Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

רומן Published: June 8, 2014 doi: 10.3791/51810
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 2, 3, 1,2
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

Introduction

מחלות השלד והשרירים משפיעות על מיליוני אנשים בארצות הברית וההשלכות חמורות בהווה למערכות בריאות מקומיות וארציות 1. הפרעות אלו מתאפיינות באובדן העצם ותפקוד מפרקים הדורשים טיפול מקיף ותקופות של התאוששות ארוכות. בדרך כלל, גידול יחסי במספר ו / או הפעילות של osteoclasts, תאים מתמחים לנספגים שוב עצם, באוסטיאופורוזיס ובדלקת מפרקים שהוא ציין 2. בתנאים פיסיולוגיים במספר ובפעילות של osteoclasts מוסדר על ידי מפעיל הקולטן של הגורם הגרעיני κ-B ליגנד (RANKL), אשר מופק על ידי אוסטאובלסטים. Osteoprotegerin (OPG), קולטן דמה לRANKL מיוצר גם על ידי osteoblasts 3 בvivo מודלים של בעלי חיים הכרוכים בביטוי יתר מערכתי של sRANKL, או מחיקה של OPG יקרים מאוד במחקר באוסטאופורוזיס.; עם זאת, שיטות אלו דורשות הדור של עכברים הטרנסגניים 4,5. כאן, אלטרנטיבה רומןשיטה של ​​overexpressing sRANKL לחקר הפרעות הקשורות לשרירים ושלד מתואר. באופן ספציפי, minicircle (MC) טכנולוגיית ה-DNA ושיטות משלוח הידרודינמית שימשו כדי להשיג העברת גנים של sRANKL in vivo ו overexpress עכבר sRANKL מערכתי 6.

שיטה זו היא גם משלימה in vivo מודלים אחרים לאוסטאופורוזיס, כגון אפנון הורמונלי של osteoclasts הבא ovariectomy 7 והתערבות תזונתית על ידי דיאטה דל בסידן 8. מודלים אלה הם מאוד שימושיים כדי ללמוד היבטים שונים של הפרעות הקשורות לשלד ושרירים עם זאת הם דורשים ניתוחים ועשויים להימשך עד מספר חודשים, במחיר משמעותי 9. מודל מכרסם ovariectomized (OVX) הוא מודל חיה ניסיוני שבו הסרת השחלות גורמת למחסור באסטרוגן ובכך מחקה אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אדם 10. אוסטיאופורוזיס בגיל הבלות אדם, מצב שבו defici אסטרוגןency מוביל לסיכון מוגבר לשברים בעצמות ובריחת סידן משפיעה על כשמונה מיליון נשים בארצות הברית לבדה. למרות שמודל OVX שימושי לאוסטיאופורוזיס בגיל הבלות הוא מציע יתרונות מוגבלים בלימוד אוסטאופורוזיס באופן כללי. אסטרוגן מדכא את איבוד מסת עצם, על ידי גרימת osteoclast ועיכוב אפופטוזיס osteoblast, ולכן בהעדרה פעילות osteoclast המוגבר הוא ציין 10-12. חוסר איזון יחס RANKL-OPG שמעדיף ספיגת עצם הוא ציין גם 13. עם זאת, מחסור באסטרוגן in vivo מלווה גם בירידה ברמות של הפיכת β גורם גדילה (β TGF), גדל אינטרלויקין 7 (IL-7) וTNF, IL-1 ו-IL-6 14,15. כציטוקינים אלה ידועים פונקציות ויסות שיפוץ עצם בלתי תלויות במסלול RANKL, אי אפשר לייחס כל הפעלת osteoclast אך ורק על ציר RANKL-RANK. המודל המתואר במאמר זה מאפשר לחוקרים ללמוד ביוo ציר RANKL-RANK בosteoclastogenesis ואובדן עצם ללא הפרו ציטוקינים דלקתיים בהשוואה למודלים של מכרסמים OVX.

