Introduction
Malattie muscolo-scheletriche colpiscono milioni di persone negli Stati Uniti e presentare gravi conseguenze per i sistemi sanitari nazionali e locali 1. Questi disturbi sono caratterizzati da perdita di osso e funzione articolare che richiedono un trattamento estensivo e lunghi periodi di recupero. Comunemente, un relativo aumento del numero e / o attività di osteoclasti, cellule specializzate a riassorbire osso, osteoporosi ed artrite si osserva 2. In condizioni fisiologiche il numero e l'attività degli osteoclasti è regolata da attivatore del recettore del fattore nucleare κ-B ligando (RANKL), che è prodotto dagli osteoblasti. Osteoprotegerina (OPG), un recettore decoy per RANKL è anche prodotta dagli osteoblasti 3 In modelli animali in vivo che coinvolgono la sovraespressione sistemica di sRANKL, o la cancellazione di OPG sono molto prezioso nella ricerca sull'osteoporosi.; Tuttavia, questi metodi richiedono la generazione di topi transgenici 4,5. Qui, una nuova alternativametodo di iperespressione sRANKL per lo studio dei disturbi muscoloscheletrici legati è descritto. In particolare, minicircle (MC) tecnologia del DNA e metodi di consegna idrodinamiche sono stati usati per conseguire trasferimento genico di sRANKL in vivo e iperespressione del mouse sRANKL sistemicamente 6.
Questo metodo è anche complementare ad altri modelli in vivo di osteoporosi, come la modulazione ormonale degli osteoclasti seguenti ovariectomia 7 e intervento dietetico da basso contenuto di calcio dieta 8. Questi modelli sono molto utili per studiare diversi aspetti dei disturbi muscoloscheletrici legati tuttavia essi richiedono procedure chirurgiche e può richiedere fino a diversi mesi, ad un costo significativo 9. Ovariectomizzate (OVX) modello di roditore è un modello animale sperimentale in cui la rimozione delle ovaie porta alla mancanza di estrogeni mimando così postmenopausale umano 10. Umano post-menopausa osteoporosi, una condizione in cui gli estrogeni deficirenza porta ad un aumento del rischio di fratture ossee e l'osteoporosi colpisce circa otto milioni di donne negli Stati Uniti da soli. Anche se il modello OVX è utile per l'osteoporosi post-menopausale che offre vantaggi limitati a studiare l'osteoporosi in generale. Estrogeni sopprime perdita ossea, inducendo osteoclasti e osteoblasti inibizione dell'apoptosi, quindi in sua assenza un aumento dell'attività degli osteoclasti si osserva 10-12. Un rapporto di squilibrio RANKL-OPG che favorisce riassorbimento osseo si osserva anche 13. Tuttavia, la carenza di estrogeni in vivo è accompagnato anche da una diminuzione dei livelli di fattore di crescita trasformante β (TGF β), aumento della interleuchina-7 (IL-7) e TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Poiché queste citochine hanno conosciuto funzioni modulatori rimodellamento osseo indipendente dal percorso che RANKL, è impossibile attribuire qualsiasi osteoclasti esclusivamente all'asse RANKL-RANK. Il modello descritto in questo documento consente ai ricercatori di studiare in vivo l'asse RANKL-RANK in osteoclastogenesi e la perdita di osso senza citochine pro-infiammatorie rispetto ai modelli di roditori OVX.
Inoltre, le tecniche osteoclastogenesi in vitro sono strumenti essenziali per studiare l'attivazione degli osteoclasti per i potenziali trattamenti terapeutici delle malattie muscolo-scheletriche. Precedenti studi hanno inoltre dimostrato che la coltura di midollo osseo di topo macrofagi derivati (BMMs) con il mouse macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) e il mouse sRANKL può portare a osteoclasti differenziazione 3,16,17. Qui sono descritti i protocolli per generare cellule osteoclasti come multinucleate da midollo osseo di topo e di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in vitro 18. I saggi cellulari necessari per definire un maturo osteoclasti terminalmente differenziate e pienamente funzionale sono anche descritte brevemente. Queste tecniche in vitro completano il romanzo di approccio vivo e insieme fungono da pstrumenti investigativi owerful per studiare la differenziazione degli osteoclasti e l'attivazione. L'utilizzo di questi sistemi, gli scienziati sono in grado di generare osteoclasti in vivo e in vitro e definire gli stimoli e segnali necessari per la proliferazione e l'attivazione e testare l'efficacia di inibitori farmacologici e biologici.
