Introduction
Kas-iskelet sistemi hastalıkları, ulusal ve yerel sağlık sistemleri için 1 Amerika Birleşik Devletleri ve mevcut ciddi sonuçlara milyonlarca insanı etkiler. Bu bozukluklar arasında kemik kaybı ve geniş bir tedavi ve kurtarma uzun süre gerektiren eklem fonksiyonu ile karakterize edilir. Genellikle, osteoklastların sayısı ve / veya aktivitesinde bir nispi artış, hücre osteoporozda, kemik emmek için özel ve artrit 2 görülmektedir. Fizyolojik koşullar altında, osteoklastların sayısı ve etkinliği osteoblastlar tarafından üretilen nükleer faktör κ-B ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü düzenlenir. Osteoprotegerin (OPG), RANKL için bir yem reseptörü de 3 osteoblastlar tarafından üretilen sistemik sRANKL aşın veya OPG silinmesini içerir in vivo hayvan modelleri, osteoporoz araştırmalarında, çok değerlidir.; Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik farelerin 4,5 üretilmesini gerektirir. Burada, yeni bir alternatifkas-iskelet sistemi ile ilgili hastalıkların çalışma için sRANKL aşırı ifade eden bir yöntem tarif edilmektedir. Özellikle, minicircle (MC) DNA teknolojisi ve hidrodinamik dağıtım yöntemler, canlı ortam içinde sRANKL arasında gen transferini elde etmek ve sistemik 6 fare sRANKL aşırı ifade etmek için kullanılmıştır.
Bu yöntem, aynı zamanda, düşük kalsiyum diyeti 8 ile ovariektomi 7 ve diyet müdahalesi şu osteoklast hormonal düzenlenmesi gibi osteoporoz ve diğer in vivo modeller, tamamlayıcıdır. Bu modeller cerrahi gerektiren ve önemli bir maliyetle 9 at, birkaç aya kadar sürebilir ancak kas-iskelet sistemi ile ilgili bozuklukların farklı yönlerini incelemek için çok yararlıdır. Ovariektomi uygulanmış olan (OVX) kemirgen modeli yumurtalıkların çıkarılması böylece insan menopoz sonrası osteoporoz 10 taklit eden estrojen eksikliğine yol açar deneysel bir hayvan modelidir. İnsan menopoz sonrası osteoporoz, östrojen yetersizliklerinin bir durumdurency kemik kırılmaları yönünden artan bir riske yol açar ve osteoporoz sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık sekiz milyon kadınları etkiler. OVX modeli, menopoz sonrası osteoporoz için faydalı olmasına rağmen, genel olarak osteoporoz okuyan sınırlı avantajlar sunmaktadır. Östrojen yokluğunda bu nedenle de artmış osteoklast aktivitesi 10-12 görülmektedir, osteoklast uyarılması ve osteoblast apoptoz inhibe ederek, kemik kaybını önler. Kemik erimesini yana A RANKL'ın-OPG oranı dengesizlik ayrıca 13 görülmektedir. Büyüme faktörü β (TGF β), yüksek interlökin-7 (IL-7) ve TNF, IL-1 ve IL-6 14,15 dönüşüm seviyelerinin uzaması Bununla birlikte, in vivo koşullarında östrojen eksikliği de eşlik etmektedir. Bu sitokinler RANKL'ın yolunun kemik yeniden düzenleyici fonksiyonları bağımsız bilinen gibi, sadece RANKL-RANK eksenine herhangi bir osteoklast aktivasyonunu atfetmek mümkün değildir. Bu yazıda anlatılan modeli viv çalışma için araştırmacılar sağlaro pro-enflamatuar sitokinler olmaksızın osteoclastogenez ve kemik kaybına RANKL-RANK eksen OVX kemirgen modelleri ile karşılaştırıldığında.