בנוסף, טכניקות osteoclastogenesis במבחנה הן כלים חיוניים ללמוד הפעלת osteoclast לטיפולי פוטנציאל טיפוליים של מחלות השלד והשרירים. גם מחקרים קודמים הראו כי culturing מקרופאגים מח עצם עכבר נגזרים (BMMs) עם גורם מקרופאג העכבר מגרה מושבה (M-CSF) והעכבר sRANKL יכול להוביל לבידול osteoclast 3,16,17. הנה, את הפרוטוקולים כדי לייצר תאים כמו osteoclast-multinucleated ממח העצם של עכבר, כמו גם מהתאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) במבחנה 18 מתוארים. מבחני מבוססי התאים נדרשים להגדיר osteoclast הבדיל סופני ומתפקד באופן מלא בשלה גם מתוארים בקצרה. במבחנה טכניקות אלה משלימים את הרומן בגישת vivo ויחד לשמש pכלי החקירה owerful ללמוד בידול osteoclast והפעלה. שימוש במערכות אלה, מדענים מסוגלים לייצר osteoclasts in vivo ו במבחנה ולהגדיר את הגירויים ואותות הנדרשים להפצה וההפעלה שלהם, כמו גם לבחון את היעילות של מעכבים תרופתיים וביולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. משלוח הידרודינמית של sRANKL MC-DNA

  1. משלוח הידרודינמית דרך וריד זנב עכבר
    1. לשקול את העכבר לפני ההזרקה לוריד זנב. לדלל sRANKL או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) MC בפתרון של רינגר (טרום חם על 37 מעלות צלזיוס) בהיקף כולל של ~ 10% ממשקל גופו של העכבר.
    2. לחמם את העכבר בכלוב עבור 10 דקות לפני ההזרקה כדי מרחיב את כלי דם ולהפוך את הוורידים לרוחב (LVS) נראים לעין. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה.
    3. ברגע שהם LVS מורחבים ונראה לעין, להעביר את העכבר לעוצר ולהכניס את התקע רחוק מספיק לתוך החבית לרסן את התנועה. לפקח על העכבר לפעילות רגילה כגון נשימה. התאם את התקע של עוצר במידת צורך.
    4. לחטא את אזור ההזרקה 3/4 מקצה הזנב עם אלכוהול לנגב. שימוש במחט G 27-30 להזרקה לוריד זנב עכבר. החזק את הזנב בחוזקה ביד אחת ולהכניס את המחט בלוריד הזנב. להפעיל לחץ על המזרק ולהשלים את הזריקה בתוך 5-7 שניות.
    5. הסר את המחט מוריד הזנב ולהפעיל לחץ עם כדור צמר גפן באתר ההזרקה כדי לעצור את הדימום. לפקח על העכבר ל15-30 דקות, ולאחר מכן להעביר את העכבר בחזרה לביבר פעם אחת את קצב הנשימה מצטמצם לשיעור הרגיל שלו.
  2. אישור על ביטוי sRANKL המערכתי מאוס והכימות של העברת עכבר סרום TRACP5b ההודעה ג'ין
    1. לחמם את העכבר בכלוב ל5-10 דק כדי מרחיב את כלי דם ולגרום LVS גלוי. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה.
    2. לעשות חתך קטן עם להב לזנבו של העכבר באתר אחד אחורה מקצה הזנב.
    3. לאסוף כ 100 μl דם בצינורות הפרדה בסרום.
    4. דגירה צינורות הפרדת סרום בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
    5. צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות ולאסוף בסרום. Storסרום דואר ב-80 ° C לניתוח נוסף.
    6. בצע sRANKL ELISA וassay TRACP5b סרום עכבר על דגימות סרום באמצעות ערכה זמינה מסחרית.