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Protocol
1. Consegna idrodinamica di sRANKL MC DNA
- Consegna idrodinamica via Tail Vena del mouse
- Pesare il mouse prima dell'iniezione coda vena. Diluire sRANKL o proteina fluorescente verde (GFP) MC in soluzione di Ringer (pre-riscaldare a 37 ° C) in un volume totale di circa 10% del peso corporeo del topo.
- Riscaldare il topo in una gabbia per 10 min prima dell'iniezione per dilatare i vasi sanguigni e rendere vene laterali (LV) visibili. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia.
- Non appena i VL sono dilatati e visibili, trasferire il mouse per il limitatore e inserire la spina abbastanza lontano nel barile per frenare il movimento. Monitorare il mouse per il normale attività come la respirazione. Regolare la spina del dispositivo di immobilizzazione, se necessario.
- Disinfettare la zona di iniezione 3/4 dalla punta della coda con un batuffolo imbevuto di alcool. Utilizzare un ago G 27-30 per l'iniezione coda vena mouse. Tenere la coda saldamente con una mano e inserire l'ago inla vena della coda. Applicare una pressione sulla siringa e completare l'iniezione entro 5-7 sec.
- Rimuovere l'ago dalla vena della coda e applicare una pressione con un batuffolo di cotone sul sito di iniezione per fermare l'emorragia. Monitorare il mouse per 15-30 minuti, quindi trasferire il mouse fino al vivaio una volta che il tasso di respirazione è ridotta al suo tasso normale.
- Conferma di espressione sistemica mouse sRANKL e quantificazione dei mouse Serum TRACP5b post Gene Transfer
- Riscaldare il topo in una gabbia per 5-10 minuti, al fine di dilatare i vasi sanguigni e rendere visibile LV. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia.
- Fare una piccola incisione con una lama di coda del topo in un sito un quarto dalla punta della coda.
- Raccogliere circa 100 ml di sangue in provette di siero di separazione.
- Incubare le provette di siero di separazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 5 minuti e raccogliere il siero. Store siero in -80 ° C per ulteriori analisi.
- Eseguire sRANKL ELISA e mouse dosaggio TRACP5b siero su campioni di siero utilizzando un kit commerciale disponibile.
2. In vitro Osteoclasta generazione di mouse BMMs
- Isolamento e Coltura di BMMs
- Isolamento della tibia e femore ossa: Euthanize il mouse donatore con CO 2, e disinfettare le gambe con il 70% di etanolo. Sezionare dal pube all'osso calcagno, per rimuovere femore e tibia ossa intatte.
- Rimuovere la pelle ei muscoli attenzione senza danneggiare l'osso. Posizionare femore e tibia trasformati in una capsula di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS).
- Rimozione di midollo osseo: Tagliare la punta su un lato del femore e della tibia ossa e lavare il midollo osseo in una provetta da 50 ml con una siringa da 1 ml con un ago G 25, caricato con α-MEM contenente 1% di penicillina / streptomicina (osteoclasti cultura medio / OCM).
- Cultura dei macrofagi
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatico.
- Piastra 1 x 10 6 cellule per bene per un 6-pozzetti o 3 x 10 5 cellule per vetrino (5 mm) o fette di dentina collocati in piastra a 96 pozzetti ed incubare a 37 ° C.
- Aspirare tutti i supporti contenenti cellule non aderenti e Incubare le cellule a 37 ° C con OCM fresco (+) contenente topo 25 ng / ml M-CSF per 48 ore.
- Aspirare tutti i media e incubare le cellule a 37 ° C con nuova OCM (+) supporti contenenti il mouse 25 ng / ml M-CSF e 30 ng / ml il mouse sRANKL per avviare osteoclastogenesis. Rifornire i media ogni 3 giorni come richiesto.
- Crescere celluleper circa 6-8 giorni per formare celle multi-nucleari giganti in grado di riassorbimento osseo. Non appena compaiono le cellule multinucleate, eseguire TRAP (fosfatasi acida tartrato resistente) colorazione utilizzando un kit commerciale disponibile, e quando è completamente maturato, eseguire test funzionali. Visualizza anelli di F-actina su vetrini con macchia phalloidin e immagine le cellule attaccate alla dentina fette da microscopia elettronica a scansione (SEM), come descritto in precedenza 19.
3. In vitro Osteoclasta generazione da PBMC umano
- Isolamento di PBMC umano
- Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Histopaque-1077 in una provetta da 50 ml.
- Filtro leucociti vuoto ottenuto dalla banca del sangue con PBS sterile in una provetta da 50 ml (rapporto 1:1 di sangue con PBS). Strato il sangue diluito su tutto la soluzione HISTOPAQUE molto lentamente, facendo in modo che il sangue non si mescola con il HISTOPAQUE.
- Centrifugare i campioni a 1000 xg per 20 min a 18 ° C. Seguireing centrifugazione, isolare attentamente il buffy bianco strato di rivestimento contenente i globuli bianchi e le trasferisce in un nuovo tubo da 50 ml.
- Diluire le cellule con PBS e centrifugare di nuovo a 650 xg per 5 minuti per raccogliere le cellule.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in OCM (-) i media e contare le cellule utilizzando contatore di cellule.
- Placcatura e Coltura PBMC
- Risospendere le cellule in OCM (+) Media e piastra 8 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti o 1 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Cellule piastra su vetrini (5 mm) come richiesto per l'imaging immunofluorescenza nonché sulle fette di osso adatti per saggi di riassorbimento osseo come precedentemente descritto 20.
- Cambia terreni di coltura, rifornire le cellule umane con M-CSF ogni 2-3 giorni o secondo necessità. Quindi procedere alla differenziazione passo il giorno 5 aggiungendo 30 ng / ml di sRANKL umana con 25 ng / ml M-CSF umano nella OCM (+) mezzi di avviare osteoclastogenesè.
- Crescere cellule per circa 14 a 21 giorni per formare cellule multi-nucleari giganti. Non appena compaiono le cellule multinucleate, queste cellule possono quindi essere etichettati per TRAP, e quando è completamente maturato, test funzionali possono essere eseguiti. Anelli di F-actina possono essere visualizzati su vetrini con macchia falloidina. La morfologia cellulare può essere esaminato in cellule attaccate alla dentina fette mediante SEM.
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Representative Results
Qui, una tecnica di trasferimento nuovo gene per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti di citochine sulla osteoclastogenesis sono descritti. In Figura 1, sono mostrati i risultati rappresentativi di successo trasferimento genico di GFP e mouse sRANKL MC nei topi. Nella figura 2, vengono mostrate le immagini rappresentative del midollo osseo di topo o PBMC di differenziazione cellulare dei corsi tempo le culture umane di cellule precursori a osteoclasti mediante microscopia in campo chiaro. Figura 3, vengono mostrate le immagini rappresentative dei tre metodi indipendenti per la caratterizzazione del mouse midollo osseo osteoclasti derivati . La presenza di topo sRANKL attiva l'espressione di TRAP (Figure 3A e B) e la formazione di anelli F-actina (Figure 3C e D). Elec scansionetron microscopia (SEM) rivela che topo sRANKL induce la formazione di cellule giganti capaci di riassorbimento osseo (Figure 3E e F). Figura 4, gli stessi metodi di caratterizzazione su PBMC umane derivate osteoclasti sono mostrate.
Figura 1. SRANKL in vivo gene-trasferimento porta ad una maggiore osteoclastogenesis. Anteriore, vista di A, B) espianti di fegato di topo e C, D) le immagini del corpo intero di 12 settimane di età C57BL / 6 topi maschi iniettati con 5 pg di GFP o sRANKL DNA MC. La freccia indica l'espressione della GFP in vivo nel topo gene GFP trasferimento. Trasferimento genico RANKL topi servono come nessuna fluorescenza di fondo. Le immagini catturate dal Maestro 2 Imager, un giorno dopo trasferimento di geni (d rosso e verdesfondo enote e GFP, rispettivamente). E) Plasmid mappa di sRANKL costrutto MC-DNA e F) sRANKL livello nel siero analizzato a 1, 5 e 11 giorni dopo GFP o sRANKL trasferimento genico. G) mouse livello TRACP5b siero analizzati 11 giorni dopo GFP o sRANKL trasferimento genico. Barre di scala indicano 5 mm A, B, e 10 mm di C, D.
Figura 2. Osteoclastogenesis In vitro sia in sistemi di coltura di cellule umane mouse. Microscopia in campo chiaro di topo cellule isolate da midollo osseo e coltivate in presenza di 25 ng / ml topo M-CSF e 30 ng / ml topo sRANKL mostrando una differenziazione decorso a giorni A), B 2) 5, e C) 8. Microscopia in campo chiaro di cellule umane isolateda sangue periferico e coltivate in presenza di 25 ng / ml umana M-CSF e 30 ng sRANKL umano ml / mostra un andamento temporale differenziazione giorni D), 4 E) 14, e F) 21. Barre di scala indicano 20 micron.
Figura 3. Generazione e caratterizzazione di osteoclasti mouse. Colorazione TRAP (rosa) di topo cellule isolate da midollo osseo e coltivate per 6 giorni in presenza di un topo) 25 ng / ml M-CSF o B) del mouse 25 ng / ml M -CSF e 30 ng / ml il mouse sRANKL. Falloidina (verde) e DAPI (blu) colorazione di cellule di topo isolate dal midollo osseo e coltivate per 8 giorni in presenza di C) 25 ng / ml topo M-CSF o D) 25 ng / ml topo M-CSF e 30 ng / ml topo sRANKL mostra la formazione di Faanello CTIN in cellule multinucleate. Microfotografie SEM di topo cellule isolate dal midollo osseo e coltivate per 8 giorni in presenza di E) 25 ng / ml topo M-CSF o F) 25 ng / ml topo M-CSF e 30 topo ng / ml sRANKL mostra la formazione di aree di riassorbimento sull'osso come indicato dalle frecce. Barre di scala indicano 40 micron in AD, e 30 micron di E, F.
Figura 4. Generazione e caratterizzazione di osteoclasti umani. Colorazione TRAP (rosa) di cellule umane isolate da PBMC e coltivate per 15 giorni in presenza di A) 25 ng / ml M-CSF umano o B) 25 ng / ml umana M- CSF e 30 ng / ml sRANKL umana. Falloidina (verde) e DAPI (blu) colorazione di cellule umane isolate da PBMC e coltivate per 19 giorni in presenza di C) D) 25 ng / ml M-CSF umano e 30 ng / ml sRANKL umano che mostra la formazione di anelli F-actina in cellule multinucleate. Microfotografie SEM di cellule umane isolate da PBMC e coltivate per 18 giorni in presenza di E) 25 ng / ml M-CSF umano o F) 25 ng / ml M-CSF umano e 30 ng / ml sRANKL umano che mostra la formazione di riassorbimento aree sull'osso come indicato dalle frecce. Barre di scala indicano 10 pm di A, B, 20 pm di C, D 15 pm di E, F.
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Discussion
Condizioni muscolo-scheletriche sono le cause principali di morbilità e di disabilità e sono composti da oltre 150 malattie e sindromi; che colpisce circa 90 milioni di americani oggi. L'infiammazione articolare e la distruzione ossea sono caratteristiche predominanti di disturbi muscolo-scheletrici, tra cui l'artrite e l'osteoporosi. L'osteoporosi è una condizione che indebolisce l'integrità ossea, causando spesso fratture delle ossa. L'artrite è una malattia cronica, debilitante malattia caratterizzata da infiammazione delle articolazioni che diventano gonfie, tenera e il movimento normale stiff-limitazione e possono portare alla disabilità. Sebbene la patogenesi delle malattie muscolo-scheletriche molto diversa l'uno dall'altro, la distruzione ossea è la caratteristica comune generale. La distruzione ossea in condizioni muscolo-scheletriche è principalmente causata da uno squilibrio tra riassorbimento osseo e la formazione dell'osso 21,22. Un approccio terapeutico è tentare di bloccare la capacità di queste cellule di distruggere osso
Il modello in vivo descritto qui utilizza minicircoli, che sono piccoli vettori episomale DNA (~ 4KB) liberati dal backbone batterica, che servono anche come portatori transgene 24. Minicircoli esprimono transgeni 10-1,000 volte superiore quindi plasmidi batterici normali con un'espressione stabile per parecchi mesi. La ridotta dimensione molecolare del minicircoli contribuisce al tasso di trasfezione più efficiente e sostanziale espressione confrontarle con normali plasmidi batterici 24. Pertanto, minicircoli sono ora ampiamente applicati in pre-clinici studi di trasferimento genico 25,26. Consegna idrodinamico è un metodo ben sviluppata sulla base della pressione idrodinamica nei capillari per trasportare DNA plasmidico nel corpo intero di un mouse. Consegna del gene idrodinamico agli epatociti mediante