Buna ek olarak, in vitro osteoklastojenezisi teknikleri kas-iskelet sistemi hastalıklarının tedavisi için potansiyel terapötik osteoklast aktivasyonunu çalışma için gerekli araçlardır. Daha önceki çalışmalar, aynı zamanda, fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve fare sRANKL ile fare kemik iliğinden elde edilen makrofajların (BMMs) kültürlenmesi osteoclast farklılaşmasında 3,16,17 yol göstermiştir. Burada, fare kemik iliği hem de in vitro 18, insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için çok çekirdekli osteoklast-benzeri hücreleri oluşturmak için protokolleri açıklanmıştır. Olgun terminal açıdan farklılaşmış ve tamamen işlevsel osteoklast tanımlamak için gerekli olan hücre bazlı deneyler, aynı zamanda kısaca açıklanmıştır. Bu in vitro teknikler vivo yaklaşım romanı tamamlamak ve p olarak hizmetowerful soruşturma araçlar osteoklast farklılaşmasını ve aktivasyonunu incelemek. Bu sistemleri kullanarak, bilim adamları, in vivo ve in vitro olarak osteoklastlar üretmek ve bunların proliferasyon ve aktivasyon için gerekli olan uyarıcılar ve sinyaller tespit hem de farmakolojik ve biyolojik inhibitörlerinin sonuç verirliğinin test edilmesi mümkün bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
SRANKL MC DNA 1. Hidrodinamik Gönderme
- Fare Tail Ven yoluyla hidrodinamik Teslim
- Kuyruk damarından enjekte edilmesinden önce fare tartılır. Fare vücut ağırlığının ~% 10 bir toplam hacim içinde sRANKL veya Ringer çözeltisi yeşil floresan protein (GFP) MC (ön sıcak, 37 ° C'de) seyreltin.
- Kan damarlarını genişletmek ve görünür yan damarlar (LVs) yapmak için enjeksiyondan önce 10 dakika boyunca bir kafeste fare ısıtın. Dehidratasyon ve hipertermi önlemek için dikkatli fare izleyin.
- En kısa sürede LVs dilate ve görünür gibi, süzgeç için fare aktarmak ve hareketi dizginlemek için varil içine yeterince fişini takın. Solunum gibi normal bir aktivite için fare izleyin. Gerekirse süzgeç fişini ayarlayın.
- Silin bir alkol ile kuyruğun ucundan enjeksiyon alanı 3/4 dezenfekte. Fare kuyruğu ven enjeksiyon için 27-30 G iğne kullanın. Bir elinizle sıkıca tutun kuyruk ve iğneyikuyruk toplardamarına. Şırınga üzerinde baskı uygulayın ve 5-7 saniye içinde enjeksiyon tamamlayın.
- Kuyruk damarından gelen iğne kaldırmak ve kanamayı durdurmak için enjeksiyon yerinde bir pamuk ile basınç uygulayın. Solunum hızı normal hızına düşürülür sonra bir kez vivari geri fare aktarmak, 15-30 dakika boyunca fare izleyin.
- Fare Serum TRACP5b Mesaj Gen Transferi Sistemik Fare sRANKL İfade ve Nicelik Onay
- Kan damarlarını genişletmek ve LVs görünür yapmak için 5-10 dakika için bir kafes içinde fare ısıtın. Dehidratasyon ve hipertermi önlemek için dikkatli fare izleyin.
- Kuyruk ucundan ileri bir site bir de fare kuyruğuna bir bıçak ile küçük bir kesi olun.
- Serum ayırma tüplerine kan yaklaşık 100 ul toplayın.
- 30 dakika boyunca oda sıcaklığında serum ayırma tüpleri inkübe edin.
- Santrifüj 5 dakika boyunca 10,000 x g'de ve serum numuneleri toplamak. Stordaha fazla analiz için -80 ° C e serum.
- Bir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak serum örneklerinde sRANKL ELISA ve fare serum TRACP5b deneyi yapın.
Fare BMMs 2. In vitro Osteoklast Üretimi
- İzolasyon ve BMMs ekimi
- Tibia ve femur kemikleri İzolasyonu: CO 2 ile donör fare Euthanize, ve% 70 etanol ile dezenfekte bacaklar. Sağlam femur ve tibia kemikleri kaldırmak için, kalkaneus kemik kasık kemiğinden ayır.
- Kemik zarar vermeden dikkatli bir cilt ve kas çıkarın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ihtiva eden bir Petri çanağı içinde işlenmiş femur ve tibia kemiği yerleştirin.
- Kemik iliği çıkarılması: femur ve tibia kemikleri bir tarafındaki ucu kesin ve α-MEM,% 1 penisilin / streptomisin içeren yüklü bir 25 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile bir 50 ml tüp içine, kemik iliği atılmasına (Osteoklast Kültür Orta / OCM).
- Makrofajlar Kültür
- Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak.
- 96 oyuklu bir plaka içerisine yerleştirildi ve 37 ° C de inkübe cam kapak slipleri (5 mm) ve diş kemiği dilimleri 6 kuyulu bir levha ya da 3 x 10 5 hücre için oyuk başına Plaka 1 x 10 6 hücre
- Aspire yapışmayan hücreleri ihtiva eden ve 48 saat boyunca 25 ng / ml fare M-CSF ihtiva eden taze OCM (+) ile 37 ° C'de inkübe hücreleri tüm medya.
- 25 ng / ml fare M-CSF ve osteoklastojenezi başlatmak için 30 ng / ml fare sRANKL ihtiva eden aspire tüm medya ve taze OCM ile 37 ° C'de inkübe hücreleri (+) media. Gerektiği gibi her 3 günde bir ortam doldurun.
- Hücrelerin büyümesineyaklaşık 6-8 gün kemik eritme kapasitesine sahip çok çekirdekli dev hücrelerin oluşturulması için. En kısa sürede, çok çekirdekli hücreler görünür gibi, ticari bir kit kullanılarak boyanan TRAP (tartarat dirençli asit fosfataz) yapmak, ve tam olgunlaşmış zaman, fonksiyonel testleri gerçekleştirmek. Phalloidin leke ve resim daha önce tarif edildiği gibi 19 elektron mikroskopi taraması (SEM) ile dentin dilimleri bağlanmış hücreler kullanılarak lamelleri F-aktin halkaları görselleştirme.
İnsan PBMC 'den 3. In vitro Osteoklast Üretimi
- İnsan PBMC İzolasyonu
- Bir 50 ml tüp içine önceden ısıtılmış Histopaque-1077 10 ml ilave edilir.
- Boş lökosit filtre 50 ml tüp (PBS ile kan 1:1 oranında) içine steril PBS ile kan bankasından elde. Kan histopaque karışmadığı emin, çok yavaş histopaque çözüm üzerinde seyreltilmiş kan Katman.
- 18 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin örnekleri Takip etmeksantrifüj ing dikkatlice beyaz kan hücreleri içeren beyaz ince beyaz tabaka tabaka izole edilmesi ve yeni bir 50 ml'lik tüpe transfer.
- Hücreleri toplamak için 5 dakika boyunca 650 x g hızında tekrar PBS ve santrifüj ile hücreler seyreltin.
- Medya ve hücre sayacı kullanarak hücrelerin sayısı (-) OCM süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
- PBMC'Ierde Kaplama ve kültüre
- OCM hücrelerin tekrar (+) ve ortam levha 8 x 10 ug / ml göz başına 6 çukurlu bir levha ya da 1 x 10 6 hücre / ml her bir kuyucuk için 96 oyuklu bir plaka içerisinde 6 hücre. Gibi immünofloresan görüntüleme gibi kemik erimesi deneyleri için uygun kemik dilimleri üzerinde için gerekli olan cam kapak slipleri (5 mm) levhalar 20 hücreleri daha önce tarif edildiği.
- Değişim kültür ortamı, insan M-CSF, her 2-3 günde bir ile ya da gerektiğinde hücreleri ilave etme. Daha sonra osteoclastogenes başlatmak için OCM (+) ortamı içinde 25 ng / ml insan M-CSF ile birlikte insan sRANKL 30 ng / ml ilave etmek suretiyle, 5. günde farklılaşma aşamasına geçinolduğunu.