2. דור Osteoclast במבחנה מBMMs מאוס

  1. בידוד וCulturing של BMMs
    1. בידוד של השוקה ועצמות ירך: להרדים את עכבר התורם עם CO 2, ולחטא את הרגליים עם 70% אתנול. לנתח מעצם הערווה עד עצם calcaneus, כדי להסיר את עצמות ירך ושוקה בשלמותה.
    2. הסר את העור ושרירים בזהירות מבלי לפגוע בעצמות. הנח עצם ירך ועצם שוקה מעובד בצלחת פטרי המכילה בופר פוספט (PBS).
    3. ההסרה של מח עצם: חותכים את הקצה בצד אחד של עצמות הירך ושוקה ולשטוף את מח העצם לתוך צינור 50 מיליליטר באמצעות מזרק 1ml עם מחט 25 G, עמוס α-ממ המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Osteoclast התרבות בינונית / OCM).
  2. תרבות של המקרופאגים
    1. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי.
    2. צלחת 1 x 10 6 תאים לכל גם לצלחת 6 היטב או 3 x 10 5 תאים לcoverslips זכוכית (5 מ"מ) או פרוסות הדנטין להציב צלחת 96 היטב ולדגור על 37 ° C.
    3. לשאוב את כל אמצעי התקשורת המכילה תאים שאינם חסיד ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה עכבר 25 ng / ml M-CSF ל48 שעות.
    4. תקשורת לשאוב את כל התקשורת ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה M-CSF עכבר 25 ng / ml, ו30 sRANKL עכבר ng / ml ליזום osteoclastogenesis. לחדש את התקשורת בכל 3 ימים, כנדרש.
    5. לגדל תאיםכ 6-8 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק מסוגלים resorbing עצם. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, לבצע מלכודת (phosphatase חומצה עמיד tartrate) מכתים באמצעות ערכה זמינה מסחרית, וכאשר התבגרו באופן מלא, לבצע מבחני תפקודיים. דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin ותמונה מצורפים לתאים הדנטין פרוסות ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) כפי שתואר לעיל 19.

3. דור Osteoclast במבחנה מPBMCs האדם

  1. בידוד של PBMCs האדם
    1. הוסף 10 מיליליטר של Histopaque-1077 מראש חימם לתוך צינור 50 מיליליטר.
    2. מסנן ויקוציטים ריק המתקבל מבנק דם עם PBS סטרילי לתוך צינור 50 מיליליטר (1:1 יחס של דם עם PBS). שכבת הדם המדולל על פתרון Histopaque לאט מאוד, ולוודא כי הדם לא לערבב עם Histopaque.
    3. צנטריפוגה דגימות XG 1000 עבור 20 דקות ב18 ° C. לעקובing צנטריפוגה, לבודד בזהירות את שכבת מעיל באפי הלבנה המכילה את תאי דם הלבנים ולהעביר לצינור מיליליטר 50 חדש.
    4. לדלל תאים עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב650 XG במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.
    5. הסר supernatant ותאי resuspend ב OCM (-) תקשורת ולספור תאים באמצעות דלפק תא.
  2. ציפוי וCulturing PBMCs
    1. תקשורת resuspend תאי OCM (+) וצלחת 8 x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת או 1 6 גם x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת 96 היטב. פלייט תאים על coverslips זכוכית (5 מ"מ), כנדרש להדמית immunofluorescence כמו גם על פרוסות עצם מתאימות עבור מבחני ספיגת עצם כפי שתוארו לעיל 20.
    2. מדיה שינוי תרבות, חידוש התאים עם M-CSF האנושי כל 2-3 ימים או כפי שנדרש. לאחר מכן להמשיך לשלב בידול ביום 5 על ידי הוספת 30 / מיליליטר ng של sRANKL האנושי יחד עם 25 M-CSF ng / ml אדם בOCM (+) תקשורת ליזום osteoclastogenesהוא.
    3. לגדל תאים לכ 14-21 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, אז יכולים להיות שכותרתו תאים אלה למלכודת, וכשהתבגרו באופן מלא, ניתן לבצע מבחני תפקודיים. ניתן דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin. המורפולוגיה של התאים ניתן לבדוק בתאים מצורפים הדנטין פרוסות ידי SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, בטכניקת העברת גנים חדשים לבידול של osteoclasts in vivo ופרוטוקולי תרבית תאים להפרדת תאים מבשר לosteoclasts במבחנה, כמו שיטה כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על osteoclastogenesis מתוארות. באיור 1, תוצאות הנציג של העברת גנים המוצלחת של ה-GFP ועכבר sRANKL MC בעכברים מוצגות. באיור 2, התמונות מייצגות של מח עצם עכבר או תרבויות אנושיות PBMC התמיינות תאים כמובן זמן של תאים מבשר לosteoclasts על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר מוצגות. איור 3, תמונות מייצגות משלוש שיטות עצמאיות לאפיון osteoclasts מקורם במח עצם עכבר מוצגות . נוכחותו של עכבר sRANKL מפעילה את הביטוי של מלכודת (3A דמויות ו-B) והיווצרות של טבעות ה-F-אקטין (3C דמויות ו-D). elec סריקהמיקרוסקופיה טרון (SEM) מגלה כי העכבר sRANKL גורם להיווצרות של תאים ענק מסוגלים resorbing עצם (3E דמויות ו-F). איור 4, באותן שיטות האפיון על PBMC אדם נגזרות osteoclasts מוצג.

