Introduction
근골격계 질환은 국가 및 지역 보건 시스템 1에 대한 미국과 현재의 심각한 결과에있는 사람들의 수백만에 영향을 미칩니다. 이 질환은 뼈의 손실과 광범위한 치료 및 회복의 오랜 기간을 필요로 관절 기능을 특징으로한다. 일반적으로, 파골 세포의 수 및 / 또는 활성의 상대적 증가는 세포가 골다공증, 뼈 재 흡수하도록 특수화 및 관절염이 관찰된다. 생리적 조건에서 파골 세포의 수와 활성을 골아 세포에 의해 생산되는 핵 인자 κ B-리간드 (RANKL)의 수용체 활성에 의해 조절된다. 게린 (OPG), RANKL에 대한 미끼 수용체는 조골 세포 (3)에 의해 생성되는 조직 sRANKL의 과발현 또는 OPG의 삭제를 포함하는 생체 내 동물 모델 골다공증 연구에 매우 유용합니다.; 그러나,이 방법은 형질 전환 마우스 4,5의 생성을 필요로합니다. 여기서, 새로운 대안근골격계 관련 질환의 연구 sRANKL를 과발현하는 방법이 설명된다. 특히, minicircle (MC) DNA 기술 및 유체 전달 방법은 생체 내에서 sRANKL의 유전자 전달을 달성하고 체계적으로 6 마우스 sRANKL를 과발현하는 데 사용되었습니다.
이 방법은 또한 낮은 칼슘 다이어트 (8)에 의해 난소 7식이 개입을 다음 파골 세포의 호르몬 변조 골다공증의 다른 생체 모델을 보완. 이 모델들은 수술 절차가 필요하고 상당한 비용 9에서 몇 달까지 걸릴 수 있습니다 그러나 근골격계 관련 질환의 다양한 측면을 연구하는 것은 매우 유용하다. 난소 절제 (OVX) 설치류 모델은 난소를 제거함으로써 인간의 폐경 후 골다공증 (10)을 흉내 낸 에스트로겐 결핍에 이르게 실험 동물 모델입니다. 인간의 폐경 후 골다공증, 에스트로겐 defici 조건ency은 골절의 위험이 증가로 연결 골다공증은 미국에서만 약 8 백만명의 여자에 영향을 미칩니다. OVX 모델은 폐경 후 골다공증에 유용하지만 그것은 일반적으로 골다공증을 연구하는 제한된 이점을 제공합니다. 에스트로겐 따라서 그것의 부재에서 증가 된 파골 세포 활성은 10-12을 관찰하고, 파골 세포 및 조골 세포 유도 세포 사멸을 억제함으로써, 골 손실을 억제한다. 골 흡수 호의 RANKL-OPG 비율 불균형도 13를 관찰된다. 성장 인자 β (TGF β의), 증가 된 인터루킨 12 (IL-12) 및 TNF, IL-1 및 IL-6 (14, 15)를 변형의 수준을 감소함으로써 그러나, 생체 내에서 에스트로겐 결핍도 수반한다. 이러한 사이토 카인은 RANKL 경로의 뼈 리모델링 조절 성 기능을 독립적 알고있다, 그것은 전적으로 RANKL-RANK 축에있는 파골 세포의 활성화를 속성 수 없다. 이 문서에 설명 된 모델은 비브에서 공부하는 연구자 수오 전 염증성 사이토 카인없이 파골 세포와 뼈 손실에 RANKL-RANK 축이 OVX 쥐 모델에 비해.