- Çok çekirdekli dev hücreler oluşturmak için yaklaşık olarak 14-21 gün için hücreler büyür. En kısa sürede çok çekirdekli hücreler olarak görünür, bu hücreler daha sonra TRAP için etiketlenebilir ve tam olarak olgunlaşmış zaman, işlevsel tahliller gerçekleştirilebilir. F-aktin halkaları phalloidin leke kullanarak lamelleri üzerinde görülebilir. Hücre morfolojisi, SEM ile dentin dilimleri bağlı hücrelerde incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, osteoklastojenez sitokinlerin etkilerini incelemek için bir yöntem olarak, in vitro olarak osteoklast öncü hücreleri ayırt etmek için in vivo ve hücre kültürü protokollerinde osteoklast farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği tarif edilmektedir. Şekil 1, farelerde GFP ve fare sRANKL MC başarılı gen transferi için temsili sonuçları gösterilmiştir. Şekil 2'de, fare kemik iliği ya da parlak alan mikroskopi ile osteoklast için ön-madde hücreleri, insan PBMC hücre farklılaşması zamana bağlı kültürlerin temsili görüntüleri gösterilir. Şekil 3, fare kemik iliğinden elde edilen osteoklastlar karakterize etmek için üç bağımsız yöntemleri için temsili görüntüleri gösterilir . Fare sRANKL varlığı TRAP ekspresyonunu (Şekil 3A ve B) ve F-aktin halkaları (Şekil 3C ve D) oluşumunu harekete geçirir. Tarama elektroniktron mikroskobu (SEM), fare kemik sRANKL (Şekil 3E ve F) emilen edebilen dev hücre oluşumuna neden olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 4, insan PBMC aynı karakterizasyon yöntemleri arasında Osteoklastlar gösterilmiştir elde.
Şekil 1. SRANKL in vivo gen transfer artan osteoklastojenez yol açar. A'nın ön görünümü, B) fare karaciğer, ve C, D) 12-haftalık C57BL / 6 erkek farelerin tüm vücut görsel GFP veya sRANKL 5 ug enjekte MC DNA. Ok, GFP gen transferi, in vivo fare GFP ekspresyonunu gösterir. RANKL gen transferi fareler hiçbir eşiğe olarak hizmet vermektedir. Maestro 2 Imager, bir gün sonrası gen transferi (kırmızı ve yeşil d tarafından çekilen görüntülerenote arka plan ve sırasıyla GFP). E) Plasmid 1, 5 de analiz edilen serum içinde sRANKL MC-DNA konstruktu ve F) sRANKL seviye haritası ve 11 gün ya da GFP yayınlamak sRANKL gen transferi. G) Fare TRACP5b serum düzeyi 11 gün analiz GFP veya sRANKL gen transferi sonrası. Ölçek çubukları A, B, 5 mm, ve C, D'de 10 mm göstermektedir
Fare ve insan hücre kültür sistemleri hem de Şekil 2,. In vitro osteoklastojenezisi. Farklılaşmasını gösteren 25 ng / ml fare M-CSF ve 30 ng / ml fare sRANKL varlığında kemik iliği ve kültüre izole edilen fare hücrelerinin parlak-alan mikroskopi günde time kurs A), 2 B) 5, ve C) 8. Izole edilmiş insan hücrelerinin parlak-alan mikroskopiperiferik kan ve 25 ng / ml insan M-CSF ve gün D'de bir farklılaşma zaman süreci gösteren 30 ng / ml insan sRANKL), 4 E) 14 ve F) 21 mevcudiyetinde kültürlendi. Ölçek çubukları 20 um göstermektedir.
Şekil 3,. Üretimi ve fare osteoklast karakterizasyonu kemik iliğinden izole edilmiş ve A varlığında, 6 gün) için kültürlenmiş fare hücre. TRAP boyama (pembe) 25 ng / ml fare M-CSF ya da B) 25 ng / ml fare M -CSF ve 30 ng / ml fare sRANKL. Phalloidin (yeşil) ve kemik iliğinden izole edilmiş ve C mevcudiyetinde 8 gün) 25 ng / ml fare M-CSF ya da D) 25 ng / ml fare M-CSF ve 30 ng kültürlenmiş fare hücreleri DAPI (Mavi) boyama Fa oluşumunu gösteren / ml fare sRANKLçok çekirdekli hücreler içinde ctin halka. Kemik iliği ve E mevcudiyetinde 8 gün kültürlendi) 25 ng / ml fare M-CSF ya da F) oluşumunu gösteren 25 ng / ml fare M-CSF ve 30 ng / ml fare sRANKL izole edilen fare hücre SEM foto-mikro grafikleridir oklarla gösterildiği gibi kemik rezorpsiyonu alanları. Ölçek çubukları MS 40 um gösterir, ve E, F 30 mikron
A varlığında, 15 gün boyunca kültürlenmiş PBMC'ler ve izole edilmiş insan hücreleri) Şekil 4,. Üretimi ve insan osteoklast karakterizasyonu. TRAP boyama (pembe) 25 ng / ml insan M-CSF ya da B) 25 ng / ml insan M- CSF ve 30 ng / ml insan sRANKL. Phalloidin (yeşil) ve DAPI (Mavi) C varlığında, 19 gün boyunca kültüre PBMC izole edilen insan hücre boyama) D) çok çekirdekli hücrelerinde F-aktin halkalarının oluşumu gösteren 25 ng / ml insan M-CSF ve 30 ng / ml insan sRANKL. E varlığında 18 gün boyunca kültüre PBMC ve izole edilmiş insan hücreleri) SEM foto-mikro 25 ng / ml insan M-CSF ya da F) 25 ng / ml insan M-CSF ve 30 ng / ml insan sRANKL emilmesinin oluşumunu gösteren oklarla gösterildiği gibi kemik alanları. Ölçek çubukları E, F de C, D, 15 mikron olarak 20 um, A, B, 10 mikron göstermektedir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kas-iskelet koşulları morbidite ve sakatlık nedenleri lider vardır ve 150'den fazla hastalık ve sendromların oluşmaktadır; Bugün yaklaşık 90 milyon Amerikalıyı etkileyen. Eklem enflamasyonu ve kemik yok artrit ve osteoporoz dahil olmak üzere kas-iskelet sistemi koşulları baskın özellikleri vardır. Osteoporoz genellikle kemik kırıkları yol açan kemik bütünlüğünü zayıflatan bir durumdur. Artrit şiş, hassas ve sert kısıtlayan normal hareket olmak ve sakatlığa yol açabilir eklem iltihabı ile karakterize hastalık zayıflatıcı, bir kroniktir. Kas-iskelet sistemi hastalıklarının patogenezi çok birbirinden farklı olsa da, kemik yıkım kapsayıcı ortak özelliğidir. Kas-iskelet sistemi koşullarında kemik yok öncelikle, kemik emilmesi ve kemik oluşumunun 21,22 arasındaki dengesizliğe neden olur. Bir tedavi yaklaşımı kemiği yok etmek için bu hücrelerin kapasitesini bloke etmek girişimi için
Burada tarif edilen in vivo model aynı zamanda transgen taşıyıcı 24 olarak hizmet bakteriyel omurgasından kurtarılmış küçük epizomal DNA vektörleri (~ 4 KB) vardır minicircles kullanır. Minicircles birkaç aya kadar istikrarlı bir ifade ile, normal bakteriyel plazmitler daha sonra 10-1,000 kat daha yüksek transgenleri ifade eder. Minicircles en küçük molekül boyutu daha verimli transfeksiyon oranı ve büyük bir ekspresyonu normal bakteriyel plazmitler 24 karşılaştırmak katkıda bulunur. Bu nedenle, şu anda yaygın olarak minicircles ön-klinik gen transfer çalışmaları 25,26 uygulanır. Hidrodinamik teslim bir fare bütün vücuda plazmid DNA sunmak için kılcal hidrodinamik basınca göre iyi gelişmiş bir yöntemdir. Farelerde kuyruk damarından enjeksiyon vasıtasıyla hepatositler için hidrodinamik gen verici köklü to plazmid DNA 6 ile transgen ifade. Bu çalışmalarda, in vivo fare modelinde fare sRANKL aşırı ifade sRANKL MC ve bir kuyruk ven enjeksiyonları ile hidrodinamik teslim ile elde edilir. Fare sRANKL ELISA farelerde RANKL serum seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir. Fare serum TRACP5b, bir kemik erimesi işaretleyici 27 arasında önemli yükseklik sRANKL gen transfer farelerde gözlenmiştir. Özellikle, bu teknik sRANKL aşırı ekspresyonu ile sınırlı değildir; ayrıca bundan başka, diğer salgılanan proteinleri 28 aşırı ifade uygulanabilir. Bu prosedürde birincil teknik güçlük, kuyruk damarı vasıtasıyla hidrodinamik teslim edilir. Yanı sıra, normal kuyruk damarından enjeksiyon hidrodinamik teslim 5-7 saniye içinde farelere fizyolojik çözelti içinde büyük hacimlerde minicircles teslim gerektirir. Böylece, sürekli kullanım ve enjeksiyon teknikleri Bu prosedür ile başarı için gereklidir. SRANKL transjenik farelerin üretilmesi için in vivo osteoc başka bir yaklaşımdırlastogenesis. Bununla birlikte, sRANKL yüksek düzeyde bir embriyonik öldürücülüğü 4 yol açabilir ve transjenik farelerin üretilmesi de pahalı ve zaman alıcıdır.
OVX kemirgen modelinde, iltihaplı, TNF, IL-1 ve IL-6 gibi sitokinler ve non-inflamatuar sitokin sRANKL hem de in vivo osteoclastogenez ve kemik kaybına katkıda bulunur. sRANKL gen transfer modeli sadece tam olmayan iltihap sitokin sRANKL aşın yol açar. Bu nedenle, burada açıklanan sRANKL gen transferi modeli araştırmacılara inflamasyon yokluğunda kemik remodeling RANKL'ın-RANK ekseni katkısını incelemek için güçlü bir araç sunar.
Ko-kültür kemik iliği hücreleri ve osteoblastları içeren bir in vitro osteoklast kültür yöntemi, önceki geç 1990 yılında 29,30 RANKL'ın keşif 1980'lerin sonlarında kurulmuştur. Rekombinant M-CSF ve RANKL osteoklast farklılaşmasını teşvik etkili bir in vitro birnd yöntem, daha önce diğer çalışmalar 3,31 'de tarif edilmiştir. M-CSF, erken osteoklast öncüler 32 RANK ekspresyonunu teşvik etmek ve osteoklast ön-maddeleri ve olgun osteoklastlar 33 bir sağkalım faktörü olarak hareket bilinmektedir. RANKL osteoclast farklılaşması ve aktivasyon 3 için gereklidir. Burada, in vitro osteoklastogenez yöntem tarif edilmektedir. Osteoklast'lardan Başarılı kültürü ve öncü hücrelerin farklılaşması steril hücre izolasyonu ve uygun kaplama teknikleri yanı sıra zamanlanmış hücre hasat dikkatli anlayış gerektirir. Osteoklast farklılaşma osteoklast öncü hücreleri 34 füzyon olunması ve osteoklast öncü hücrelerin yetersiz sayıda osteoklast ön madde hücrelerinin füzyonu ve farklılaşmasını kolaylaştırmaz, çünkü hücrelerin hesaplanan kaplama önemlidir. Benzer şekilde, osteoklast öncü hücreleri bir aşırı sayıda, oluşumu ve hücre ölümünü nihai yığın yol açar. Non çıkarılmasıHücreleri kaplama sonrası yapışan hücreler 2 saat optimal bir hücre sayısını korumak yardımcı olabilir. Osteoklastlar, yaklaşık 48 saat 35 bir ömrü ile terminal olarak farklılaşmış kısa ömürlü hücrelerdir Son olarak, hücre hasat zaman çok önemlidir. Bu durumda, hücreler, çok çekirdekli hücreler ilk gözlem sonra 48 saat içinde hasat edilmelidir. Bu hücreler daha sonra imünohistokimya ve kemik erimesi aktivitesi olmak üzere, elektron mikroskobu (SEM) tarama ile tespit edilebilir ile TRAP ve F-aktin boyama ile karakterize edilebilir. Bu deneysel yaklaşımlar kendi fenotip ve fonksiyon açısından osteoslastlann açık bir tanımını sağlar.
In vivo ve in vitro teknikleri burada açıklanan tüm dünyada osteoporoz ve artrit hastalarının milyonlarca etkili tedavi stratejileri yol açan, şu anda klinik öncesi çalışmalarda inhibitörlerinin osteoklast gelişimini kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
