меньше размер молекул minicircles способствует более эффективному курсу трансфекции и существенного выражения сравнения с нормальными бактериальных плазмид 24. Поэтому minicircles в настоящее время широко применяется в доклинических исследований переноса генов 25,26. Гидродинамическая доставка хорошо развитая метод, основанный на гидродинамического давления в капиллярах, чтобы доставить ДНК плазмиды во все тело мыши. Гидродинамическая доставки генов в гепатоциты через инъекции в хвостовую вену мышей, хорошо разработана то выразить трансген по ДНК плазмиды 6. В этих исследованиях гиперэкспрессией мыши sRANKL в в естественных условиях мышиной модели достигается sRANKL МС и гидродинамической доставки через хвостовую вену инъекций. Мышь sRANKL ELISA может быть использован для обнаружения сывороточные уровни RANKL у мышей. Значительное повышение мыши сыворотки TRACP5b, в резорбции кости маркера 27, наблюдается в sRANKL мышей переноса генов. Следует отметить, что эта методика не ограничивается избыточной экспрессии sRANKL; он также может быть дополнительно применен к сверхэкспрессии другие секретируемые белки 28. Основная техническая сложность в этой процедуре является гидродинамическая доставка через хвостовую вену. Помимо регулярной инъекции в хвостовую вену, гидродинамическая доставка требуется доставку minicircles в больших объемах физиологического раствора в мышей в течение 5-7 сек. Таким образом, устойчивые обработки и нагнетательных методы имеют важное значение для успеха с этой процедурой. Создание sRANKL трансгенных мышей и другой подход для osteoc в естественных условияхlastogenesis. Тем не менее, высокий уровень sRANKL может привести к эмбриональной летальности 4 и генерации трансгенных мышей также дорого и отнимает много времени.
В OVX грызунах, оба воспалительные цитокины, такие как TNF, IL-1 и IL-6 и невоспалительные цитокинов sRANKL способствовать в естественных условиях остеокластогенеза и потери костной массы. sRANKL модель перенос генов приводит к избыточной экспрессии только невоспалительной цитокинов sRANKL. Таким образом, модель переноса генов sRANKL описано здесь предлагает исследователям мощный инструмент для изучения вклада оси RANKL-ранг в костной ткани при отсутствии воспаления.
Метод в пробирке остеокластов культура, которая включает в себя совместное культивирование клеток костного мозга и остеобласты, была создана в конце 1980-х до начала открытия RANKL в конце 1990-х 29,30. Рекомбинантный M-CSF и RANKL побудить остеокластов дифференциацию эффективно в пробиркей метод был описан ранее в других исследованиях 3,31. M-CSF как известно, стимулирует экспрессию ранга в ранних предшественников остеокластов 32 и действовать как фактор выживания для предшественников остеокластов и зрелых остеокластов 33. RANKL имеет важное значение для остеокластов дифференциации и активации 3. Здесь, метод остеокластогенеза в пробирке описано. Успешное культивирование и дифференциация клеток-предшественников в остеокластов требуют изоляции стерильную клеток и правильные методы металлизации, а также тщательное понимание урожая приурочен клеток. Рассчитано покрытие из ячеек имеет решающее значение, так как требует дифференциации остеокластов слияние клеток-предшественников остеокластов 34 и недостаточное количество клеток-предшественников остеокластов не будет способствовать слияние и дифференцировку клеток-предшественников остеокластов в. Аналогичным образом, избыточное количество клеток-предшественников остеокластов, приводит к образованию комков и в конечном итоге гибель клеток. Удаление нераспространении-прилипшие клетки 2 часа после посева клеток может помочь сохранить оптимальное число клеток. Наконец, время сбора урожая клеток очень важно, поскольку остеокластов неизлечимо дифференцированных короткоживущие клетки с продолжительностью жизни около 48 часов 35. Таким образом, клетки должны быть собраны в течение 48 часов после первого наблюдения многоядерные клетки. Эти клетки затем можно охарактеризовать ловушку и окрашивания F-актина с помощью иммуногистохимии и костную резорбцию активность может быть обнаружена методом сканирующей электронной микроскопии (SEM). Эти экспериментальные подходы позволяют четкое определение остеокластов в терминах их фенотипа и функции.
В естественных условиях и в пробирке методов, описанных здесь, будет способствовать развитию ингибиторов остеокластов в настоящее время в доклинических исследованиях, которые порождают эффективных терапевтических стратегий для миллионов остеопороза и больных артритом по всему миру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