איור 1
איור 1. SRANKL in vivo גן ההעברה מובילה לosteoclastogenesis המוגבר. תצוגה קדמית של A, B) explants כבד העכבר וC, D) תמונות של כל גוף של C57BL / 6 עכברי זכרים 12 שבועות ישנים הוזרקו 5 מיקרוגרם של ה-GFP או sRANKL MC-DNA. החץ מצביע על הביטוי של GFP in vivo בעכבר העברת גני ה-GFP. עכברי העברת גני RANKL לשמש אין הקרינה רקע. תמונות שנתפסו על ידי המאסטרו 2 Imager, יום אחד לאחר גן ההעברה (ד האדום והירוקרקע enote וה-GFP, בהתאמה). מפת E) פלסמיד של מבנה sRANKL MC-DNA ורמת F) sRANKL בסרום נותח בבית 1, 5 ו -11 ימי הודעת GFP או רמת TRACP5b סרום העברת גני sRANKL. G) מאוס ניתחה 11 ימים לאחר העברת גן GFP או sRANKL. ברים סולם מצביעים על 5 מ"מ, B ו 10 מ"מ ב-C, ד '

איור 2
osteoclastogenesis איור 2. במבחנה בשני מערכות תרבית תאים אנושיות בעכבר ו. מיקרוסקופ שדה בהיר של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית בנוכחות 25 ng / ml עכבר M-CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml מראה בידול כמובן זמן בימים), 2 ב ') 5, ו-C) 8. מיקרוסקופ שדה הבהיר של תאים אנושיים מבודדיםמהדם ותרבית בנוכחות של 25 ng / ml M-CSF האדם ו30 sRANKL ng / ml האדם מראה כמובן זמן התמיינות בD ימים), 4 E) 14, ו-F) 21 היקפיים. ברים סולם מצביעים 20 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. דור ואפיון של osteoclasts עכבר. מכתים TRAP (ורוד) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 6 ימים בנוכחות) 25 עכבר ng / ml M-CSF או B) עכבר 25 ng / ml M -CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (הכחול) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות C) ng 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר עכבר או D) / מיליליטר עכבר sRANKL מראה את היווצרות פאטבעת ctin בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות ה ') 25 ng / M-CSF עכבר מיליליטר או F) sRANKL 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 עכבר ng / ml מראה את היווצרות אזורי ספיגה בעצמות כפי שמצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 40 מיקרומטר בספירה, ו30 מיקרומטר בE, F.