또한, 체외 파골 세포 기술은 근골격계 질환의 잠재적 인 치료 트리트먼트의 파골 세포의 활성을 연구하는 중요한 도구입니다. 이전 연구는 또한 마우스 대 식세포 집락 자극 인자 (M-CSF)와 마우스 sRANKL와 마우스 골수 유래 대 식세포 (BMMs)를 배양하는 파골 세포의 분화 3,16,17로 이어질 수있는 것으로 나타났습니다. 여기서, 마우스 골수로부터뿐만 아니라 체외 (18)에서 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC를)까지 다핵 파골 세포 - 유사 세포를 생성하는 프로토콜이 설명된다. 성숙한 말기 차별화 된 완벽한 기능 파골 세포를 정의하는 데 필요한 세포 기반 분석도 간략하게 설명되어 있습니다. 체외 기술은 생체 방식의 소설을 보완하고 함께 P 역할owerful 조사 도구는 파골 세포의 분화 및 활성화를 공부한다. 이러한 시스템을 사용하여, 과학자들은 생체 내 및 시험관 내에서 파골 세포 생성 및 증식 및 활성화에 필요한 자극 및 신호를 정의 할뿐만 아니라 약리학 적 및 생물학적 억제제의 효능을 시험 할 수있다.
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Protocol
sRANKL MC DNA의 1. 유체 역학 배달
- 마우스의 꼬리 정맥을 통해 유체 역학 배달
- 꼬리 정맥 주입하기 전에 마우스의 무게를. 마우스의 체중의 10 % ~의 총 부피에 sRANKL 또는 링거액에 녹색 형광 단백질 (GFP) MC (미리 따뜻한 37 ° C에서)를 희석.
- 혈관을 팽창하고 눈에 보이는 측면 혈관 (정맥 주사)를 확인하기 위해 주사 전에 10 분 동안 새장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다.
- 즉시 정맥 주사가 넓혀진 눈에 보이는대로, 제한 수단에 마우스를 전송하고 이동을 억제하는 통에 충분히 플러그를 삽입합니다. 같은 호흡으로 정상 활동에 마우스를 모니터링합니다. 필요한 경우 제한 기의 플러그를 조정합니다.
- 와이프 주류로 꼬리의 끝으로부터 주입 영역 3 / 4을 소독. 마우스 꼬리 정맥 주입을 위해 27 ~ 30 G 바늘을 사용합니다. 한 손으로 단단히 꼬리를 잡고있는 바늘을 삽입꼬리 정맥에. 주사기에 압력을 적용하고 5-7 초 내에 주입을 완료합니다.
- 꼬리 정맥에서 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 면봉으로 압력을 적용합니다. 호흡 속도가 정상 속도로 감소되면 다음 동식물 사육장에 다시 마우스를 전송, 15 ~ 30 분 동안 마우스를 모니터링합니다.
- 마우스 혈청 TRACP5b 포스트 유전자 전송의 전신 마우스 sRANKL 표현과 정량화의 확인
- 혈관을 팽창하고 정맥 주사를 볼 수 있도록하기 위해 5 ~ 10 분간의 장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다.
- 꼬리의 끝에서 앞으로 사이트 한 곳에서 마우스의 꼬리에 잎을 가진 작은 절개를합니다.
- 혈청 분리 튜브에 혈액의 약 100 μl를 수집합니다.
- 실온에서 30 분 동안 혈청 분리 튜브를 배양한다.
- 원심 분리기 5 분 10,000 XG에 샘플 및 혈청을 수집합니다. STOR추가 분석을 위해 -80 ° C에서 E 세럼.
- 상용 가능한 키트를 사용하여 혈청 샘플에 sRANKL ELISA와 마우스 혈청 TRACP5b 분석을 수행합니다.
마우스 BMMs 2. 체외 파골 세포 생성
- 분리 및 BMMs의 배양
- 경골과 대퇴골 뼈의 분리 : CO 2 기증자 마우스를 안락사, 70 % 에탄올로 다리를 소독. 그대로 대퇴골과 경골 뼈를 제거하기 위해, 종골 뼈에 치골에서 해부.
- 뼈를 손상시키지 않고 조심스럽게 피부와 근육을 제거합니다. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 포함하는 배양 접시에서 처리 대퇴골과 경골 뼈를 놓습니다.