iniezione vena della coda nei topi è ben consolidata to esprimere transgene dal plasmide DNA 6. In questi studi, sovraespressione del mouse sRANKL nel vivo modello di mouse si ottiene da sRANKL MC e la consegna idrodinamico tramite iniezioni vena della coda. Mouse sRANKL ELISA può essere utilizzato per rilevare i livelli sierici di RANKL nei topi. Aumento significativo di topo TRACP5b siero, un marker di riassorbimento osseo 27, si osserva in sRANKL trasferimento genico topi. In particolare, questa tecnica non è limitata alla sovraespressione di sRANKL; può anche essere ulteriormente applicato ad altre proteine secrete iperespressione 28. La difficoltà tecnica principale in questa procedura è la consegna idrodinamico attraverso la vena della coda. Oltre a iniezione coda vena regolare, consegna idrodinamico richiede la consegna di minicircoli in grandi volumi di soluzione fisiologica nei topi entro 5-7 sec. Così, tecniche di manipolazione e di iniezione costante sono essenziali per il successo con questa procedura. Generazione sRANKL topi transgenici è un altro approccio in vivo osteoclastogenesis. Tuttavia, un elevato livello di sRANKL può portare a letalità embrionale 4 e generare topi transgenici è anche costoso e richiede tempo.
Nel modello di roditore OVX, entrambe le citochine infiammatorie come TNF, IL-1 e IL-6 e le sRANKL non infiammatorie citochine contribuiscono in osteoclastogenesis vivo e perdita ossea. sRANKL modello trasferimento genico porta alla sovraespressione della sola citochina sRANKL non infiammatoria. Pertanto, il modello di trasferimento genico sRANKL qui descritto offre ai ricercatori un potente strumento per esaminare il contributo dell'asse RANKL-RANK nel rimodellamento osseo in assenza di infiammazione.
Un metodo in vitro cultura osteoclasti, che coinvolge co-coltura di cellule del midollo osseo e gli osteoblasti, è stata fondata alla fine del 1980 prima della scoperta di RANKL alla fine del 1990 di 29,30. Ricombinante M-CSF e RANKL inducono la differenziazione degli osteoclasti in modo efficiente in vitro unnd il metodo è stato già descritto in altri studi 3,31. M-CSF è noto per stimolare l'espressione RANK nei primi precursori degli osteoclasti 32 e ad agire come un fattore di sopravvivenza per i precursori degli osteoclasti e osteoclasti maturi 33. RANKL è essenziale per la differenziazione degli osteoclasti e attivazione 3. Qui, il metodo di osteoclastogenesi in vitro è descritto. Coltura di successo e la differenziazione delle cellule precursori di osteoclasti richiedono l'isolamento delle cellule sterile e tecniche di placcatura adeguate nonché un'attenta comprensione di raccolta delle cellule temporizzato. Placcatura Calcolato delle cellule è cruciale perché la differenziazione degli osteoclasti richiede fusione di cellule precursori degli osteoclasti 34 e un numero insufficiente di cellule precursori degli osteoclasti non faciliterà la fusione e differenziazione delle cellule precursori in osteoclasti. Allo stesso modo, un numero eccessivo di cellule precursori degli osteoclasti, conduce a ciuffo formazione e la morte delle cellule. Rimozione di noncellule-aderenti 2 ore dopo la placcatura le cellule possono aiutare a mantenere un numero di cellulare ottimale. Infine, al momento della raccolta delle cellule è fondamentale in quanto osteoclasti sono le cellule terminalmente differenziate di breve durata con una durata di circa 48 ore 35. Così, le cellule dovrebbero essere raccolti entro 48 ore dopo la prima osservazione di cellule multinucleate. Queste cellule possono quindi essere caratterizzate da TRAP e F-actina colorazione immunoistochimica e osso attività riassorbimento può essere rilevato da microscopia elettronica a scansione (SEM). Questi approcci sperimentali consentono una chiara definizione degli osteoclasti in termini di fenotipo e funzione.
In vivo e in vitro tecniche descritte qui faciliterà lo sviluppo di inibitori degli osteoclasti attualmente in studi pre-clinici, portando ad efficaci strategie terapeutiche per i milioni di osteoporosi e di pazienti affetti da artrite in tutto il mondo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