איור 4
איור 4. דור ואפיון של osteoclasts האנושי. מכתים TRAP (ורוד) של תאים אנושיים מבודדים מPBMCs ותרבותית ל15 ימים בנוכחות) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר או B) 25 ng / ml אדם M- CSF ו30 sRANKL אדם ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (כחולה) של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל19 ימים בנוכחות C) D) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 ng / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של טבעות ה-F-אקטין בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל18 ימים בנוכחות ה ') ng 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר אדם או F) / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של ספיגה אזורים על עצם כפי שצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 10 מיקרומטר בA, B, 20 מיקרומטר ב-C, 15 D מיקרומטר בE, F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תנאי השלד והשרירים מובילים גורמים לתחלואה ונכות ומורכבים של מעל 150 מחלות ותסמונות; המשפיע על כ -90 מיליון אמריקאים היום. דלקת מפרקים והרס עצם הם תכונות העיקריות של תנאים שרירי שלד, הכוללים דלקת מפרקים ואוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס היא מחלה שמחלישה את שלמות עצם, לעתים קרובות מוביל לשברים בעצמות. דלקת פרקים הוא מחלה כרונית, מתישה מחלה המאופיינת בדלקת המפרקים שהפכו נפוח, רך ותנועה נורמלית הגבלה-נוקשה ויכולים לגרום לנכות. למרות פתוגנזה של מחלות שרירים ושלד שונה מאוד אחד מהשני, הרס עצם הוא התכונה משותפת העל. הרס עצם בתנאי השלד והשרירים נגרמת בעיקר על ידי חוסר איזון בין ספיגת עצם ויצירת עצם 21,22. גישה טיפולית אחת היא לנסות ולחסום את היכולת של תאים אלה להרוס את העצם in vivo ו במבחנה.

מודל vivo במתואר כאן משתמש minicircles, שהם וקטורים קטנים episomal ה-DNA (~ 4KB) משוחררים מעמוד השדרה בקטריאלי, המשרתים גם כנשאי transgene 24. Minicircles להביע transgenes 10-1,000 קיפול גבוה אז פלסמידים חיידקים נורמלים עם ביטוי יציב לתקופה של עד מספר חודשים. הגודל המולקולרי הקטן יותר של minicircles תורם לשיעור יעיל יותר transfection וביטוי משמעותי בהשוואה לפלסמידים חיידקים נורמלים 24. לכן, minicircles כעת מיושם באופן נרחב במחקרי העברת גנים טרום קליני 25,26. משלוח הידרודינמית הוא שיטה מפותחת המבוססת על לחץ הידרודינמית בנימים כדי לספק DNA פלסמיד לכל הגוף של עכבר. מסירת גן הידרודינמית לhepatocytes באמצעות הזרקה לוריד זנב בעכברים היא לא מבוסס היטבo להביע transgene ידי פלסמיד דנ"א 6. במחקרים אלה, ביתר עכבר sRANKL בin vivo במודל העכבר מושגת על ידי sRANKL MC ומשלוח הידרודינמית באמצעות זריקות וריד זנב. עכבר sRANKL ELISA יכול לשמש כדי לזהות רמות בסרום של RANKL בעכברים. העלאה משמעותית של TRACP5b עכבר סרום, סמן ספיגת עצם 27, הוא ציין בעכברי העברת גני sRANKL. יש לציין, טכניקה זו אינה מוגבלת לביטוי יתר של sRANKL; זה יכול להיות מיושם גם בהמשך לביטוי יתר חלבונים מופרשים אחרים 28. הקושי הטכני העיקרי בהליך זה הוא המשלוח הידרודינמית דרך וריד הזנב. מלבד הזרקה לוריד זנב רגיל, משלוח הידרודינמית דורש מסירה של minicircles בכמויות גדולות של תמיסה פיזיולוגית לעכברים בתוך 5-7 שניות. לפיכך, טכניקות טיפול והזרקה יציבה הן תנאי הכרחיות להצלחה בהליך זה. יצירת עכברים הטרנסגניים sRANKL היא גישה אחרת לosteoc in vivolastogenesis. עם זאת, רמה גבוהה של sRANKL יכולה להוביל להקטלניות עוברי 4 ויצירת עכברים הטרנסגניים היא גם יקרה וגם גוזל זמן.

במודל מכרסם OVX, שני ציטוקינים דלקתיים כגון TNF, IL-1 ו-IL-6 וsRANKL ציטוקינים דלקתי שאינו תורמים לin vivo osteoclastogenesis ואיבוד מסת עצם. מודל העברת גני sRANKL מוביל לביטוי יתר של רק sRANKL ציטוקינים שאינם דלקתי. לכן, מודל העברת גני sRANKL שתואר כאן מציע חוקרים כלי רב עוצמה כדי לבחון את תרומתו של ציר RANKL-RANK בשיפוץ עצם בהעדר הדלקת.