- 골수 제거 : 대퇴골과 경골 뼈의 한쪽 끝을 잘라 및 α-MEM은 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는로드 25 G 바늘을 1 ㎖ 주사기를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 골수를 플러시 (파골 세포 배양액 / OCM).
- 대 식세포의 문화
- 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 96 - 웰 플레이트에 넣고 37 ℃에서 부화 유리 커버 슬립 (5 ㎜) 또는 상아질 조각에 6 잘 판 3 × 10 5 세포를 잘 당 플레이트 1 X 10 6 세포
- 기음 비 부착 세포를 포함하는 48 시간 동안 25 NG / ML 마우스 M-CSF를 포함하는 신선한 OCM (+)와 37 ° C에서 세포를 품어 모든 미디어.
- 25 NG / ML 마우스 M-CSF 및 파골 세포를 시작하는 30 NG / ML 마우스 sRANKL를 포함 기음 모든 미디어와 신선한 OCM으로 37 ° C에서 세포를 배양 (+) 미디어. 필요에 따라 매 3 일마다 미디어를 보충.
- 세포 성장약 6~8일 뼈를 resorbing 할 수있는 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 필요한 권한입니다. 즉시 다핵 세포가 나타날 때, 상용 가능한 키트를 사용하여 염색 TRAP (주석 산염 저항하는 산성 인산 가수 분해 효소)를 수행하고, 완전히 성숙 할 때, 기능 분석을 수행합니다. phalloidin도 스테인 및 이미지 (19) 이전에 설명한 바와 같이 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 슬라이스 상아질 부착 세포를 이용하여 커버 슬립에 F-액틴 링 시각화.
인간 PBMC를 3. 체외 파골 세포 생성
- 인간 PBMC를의 분리
- 50 ㎖ 튜브에 미리 예열 Histopaque-1077의 10 ML을 추가합니다.
- 빈 백혈구 필터는 50 ML 튜브 (PBS와 혈액의 1:1 비율)로 멸균 PBS와 혈액 은행에서 얻을. 혈액이 histopaque와 혼합하지 않도록하고, 아주 천천히 histopaque 용액에 희석 된 혈액을 레이어.
- 18 ° C에서 20 분 1000 XG에 원심 분리기 샘플 따라원심 분리를하여 보내고, 정중 백혈구 함유 백색 버피 코트 층을 분리하고 50 ㎖의 새로운 튜브로 옮긴다.
- 세포를 수집하는 5 분 650 XG에 다시 PBS와 원심 분리기로 세포를 희석.
- 미디어 및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산 (-) OCM에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다.
- PBMC를 도금 및 배양
- OCM에있는 세포를 재현 탁 (+) 미디어 판 (8) × 10 / ㎖ 당 잘 6 잘 플레이트 또는 1 X 10 6 세포 / ㎖ 당 잘 96 - 웰 플레이트에있는 6 개의 세포. 로 면역 형광 이미징뿐만 아니라 골 흡수 분석에 적합한 뼈 조각에 대한 필요에 따라 유리 커버 슬립 (5 ㎜)에 플레이트 세포는 이전에 (20)을 설명했다.
- 변경 배양액 인간 M-CSF 2-3 일마다 또는 필요에 따라 세포를 보충. 그런 osteoclastogenes을 시작 OCM (+) 미디어 25 NG / ML 인간의 M-CSF와 함께 인간의 sRANKL 30 겨 / ㎖를 추가하여 5 일에 분화 단계로 진행이다.
- 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 약 14-21일에 세포를 성장. 마자 다핵 세포가 나타나는 바와 같이, 이들 세포는 TRAP 표지 할 수 있고, 완전히 성숙 할 때, 기능적 분석법이 수행 될 수있다. F-액틴 링은 phalloidin도 얼룩을 사용하여 커버 슬립에 시각화 할 수 있습니다. 세포 형태는 SEM에 의해 조각을 상아질에 부착 된 세포에서 검사 할 수 있습니다.
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Representative Results
여기서, 파골 세포에 대한 사이토 카인의 효과를 연구하기위한 방법으로 체외로 파골 전구 세포 분화에 대한 생체 내 및 세포 배양 프로토콜에서 파골 세포의 분화를위한 신규 한 유전자 전달 기술이 설명된다. 그림 1에서, 마우스에있는 GFP 마우스 sRANKL MC의 성공적인 유전자 전달의 대표적인 결과가 표시됩니다. 그림 2에서, 마우스의 골수 또는 시야 현미경에 의한 파골 세포에 전구 세포의 인간 PBMC 세포 분화 시간 코스의 문화를 대표하는 이미지가 표시됩니다. 그림 3, 마우스 골수 유래 파골 세포의 특성을 세 가지 독립적 인 방법의 대표 이미지가 표시됩니다 . 마우스 sRANKL의 존재는 TRAP의 표현 (그림 3A와 B)와 F-액틴 링 (그림 3 C와 D)의 형성을 활성화합니다. 스캔 ELEC트론 현미경 (SEM)을 마우스 sRANKL 뼈 (그림 3 E와 F)를 resorbing 할 수있는 거대 세포의 형성을 유도하는 것을 알 수있다. 그림 4, 인간 PBMC에서 동일한 특성 방법은 파골 세포가 표시되는 파생.
그림 1. sRANKL 생체 내 유전자 전달이 증가 파골 세포에 이르게한다.의 전방보기, B) 마우스 간 외식 및 C, D)는 12 주령 C57BL / 6 수컷 마우스의 전신 이미지는 GFP 또는 sRANKL 5 μg을 주사 MC DNA. 화살표는 GFP의 유전자 전달 마우스 생체 내에서 GFP 발현을 나타냅니다. RANKL 유전자 전사 생쥐없이 배경 형광 역할. 마에스트로 2 이미 저, 하루 게시물 유전자 전송 (빨강과 녹색 D로 캡처 한 이미지enote 배경 각각 GFP). E) 플라스미드 1, 5에서 분석 혈청 sRANKL MC-DNA 구조 및 F) sRANKL 수준의지도 11 일 GFP를 게시하거나 sRANKL의 유전자 전달. G) 마우스 혈청 TRACP5b 수준 십일일 분석 GFP 또는 sRANKL 유전자 전달 후. 스케일 바는 A, B 5 ㎜, C, D. 10 ㎜를 나타냅니다
마우스와 인간의 세포 배양 시스템 모두 그림 2. 체외 파골 세포. 차별화를 보여주는 25 NG / ML 마우스 M-CSF 30 NG / ML 마우스 sRANKL의 존재의 골수에서 분리, 배양 마우스 세포의 밝은 필드 현미경 일의 시간 코스 A), 2 B) (5), C) 8. 고립 된 인간의 세포의 시야 현미경말초 혈액 25 NG / ML 인간의 M-CSF와 일 D에서 차별화 시간의 과정을 보여주는 30 NG / ML 인간 sRANKL), 4 E) (14), 및 F) 21의 존재 양식에서. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다.
그림 3. 생성 및 마우스 파골 세포의 특성 골수에서 고립의 존재 6 일간) 동안 배양 마우스 세포의. TRAP 염색 (핑크) 25 NG / ML 마우스 M-CSF 또는 B) 25 NG / ML 마우스 M -CSF 30 NG / ㎖ 마우스 sRANKL. Phalloidin의 (녹색) 및 골수에서 분리 및 C의 존재 8 일) : 25 NG / ML 마우스 M-CSF 또는 D) 25 NG / ML 마우스 M-CSF 30 NG에게 배양 한 마우스 세포의 DAPI (파란색) 염색 빠의 형성을 보여주는 / ㎖ 마우스 sRANKL다핵 세포 CTIN 반지. 골수와 E의 존재 8 일간 배양) 25 NG / ML 마우스 M-CSF 또는 F)의 형성을 보여주는 25 NG / ML 마우스 M-CSF 30 NG / ML 마우스 sRANKL에서 고립 된 마우스 세포의 SEM 현미경 사진 화살표로 표시된 바와 같이 뼈에 흡수 영역. 스케일 바는 AD 40 μm의를 나타내고, E, F.에 30 μm의
의 존재에 15 일 동안 PBMC를 배양에서 분리 된 인간의 세포)의 그림 4. 생성 및 인간 파골 세포의 특성. TRAP 염색 (핑크) 25 NG / ML 인간의 M-CSF 또는 B) 25 NG / ML 인간의 M- CSF 30 NG / ML 인간 sRANKL. Phalloidin의 (녹색)과 DAPI (파란색) C의 존재의 19 일 PBMC에서 분리, 배양 인간 세포의 염색) D) 다핵 세포의 F-액틴 링의 형성을 보여주는 25 NG / ML 인간의 M-CSF 30 NG / ML 인간 sRANKL. E의 존재의 18 일 PBMC에서 분리, 배양 인간의 세포)의 SEM 현미경 사진은 25 NG / ML 인간의 M-CSF 또는 F) 25 NG / ML 인간의 M-CSF 30 NG / ML 인간 sRANKL 흡수의 형성을 보여주는 화살표로 표시된 바와 같이 뼈 영역에. 스케일 바는 E, F.에서 C, D 15 μm의 20 μm의, A, B에 10 μm의를 나타냅니다
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Discussion
근골격계 조건은 병적 상태와 장애의 원인을 선도하고 150 개 이상의 질병 및 증후군 구성되어 있습니다; 현재 약 90 만 명의 미국인에 영향을 미치는. 관절 염증 및 골 파괴는 관절염과 골다공증 등의 근골격 조건의 주된 기능이다. 골다공증은 주로 뼈의 골절로 이어지는 뼈의 무결성을 약화 조건이다. 관절염은 부어, 부드럽고 뻣뻣한 제한 정상적인 운동이되어 장애로 이어질 수있는 관절의 염증을 특징으로 질병을 쇠약, 만성입니다. 근골격계 질환의 발병이 크게 서로 다르지만, 골 파괴가 무엇보다 중요한 일반적인 기능입니다. 근골격계 조건에서 뼈 파괴는 주로 골 흡수와 골 형성 (21, 22) 사이의 불균형에 의해 발생합니다. 한 치료 방법은 뼈를 파괴하는 이들 세포의 능력을 차단하도록 시도하는 것이다
여기에 설명 된 생체 내 모델은 유전자 캐리어 (24)의 역할을 박테리아 백본에서 해방 작은 에피 솜 DNA 벡터 (~ 4킬로바이트)입니다 minicircles를 사용합니다. Minicircles는 몇 개월까지의 안정된 표정으로 일반 세균의 플라스미드 그 후에 배 높은 형질 전환 유전자 10-1,000을 표현한다. minicircles의 작은 분자 크기보다 효율적인 형질 전환 속도와 실질적인 표현 일반 세균의 플라스미드 (24)에 비교에 기여한다. 따라서 minicircles은 널리 전 임상 유전자 전달 연구 (25), (26)에 적용됩니다. 유체 전달은 마우스의 몸 전체에 플라스미드 DNA를 전달하는 모세 혈관의 유체 압력에 따라 잘 발달 된 방법입니다. 생쥐의 꼬리 정맥 주입을 통해 간세포에 유체 역학 유전자 전달 노포 t이다오 플라스미드 DNA (6)에 의해 형질 전환 유전자를 표현한다. 이 연구에서 생체 내 마우스 모델에서 마우스 sRANKL를 과발현은 sRANKL MC와 꼬리 정맥 주사를 통해 유체 전달에 의해 달성된다. 마우스 sRANKL ELISA는 마우스에서 RANKL의 혈청 수준을 검출하는데 사용될 수있다. 마우스 혈청 TRACP5b, 골 흡수 마커 (27)의 현저한 상승을 sRANKL 유전자 전달 마우스에서 관찰된다. 특히,이 기술은 sRANKL 과발현에 한정되지 않는다; 또한 더욱 다른 분비 된 단백질을 28 과발현에 적용될 수있다. 이 절차의 주요 기술적 인 어려움은 꼬리 정맥을 통해 유체 전달합니다. 외에 정규 꼬리 정맥 주입의, 유체 전달은 5-7 초 내에 마우스에 생리 솔루션 대량의 minicircles의 전달이 필요합니다. 따라서, 안정적인 처리 및 사출 기술이 절차와 성공을 위해 필수적입니다. sRANKL 형질 전환 마우스를 생성하는 것은 생체 osteoc에 대한 또 다른 접근 방식이다lastogenesis. 그러나 sRANKL의 높은 수준은 배아 치사 4로 이어질 수 있으며, 트랜스 제닉 마우스를 생성하는 것은 또한 비용과 시간이 걸린다.
OVX 설치류 모델에서 염증과 같은 TNF, IL-1 및 IL-6와 같은 사이토 카인 및 비 - 염증성 사이토킨 sRANKL 모두 생체 내 파골 세포 및 골 손실에 기여한다. sRANKL 유전자 전달 모델은 비 - 염증성 사이토킨 sRANKL의 과잉 발현에 이르게한다. 따라서, 여기에 설명 sRANKL 유전자 전달 모델은 연구자에게 염증의 부재하에 뼈 리모델링에서 RANKL-RANK 축의 포스팅을 조사하는 강력한 도구를 제공한다.
공동 배양 골수 세포와 조골 세포를 포함하는 생체 파골 세포의 배양 방법은, 이전의 1990 년대 후반 (29, 30)에서 RANKL의 발견으로 1980 년대 후반에 설립되었습니다. 재조합 M-CSF와 RANKL이 파골 세포의 분화를 유도 효율적으로 체외ND 방법은 이전에 다른 연구 3,31 설명되었다. M-CSF는 초기 파골 세포의 전구 물질 32 RANK의 발현을 촉진하고, 파골 세포 전구체와 성숙한 파골 세포 (33)의 생존 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있습니다. RANKL은 파골 세포의 분화 및 활성화 3 필수적이다. 여기서, 파골 세포의 시험 관내 방법이 설명된다. 파골 세포에 성공적으로 배양하고 전구 세포의 분화는 무균 세포 분리 및 적절한 도금 기술뿐만 아니라 일정 시간 세포 수확의주의 깊은 이해를 필요로합니다. 파골 세포의 분화를 파골 세포 전구 세포 (34)의 융합이 필요하며 파골 세포 전구 세포의 수가 불충분으로 파골 세포 전구 세포의 융합 및 분화를 촉진하지 않으므로 셀 계산치 도금이 중요하다. 마찬가지로, 파골 세포 전구 세포의 과량의 수는, 형성 및 최종 세포 죽음을 덩어리에 이르게한다. 비의 제거세포를 도금 후 부착 세포를 2 시간은 최적의 세포 수를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 파골 세포는 약 48 시간 (35)의 수명 말기 차별화 된 단명 한 세포이기 때문에 마지막으로, 세포 수확의 시간이 매우 중요합니다. 따라서, 세포가 다핵 세포의 첫번째 관찰 후 48 시간 이내에 수확한다. 이러한 세포는 면역 조직 화학 및 골 흡수 활성이 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 검출 될 수 의한 TRAP 및 F-액틴 염색을 특징으로 할 수있다. 이 실험 방법은 표현형과 기능의 측면에서 파골 세포의 명확한 정의를 가능하게한다.
생체 및 여기에 설명 된 체외 기법은 전 세계적으로 골다공증과 관절염 환자의 수백만을위한 효과적인 치료 전략에 이르는, 현재 전 임상 연구에서 파골 세포 억제제의 개발을 촉진 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
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