Introduction
Muskuloskeletala sjukdomar drabbar miljontals människor i USA och nuvarande allvarliga konsekvenser för nationella och lokala hälso-och sjukvårdssystemen 1. Dessa sjukdomar kännetecknas av förlust av ben och gemensamma funktion som kräver omfattande behandling och långa perioder av återhämtning. Vanligen en relativ ökning av antalet och / eller aktiviteten av osteoklaster, celler specialiserade för att resorberas ben, vid osteoporos och artrit observeras 2. Under fysiologiska betingelser av antalet och aktiviteten av osteoklaster regleras av receptor aktivator av nukleär faktor κ-B-ligand (RANKL), som produceras av osteoblaster. Osteoprotegerin (OPG), är ett lockbete receptor för RANKL också produceras av osteoblaster 3 In vivo djurmodeller som innebär systemuttryck av sRANKL, eller radering av OPG är mycket värdefulla i osteoporosforskning.; Men dessa metoder kräver generering av transgena möss 4,5. Här har ett nytt alternativmetod för att överuttrycka sRANKL för studier av muskuloskeletala relaterade störningar beskrivs. Specifikt var minicircle (MC) DNA-teknik och hydrodynamiska leveransmetoder som används för att uppnå genöverföring av sRANKL in vivo och överuttrycker mus sRANKL system 6.
Denna metod är också ett komplement till andra in vivo-modeller av benskörhet, till exempel hormonella modulering av osteoklaster efter ovariektomi 7 och dietary intervention av låg-kalcium diet 8. Dessa modeller är mycket användbara för att studera olika aspekter av belastningsrelaterade besvär men de kräver kirurgiska ingrepp och kan ta upp till flera månader, till stora kostnader 9. Äggstockar (OVX) gnagarmodell är en experimentell djurmodell där avlägsnande av äggstockarna leder till östrogenbrist och därmed härma mänskligt postmenopausal osteoporos 10. Human post-menopausal osteoporos, ett tillstånd där östrogen Deficitransparensen leder till ökad risk för benfrakturer och benskörhet drabbar cirka åtta miljoner kvinnor i USA ensam. Fastän OVX modell är användbar för post-menopausal osteoporos är det inte ger några större fördelar i att studera osteoporos i allmänhet. Östrogen hämmar benförlust, genom att inducera osteoklaster och hämma osteoblast apoptos, alltså i sin frånvaro en ökad osteoklastaktivitet observeras 10-12. En RANKL-OPG förhållande obalans som gynnar benresorption observeras också 13. Emellertid är östrogenbrist in vivo också åtföljas av minskade nivåer av transformerande tillväxtfaktor β (TGF β), ökad interleukin-7 (IL-7) och TNF, IL-1 och IL-6 14,15. Eftersom dessa cytokiner har känt benremodellering modulatoriska funktioner oberoende av RANKL reaktionsvägen, är det omöjligt att tillskriva någon osteoklast-aktivering enbart till den RANKL-RANK axel. Modellen som beskrivs i detta dokument ger forskarna möjlighet att studera i vivo RANKL-rank-axeln i osteoclastogenesis och benförlust utan proinflammatoriska cytokiner jämfört med OVX gnagarmodeller.
Dessutom, in vitro osteoclastogenesis tekniker är viktiga verktyg för att studera osteoclast aktivering för potentiella terapeutiska behandlingar av sjukdomar i rörelseorganen. Tidigare studier har också visat att odling av mus-benmärg härledda makrofager (BMMs) med mus-makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och mus sRANKL kan leda till osteoklastdifferentiering 3,16,17. Här är de protokoll för att generera flerkärniga osteoklaster-liknande celler från benmärg från mus samt från humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) in vitro 18 beskrivs. De cell-baserade analyser som krävs för att definiera en mogen terminalt differentierade och fullt funktionell osteoklast är också kortfattat beskrivas. Dessa in vitro-tekniker kompletterar romanen in vivo strategi och tillsammans fungera som powerful undersökande verktyg för att studera osteoklastdifferentiering och-aktivering. Med hjälp av dessa system, forskare kan generera osteoklaster in vivo och in vitro och definierar stimuli och signaler som krävs för deras spridning och aktivering samt testa effekten av farmakologiska och biologiska hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrodynamisk Leverans av sRANKL MC DNA
- Hydrodynamisk Leverans via Mouse Tail Vein
- Väg musen innan injektion i svansvenen. Späd sRANKL eller grönt fluorescerande protein (GFP) MC i Ringers lösning (pre-varm vid 37 ° C) i en total volym av ~ 10% av musens kroppsvikt.
- Värm upp musen i en bur i 10 min före injektion för att vidga blodkärlen och göra laterala vener (LVs) synliga. Övervaka musen försiktigt för att undvika uttorkning och hypertermi.
- Så snart LVs är dilaterade och synliga, för över musen till som hindrar och sätt i kontakten tillräckligt långt in i pipan för att hålla tillbaka rörelsen. Övervaka musen för normal aktivitet såsom andning. Justera plugg rainer om det behövs.
- Desinficera injektionsområde 3/4 från spetsen på svansen med en spritkompress. Använd en 27-30 G-nål för mus svansvenen injektion. Håll svansen stadigt med ena handen och för in nålen itill svansvenen. Sätt press på sprutan och fyll den injektion inom 5-7 sek.
- Ta bort nålen från svansvenen och utöva påtryckningar med en bomullstuss på injektionsstället för att stoppa blödning. Övervaka musen för 15-30 minuter, sedan överföra musen tillbaka till terrariet när andning är reducerad till sin normala hastighet.
- Bekräftelse av systemisk mus sRANKL Expression och kvantifiering av mus Serum TRACP5b Post Gene Transfer
- Värm upp musen i en bur under 5-10 min i syfte att vidga blodkärl och gör LVs synliga. Övervaka musen försiktigt för att undvika uttorkning och hypertermi.
- Gör ett litet snitt med en kniv till musens svans vid ett ställe en framåt från svansspetsen.
- Samla ca 100 l av blod i serumseparationsrören.
- Inkubera serumseparationsrören vid rumstemperatur i 30 min.
- Centrifugera proverna vid 10000 x g under 5 min och samla serum. Store serum i -80 ° C för vidare analys.
- Utför sRANKL ELISA och musserum TRACP5b test på serumprover med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit.
2. In vitro osteoclast Generation från mus BMMs
- Isolering och odling av BMMs
- Isolering av skenbenet och lårbenet ben: Euthanize givaren mus med CO 2, och desinficera benen med 70% etanol. Dissekera från blygdbenet till calcaneus ben, för att ta bort lårben och skenben ben intakta.
- Ta bort skinnet och muskeln försiktigt utan att skada benet. Placera bearbetas lårbenet och skenbenet ben i en petriskål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Borttagning av benmärg: Klipp av spetsen på den ena sidan av lårben och skenben ben och spola ut benmärgen in i en 50 ml tub med hjälp av en 1 ml spruta med en 25 G nål, laddad med α-MEM innehållande 1% penicillin / streptomycin (osteoklaster Kultur Medium / OCM).
- Kultur av Makrofager
- Räkna celler med en hemocytometer eller automatisk cellräknare.
- Plate 1 x 10 6 celler per brunn till en 6-brunnsplatta eller 3 x 10 5 celler till täckglas av glas (5 mm) eller dentin skivor som placeras i 96-brunnars platta och inkubera vid 37 ° C.
- Aspirera alla medier som innehåller icke-adherenta celler och inkubera cellerna vid 37 ° C med färska OCM (+), innehållande 25 ng / ml mus-M-CSF under 48 timmar.
- Aspirera alla medier och inkubera cellerna vid 37 ° C med färska OCM (+)-medium innehållande 25 ng / ml mus-M-CSF och 30 ng / ml mus sRANKL att initiera osteoclastogenesis. Fyll på media var 3 dagar efter behov.
- Odla celleri cirka 6-8 dagar för att bilda jätte flera nukleära celler med förmåga att resorberande ben. Så fort flerkärniga celler visas, utför TRAP (tartrat syrafosfatas) färgning med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit, och vid full mognad, utföra funktionella analyser. Visualisera F-aktin ringar på täckglas med användning av falloidin fläcken och bilden cellerna bundna till dentin skivor genom svepelektronmikroskopi (SEM) såsom beskrivits tidigare 19.
3. In vitro osteoclast Generation från Human PBMC
- Isolering av humant PBMC
- Tillsätt 10 ml förvärmda Histopaque-1077 in i en 50 ml tub.
- Tomma leukocyt-filter erhölls från blodbanken med steril PBS till en 50 ml rör (01:01-förhållande av blod med PBS). Varva utspätt blod över HISTOPAQUE lösningen mycket långsamt, och se till att blodet inte blandas med HISTOPAQUE.
- Centrifugera proverna vid 1000 xg under 20 min vid 18 ° C. Följning centrifugering, försiktigt isolera vita koncentratskiktet som innehåller vita blodkroppar och för över till en ny 50 ml tub.
- Späd celler med PBS och centrifugera igen vid 650 x g under 5 min för att samla upp cellerna.
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna i OCM (-) medium och räkna celler med hjälp av cellräknare.
- Bordläggningen och Odling PBMC
- Resuspendera cellerna i OCM (+)-medium och plattan 8 x 10 6 celler / ml per brunn i en 6-brunnsplatta eller 1 x 10 6 celler / ml per brunn i 96-brunnars platta. Tavla celler på täckglas (5 mm) som krävs för immunofluorescens avbildning samt på ben skivor lämpliga för benresorption analyser som tidigare beskrivits 20.
- Ändra odlingsmedier, påfyllning av cellerna med human M-CSF var 2-3 dagar eller vid behov. Fortsätt sedan till differentieringssteget på dag 5 genom att tillsätta 30 ng / ml av humant sRANKL tillsammans med 25 ng / ml human M-CSF i OCM (+) media för att initiera osteoclastogenesär.
- Väx celler för cirka 14 till 21 dagar för att bilda jätte multi-nukleära celler. Så fort flerkärniga celler visas, kan dessa celler sedan märkas för TRAP, och vid full mognad, kan funktionella analyser utföras. F-aktin ringar kan visualiseras på täckglas med användning av falloidin-färgning. Cell morfologi kan undersökas i celler kopplade till dentin skivor av SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här är en ny gen överföringsteknik för differentiering av osteoklaster in vivo-och cellodlings protokoll för differentiering av prekursorceller i osteoklaster in vitro som en metod för att studera effekterna av cytokiner på osteoclastogenesis beskrivs. I fig. 1 är de representativa resultat av framgångsrik genöverföring av GFP och mus sRANKL MC i möss visas. I figur 2, är representativa bilder av benmärg från mus eller humana PBMC-celldifferentiering tidsförlopps kulturer av prekursorceller till osteoklaster från ljusfältsmikroskopi visas. Figur 3 är de representativa bilder från tre oberoende metoder för karakterisering av mus benmärgs härrörande osteoklaster visad . Närvaron av mus sRANKL aktiverar uttrycket av TRAP (fig. 3A och B) och bildandet av F-aktin ringarna (figurerna 3C och D). Scanning electron mikroskopi (SEM) visar att mus sRANKL inducerar bildningen av jätteceller med förmåga att resorberande ben (fig 3E och F). Figur 4, samma karakteriseringsmetoder på humana PBMC härledda osteoklaster är visade.
Figur 1. SRANKL in vivo genöverföring leder till ökad osteoclastogenesis. Främre bild av A, B) mus lever explants och C, D) hela kroppen bilder av 12 veckor gamla C57BL / 6 hanmöss injicerades med 5 pg av GFP eller sRANKL MC DNA. Pilen visar GFP-uttryck in vivo i GFP genöverföring mus. RANKL genöverföring möss fungerar som ingen bakgrund fluorescens. Bilder som tagits med Maestro 2 Imager, en dag efter genöverföring (röd och grön deNote bakgrund och GFP, respektive). E) Plasmid karta över sRANKL MC-DNA-konstruktion och F) sRANKL nivån i serum analyserades vid 1, 5 och 11 dagar efter GFP eller sRANKL genöverföring. G) musserum TRACP5b nivå analyseras 11 dagar efter GFP eller sRANKL genöverföring. Skalstrecken anger 5 mm i A, B, och 10 mm i C, D.
Figur 2. In vitro osteoklastogenes i både mus-och cellkultursystem mänskliga. Bright-field mikroskopi av mus-celler isolerade från benmärg och odlades i närvaro av 25 ng / ml mus-M-CSF och 30 ng / ml mus sRANKL visar en differentiering tidsförloppet vid dagarna A), 2 B) 5 och C) 8. Ljusfält mikroskopi av mänskliga celler som isoleratsfrån perifert blod och odlas i närvaro av 25 ng / ml human M-CSF och 30 ng / ml humant sRANKL visar en differentierings tidsförloppet vid dagarna D), 4 E) 14, och F) 21. Skalstrecken anger 20 um.
Figur 3. Generering och karakterisering av mus-osteoklaster. TRAP-färgning (rosa) av mus-celler isolerade från benmärg och odlades under 6 dagar i närvaro av a) 25 ng / ml mus-M-CSF eller B) 25 ng / ml mus-M -CSF och 30 ng / ml mus sRANKL. Phalloidin (grön) och DAPI (blått) färgning av mus-celler isolerade från benmärg och odlades under 8 dagar i närvaro av C) 25 ng / ml mus-M-CSF eller D) 25 ng / ml mus-M-CSF och 30 ng / ml mus sRANKL visar bildandet av Factin ring i multinukleära celler. SEM-mikrofotogram av mus-celler isolerade från benmärg och odlades under 8 dagar i närvaro av E) 25 ng / ml mus-M-CSF eller F) 25 ng / ml mus-M-CSF och 30 ng / ml mus sRANKL visar bildningen av resorption områden på benvävnad som indikeras av pilarna. Skala Staplarna anger 40 mikrometer i AD, och 30 nm i E, F
Figur 4. Generering och karaktärisering av humana osteoklaster. TRAP-färgning (rosa) av humana celler som isolerats från PBMC och odlades under 15 dagar i närvaro av a) 25 ng / ml human M-CSF eller B) 25 ng / ml human M- CSF och 30 ng / ml humant sRANKL. Phalloidin (grön) och DAPI (blått) färgning av humana celler som isolerats från PBMC och odlades under 19 dagar i närvaro av C) D) 25 ng / ml human M-CSF och 30 ng / ml humant sRANKL visande bildandet av F-aktin ringar i multinukleära celler. SEM-mikrofotografier av humana celler som isolerats från PBMC och odlades under 18 dagar i närvaro av E) 25 ng / ml human M-CSF eller F) 25 ng / ml human M-CSF och 30 ng / ml humant sRANKL visar bildningen av resorption områden på benvävnad som indikeras av pilarna. Skalstrecken anger 10 um i A, B, 20 | im i C, D 15 | im i E, F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskuloskeletala förhållanden är ledande orsakerna till sjuklighet och funktionshinder och består av över 150 sjukdomar och syndrom; drabbar cirka 90 miljoner amerikaner idag. Ledinflammation och benförstöring är dominerande inslag i muskuloskeletala förhållanden, bland annat artrit och benskörhet. Benskörhet är ett tillstånd som försvagar ben integritet, vilket ofta leder till frakturer i benet. Artrit är en kronisk, invalidiserande sjukdom som kännetecknas av inflammation i lederna som blir svullna, ömma och stela begränsande normal rörlighet och kan leda till funktionshinder. Även om patogenesen för rörelseorganens sjukdomar skiljer sig mycket från varandra, är benförstöring den övergripande gemensamt drag. Benförstöring i muskuloskeletala förhållanden är i första hand orsakas av en obalans mellan benresorption och benbildning 21,22. En terapeutisk metod är att försöka blockera kapaciteten av dessa celler för att förstöra ben
In vivo-modell som beskrivs här använder minicircles, som är små episomala DNA-vektorer (~ 4KB) befriade från bakterie ryggrad, som även fungerar som transgen bärare 24. Minicircles uttrycka transgener 10-1000 faldigt högre än normala bakterie plasmider med ett stabilt uttryck i upp till flera månader. Den mindre molekylstorlek på minicircles bidrar till effektivare transfektion ränta och betydande uttryck jämför med normala bakterie plasmider 24. Därför minicircles nu i stor utsträckning i prekliniska genöverföring studier 25,26. Hydrodynamisk leverans är en väl utvecklad metod baserad på hydrodynamiska trycket i kapillärerna att leverera plasmid-DNA i hela kroppen av en mus. Hydrodynamisk gen leverans till hepatocyter via svansvenen injektion i möss är väletablerad to uttrycka transgen av plasmid-DNA 6. I dessa studier, som överuttrycker mus sRANKL i in vivo-musmodellen uppnås genom sRANKL MC och hydrodynamisk leverans via svansvenen injektioner. Mus sRANKL ELISA kan användas för att detektera serumnivåer av RANKL i möss. Signifikant höjning av musserum TRACP5b, en benresorptionsmarkören 27, observeras i sRANKL genöverföring möss. Noterbart är denna teknik inte begränsat till överexpression av sRANKL; det kan även appliceras ytterligare för att överuttrycka andra utsöndrade proteiner 28. Den primära teknisk svårighet i detta förfarande är den hydrodynamiska leverans via svansvenen. Förutom vanlig svansvenen injektion, kräver hydrodynamiska leverans leverans av minicircles i stora volymer av fysiologisk lösning i mössen inom 5-7 sek. Således stadig hantering och injektionsteknik är avgörande för att lyckas med detta förfarande. Generera sRANKL transgena möss är en annan metod för in vivo osteoclastogenesis. Emellertid kan en hög nivå av sRANKL leder till embryonal dödlighet 4 och alstring av transgena möss är också dyrt och tidskrävande.
I OVX gnagarmodell både inflammatoriska cytokiner, såsom TNF, IL-1 och IL-6 och de icke-inflammatoriska cytokin sRANKL bidra till in vivo osteoklastogenes och benförlust. sRANKL genöverföring modell leder till överexpression av endast den icke-inflammatorisk cytokin sRANKL. Därför sRANKL genöverföring modell som beskrivs här ger forskare ett kraftfullt verktyg för att undersöka i vilken utsträckning den RANKL-rank-axeln i benremodellering i frånvaro av inflammation.
En in vitro osteoclast odlingsmetoden, som innebär samtidig odling benmärgsceller och osteoblaster, bildades i slutet av 1980 innan upptäckten av RANKL i slutet av 1990 är 29,30. Rekombinant M-CSF och RANKL inducerar osteoklastdifferentiering effektivt in vitro ennd metoden har tidigare beskrivits i andra studier 3,31. M-CSF är känt för att stimulera RANK expression i tidiga osteoklastprekursorer 32 och för att verka som en överlevnadsfaktor för osteoklastprekursorer och mogna osteoklaster 33. RANKL är viktigt för osteoklastdifferentiering och aktivering 3. Här är den metod för in vitro osteoclastogenesis beskrivas. Framgångsrik odling och differentiering av prekursorceller till osteoklaster kräver steril cellisolering och ordentlig plätering tekniker samt noggrann förståelse för tidscellskörd. Beräknat plätering av cellerna är avgörande eftersom osteoklastdifferentiering kräver fusion av osteoklasternas prekursorceller 34 och ett otillräckligt antal osteoklast prekursorceller inte kommer att underlätta fusion och differentiering av prekursorceller i osteoklaster. Likaså ett överskott antal osteoclast prekursorceller, leder till klumpar bildas och slutligen celldöd. Borttagning av ickevidhäftande celler 2 h efter utstrykning av celler kan bidra till att upprätthålla en optimal cellantalet. Slutligen är det dags för cellskörd avgörande som osteoklaster är terminalt differentierade kortlivade celler med en livslängd på cirka 48 timmar 35. Därför bör celler skördas inom 48 timmar efter den första observationen av flerkärniga celler. Dessa celler kan sedan karakteriseras av TRAP och F-aktin-färgning genom immunhistokemi och benresorption aktivitet kan detekteras genom svepelektronmikroskopi (SEM). Dessa experimentella metoder möjliggör tydlig definition av osteoklaster i termer av deras fenotyp och funktion.
In vivo och in vitro-metoder som beskrivs här kommer att underlätta utvecklingen av osteoklast hämmare för närvarande i prekliniska studier, vilket leder till effektiva terapeutiska strategier för de miljontals benskörhet och artrit patienter världen över.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N.
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J.
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