שיטת תרבות osteoclast במבחנה, הכוללת תאי מח עצם שיתוף culturing וosteoblasts, הוקמה בסוף 1980s לפני הגילוי של RANKL בסוף 1990 של 29,30. רקומביננטי M-CSF וRANKL להשפיע על התמיינות osteoclast ביעילות במבחנהnd השיטה שתוארה בעבר במחקרים אחרים 3,31. M-CSF ידוע כדי לעורר ביטוי RANK במבשרי osteoclast המוקדמים 32 ולפעול כגורם הישרדות של מבשרי osteoclast וosteoclasts הבוגר 33. RANKL חיוני לבידול osteoclast והפעלת 3. הנה, את השיטה של osteoclastogenesis במבחנה מתוארת. culturing המוצלח והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts דורשים בידוד סטרילי תא וטכניקות ציפוי נכון, כמו גם הבנה מדוקדקת של קציר תא מתוזמן. ציפוי מחושב של התאים הוא חיוני משום שבידול osteoclast דורש היתוך של תאים מבשר osteoclast 34 ומספר מספק של תאים מבשר osteoclast לא יאפשר היתוך והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts. באופן דומה, מספר עודף של תאים מבשר osteoclast, מוביל להיווצרות גוש ומוות של תאי סופו של דבר. להסרת של איחסיד תאים 2 שעות לאחר ציפוי התאים יכולות לעזור לשמור על מספר סלולרי אופטימלי. לבסוף, זמן קציר תא הוא חיוני כosteoclasts הם סופני תאים קצרים ימים הבדיל עם תוחלת חיים של כ 48 שעות 35. לכן, צריכים להיות שנקטפו תאים בתוך 48 שעות לאחר התצפית הראשונה של תאי multinucleated. אז יכולים להיות מאופיינים בתאים אלה על ידי מלכודת וצביעת F-אקטין על ידי אימונוהיסטוכימיה ועצם פעילות ספיגה יכולה להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM). גישות ניסיוניות אלה מאפשרות הגדרה ברורה של osteoclasts במונחים של הפנוטיפ והתפקוד שלהם.

In vivo ו במבחנת הטכניקות המתוארות כאן יקל על הפיתוח של מעכבי osteoclast כיום במחקרים טרום קליניים, שהוביל לאסטרטגיות טיפוליות יעילות עבור מיליוני אוסטיאופורוזיס וחולי דלקת מפרקים ברחבי העולם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alpha-MEM Life Technologies  12561-056
Human M-CSF Miltenyi Biotec 130-096-492
Mouse M-CSF Miltenyi Biotec 130-094-643
Human RANK-Ligand - soluble Miltenyi Biotec 130-094-631
Mouse RANK-Ligand - soluble Miltenyi Biotec 130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice Braintree TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit  R&D systems MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma 387A
MouseTRAP assay  immunodiagnostic systems SB-TR103

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
  2. Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
  3. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
  4. Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
  5. Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
  6. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
  7. Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
  8. Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
  9. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
  10. Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
  11. Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
  12. Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
  13. Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
  14. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
  15. Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
  16. Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
  17. Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
  18. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
  19. Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
  20. Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
  21. Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
  22. Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
  23. Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
  24. Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
  25. Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
  26. Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
  27. Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
  28. Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
  29. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
  30. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
  31. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  32. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
  33. Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
  34. Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
  35. Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).

Tags

רפואה, osteoclast דלקת פרקים DNA minicircle מקרופאגים תרבית תאים משלוח הידרודינמית גיליון 88
רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D. J., Dixit, N., Suzuki, E.,… More

Wu, D. J., Dixit, N., Suzuki, E., Nguyen, T., Shin, H. S., Davis, J., Maverakis, E., Adamopoulos, I. E. A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders. J. Vis. Exp. (88), e51810, doi:10.3791/51810 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter