Introduction
Doenças músculo-esqueléticas afectam milhões de pessoas nos Estados Unidos e apresentar conseqüências graves para os sistemas nacionais e locais de saúde 1. Estes distúrbios são caracterizados por perda de massa óssea e da função articular que requerem tratamento extensivo e longos períodos de recuperação. Vulgarmente, um aumento relativo no número e / ou actividade dos osteoclastos, as células especializadas para reabsorver osso, na osteoporose e artrite observadas é 2. Sob condições fisiológicas, o número e a actividade dos osteoclastos é regulada pelo activador do receptor do factor nuclear κ-B ligando (RANKL), o qual é produzido por osteoblastos. A osteoprotegerina (OPG), um receptor de engodo para RANKL também é produzido por osteoblastos três modelos animais in vivo que envolvem a sobre-expressão sistémica de sRANKL, ou deleção de OPG são muito valiosas na pesquisa de osteoporose.; No entanto, estes métodos requerem a geração de ratinhos transgénicos 4,5. Aqui, uma nova alternativaMétodo de overexpressing sRANKL para o estudo de desordens relacionadas com musculoesqueléticas é descrito. Especificamente, minicírculo (MC) a tecnologia de DNA e métodos de entrega hidrodinâmicas foram utilizadas para conseguir a transferência do gene de sRANKL in vivo e sobre-expressar rato sRANKL sistemicamente 6.
Este método também é complementar a outros modelos in vivo de osteoporose, tais como a modulação hormonal de osteoclastos seguintes ovariectomia 7 e a intervenção dietética com uma dieta pobre em cálcio 8. Estes modelos são muito úteis para estudar os diferentes aspectos de distúrbios osteomusculares relacionados ao porém eles necessitam de procedimentos cirúrgicos e pode demorar até vários meses, a um custo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedor é um modelo animal experimental em que a remoção dos ovários leva à deficiência de estrogênio imitando assim osteoporose pós-menopausa humana 10. Human osteoporose pós-menopausa, uma condição em que o estrogênio Deficiparência leva ao aumento do risco de fraturas ósseas e osteoporose afeta cerca de oito milhões de mulheres nos Estados Unidos. Embora o modelo de OVX é útil para a osteoporose pós-menopausa que oferece vantagens limitadas em estudar a osteoporose em geral. Estrogen suprime a perda óssea, induzindo a inibição de osteoclastos e osteoblastos apoptose, portanto, na sua ausência de um aumento da actividade dos osteoclastos é observada 10-12. A relação de desequilíbrio RANKL-OPG que favorece a reabsorção óssea também é observada 13. No entanto, a deficiência de estrogénio, in vivo, também é acompanhada por uma diminuição dos níveis de factor de crescimento transformante β (TGF β), o aumento da interleucina-7 (IL-7) e de TNF, IL-1 e IL-6, 14,15. Como estas citocinas conhecidas funções moduladores de remodelação óssea independente da via de RANKL, é impossível atribuir qualquer activação dos osteoclastos unicamente ao eixo RANKL-RANK. O modelo descrito neste trabalho permite aos pesquisadores estudar em vivo eixo RANKL-RANK na osteoclastogênese e perda óssea sem citocinas pró-inflamatórias em comparação com modelos de roedores OVX.
Além disso, técnicas in vitro osteoclastogênese são ferramentas essenciais para estudar a ativação dos osteoclastos para potenciais tratamentos terapêuticos de doenças músculo-esqueléticas. Estudos anteriores também mostraram que a cultura de medula óssea do rato macrófagos derivados (BMMs) com o mouse macrófagos fator estimulador de colônias (M-CSF) e mouse sRANKL pode levar a diferenciação de osteoclastos 3,16,17. Aqui, os protocolos de produção de células semelhantes a osteoclastos multinucleadas da medula óssea de rato, bem como a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro, 18 encontram-se descritos. Os ensaios baseados em células necessárias para definir um osteoclasto terminalmente diferenciadas e totalmente funcional madura também são descritas resumidamente. Estas técnicas in vitro complementar o romance em abordagem vivo e servem como pinstrumentos de investigação owerful para estudar a diferenciação dos osteoclastos e ativação. Utilizando estes sistemas, os cientistas são capazes de gerar os osteoclastos in vivo e in vitro e definir os estímulos e sinais necessários para a sua proliferação e activação, assim como testar a eficácia dos inibidores farmacológicos e biológicos.
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Protocol
1. Entrega hidrodinâmica de sRANKL DNA MC
- Entrega hidrodinâmica via mouse cauda Veia
- Pesar o mouse antes da injeção veia da cauda. Diluir sRANKL ou proteína fluorescente verde (GFP) de MC em solução de Ringer (pré-aquecer a 37 ° C) em um volume total de ~ 10% do peso do corpo do rato.
- Aqueça o rato em uma gaiola por 10 min antes da injeção, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer nervuras laterais (VEs) visíveis. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia.
- Assim que os VEs estão dilatados e visíveis, transferir o mouse para o limitador e insira a ficha longe o suficiente para o barril para conter o movimento. Monitorar o mouse para a atividade normal, como respirar. Ajuste a ficha do limitador, se necessário.
- Desinfectar a zona da injecção de 3/4 a partir da ponta da cauda com um algodão embebido em álcool. Use uma agulha G 27-30 para mouse injeção veia da cauda. Segure a cauda firmemente com uma mão e inserir a agulha emna veia da cauda. Aplique pressão na seringa e completar a injeção dentro de 5-7 seg.
- Retire a agulha da veia da cauda e aplicar pressão com uma bola de algodão no local da injeção para parar o sangramento. Monitorar o mouse por 15-30 min, em seguida, transferir o mouse de volta ao viveiro uma vez que a taxa de respiração é reduzida para a taxa normal.
- A confirmação da sistêmica Rato sRANKL Expressão e Quantificação de Rato Serum TRACP5b Mensagem Gene Transferência
- Aqueça o rato em uma gaiola por 5-10 min, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer LVs visível. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia.
- Fazer uma pequena incisão com uma lâmina de cauda do rato num sítio uma frente a partir da ponta da cauda.
- Colete aproximadamente 100 mL de sangue em tubos de separação de soro.
- Incubar os tubos de separação de soro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 minutos e recolher soro. Store soro de -80 ° C para posterior análise.
- Realizar sRANKL ELISA e ensaio do rato TRACP5b soro em amostras de soro usando um kit comercial disponível.
2. Geração in vitro de osteoclastos de rato BMMs
- O isolamento e cultura de BMMs
- Isolamento da tíbia e os ossos do fêmur: Eutanásia o mouse doador com CO2, e desinfectar as pernas com etanol 70%. Dissecar a partir do osso púbico até o osso calcâneo, para remover o fêmur ea tíbia ossos intactos.
- Retirar a pele e músculo cuidadosamente sem danificar o osso. Coloque fémur e tíbia processada em uma placa de Petri contendo tampão de fosfato salina (PBS).
- Remoção de medula óssea: Corte a ponta de um lado do fêmur e da tíbia ossos e expulsar da medula óssea em um tubo de 50 ml utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 25 G, carregado com α-MEM contendo 1% de penicilina / estreptomicina (Osteoclasto Meio de Cultura / OCM).
- Culturas de macrófagos
- Contar as células usando um hemocitômetro ou contador automático de células.
- Placa 1 x 10 6 culas por po para uma placa de 6 poços ou 3 x 10 5 células de lamelas de vidro (5 mm) ou fatias de dentina colocadas em placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C.
- Aspirar todo o meio contendo células não aderentes e as células incubar a 37 ° C com nova OCM (+) contendo 25 ng / ml de rato M-CSF durante 48 horas.
- Aspirar todos os meios e incubar as células a 37 ° C, com fresco OCM (+) mídia contendo 25 ng / ml rato M-CSF, e 30 ng / ml sRANKL mouse para iniciar a osteoclastogênese. Reabastecer media a cada 3 dias, conforme necessário.
- Cultivar célulasdurante aproximadamente 6-8 dias, para formar células gigantes multi-nucleares capazes de reabsorção óssea. Assim que as células multinucleadas aparecer, execute TRAP (fosfatase ácida tartarato resistente) coloração utilizando um kit comercial disponível, e quando totalmente amadurecido, realizar ensaios funcionais. Visualize anéis F-actina em lamelas usando mancha phalloidin e imagem das células aderidas à dentina fatias por microscopia eletrônica de varredura (SEM), como descrito anteriormente 19.
3. Geração in vitro de osteoclastos a partir de PBMC humanas
- Isolamento de PBMC Humano
- Adicionar 10 ml de pré-aquecido de Histopaque-1077 para um tubo de 50 ml.
- Filtro de leucócitos vazio obtido a partir do banco de sangue com PBS estéril para um tubo de 50 mL (proporção de 1:1 de sangue com PBS). Camada do sangue diluído sobre a solução histopaque muito lentamente, certificando-se de que o sangue não se mistura com o histopaque.
- Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugação, cuidadosamente isolar a camada buffy coat branco que contém as células brancas do sangue e transferir para um novo tubo de 50 ml.
- Dilui-se as células com PBS e centrifugar novamente a 650 xg durante 5 min para recolher as células.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em OCM (-) media e contagem de células utilizando contador de células.
- Chapeamento e cultivando PBMCs
- Ressuspender as células em OCM (+) e meios de placa de 8 x 10 6 células / ml por poço numa placa de 6 poços ou de 1 x 10 6 células / ml por poço em placas de 96 poços. Células da placa em lamelas de vidro (5 mm), tal como exigido para imagiologia por imunofluorescência, bem como em fatias de osso adequadas para ensaios de reabsorção óssea, como previamente descrito 20.
- Alterar meios de cultura, repondo as células com M-CSF humano a cada 2-3 dias ou quando necessário. Em seguida, avance para o passo de diferenciação no dia 5 pela adição de 30 ng / ml de sRANKL humano junto com 25 ng ml M-CSF humano / no OCM (+) de mídia para iniciar osteoclastogenesé.
- Cultivar células em, aproximadamente, 14 a 21 dias para formar células gigantes multi-nucleares. Assim que as células multinucleadas aparecer, estas células podem então ser marcados de TRAP, e quando totalmente amadurecido, ensaios funcionais podem ser realizadas. Anéis de F-actina pode ser visualizado em lamelas utilizando faloidina mancha. A morfologia das células pode ser examinado em células ligadas à dentina fatias por SEM.
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Representative Results
Aqui, uma técnica de transferência de gene novo para a diferenciação de osteoclastos in vivo e os protocolos de cultura de células para a diferenciação de células precursoras em osteoclastos in vitro, como um método para estudar os efeitos das citocinas em osteoclastogénese são descritos. Na Figura 1, os resultados representativos de transferência de gene bem sucedida da GFP e rato sRANKL MC em ratinhos são mostrados. Na Figura 2, as imagens representativas de medula óssea de ratinho ou PBMCs de diferenciação de células humanas de curso de tempo culturas de células precursoras para osteoclastos por microscopia de campo brilhante são mostrados. Figura 3, as imagens representativas de três métodos independentes para a caracterização de medula óssea de ratinho osteoclastos derivados são mostrados . A presença de rato sRANKL activa a expressão do TRAP (Figura 3A e B) e a formação de anéis de F-actina (Figuras 3C e D). Digitalização elecmicroscopia tron (SEM) revela que rato sRANKL induz a formação de células gigantes capazes de reabsorção do osso (Figuras 3E e F). Figura 4, os mesmos métodos de caracterização de CMSP humanas derivadas osteoclastos são mostrados.
Figura 1. SRANKL in vivo gene transfer leva ao aumento da osteoclastogénese. Vista anterior de A, B) de explantes de fígado de rato e C, D), as imagens de corpo inteiro de 12 semanas de idade C57BL / 6, machos injectados com 5 ug de GFP ou sRANKL DNA MC. A seta indica a expressão da GFP em transferência in vivo do gene da GFP do rato. Camundongos transferência de genes RANKL servir como nenhum fundo de fluorescência. As imagens capturadas pelo Maestro 2 Imager, um dia pós-transferência de gene (d vermelho e verdefundo enote e GFP, respectivamente). mapa E) O plasmídeo de sRANKL construto MC-ADN e F) sRANKL nível no soro analisado em 1, 5 e 11 dias após a transferência do gene GFP ou sRANKL. G) Rato nível TRACP5b soro analisadas 11 dias após a transferência de gene GFP ou sRANKL. As barras de escala indicam a 5 mm A, B, e 10 mm de C, D.
In vitro osteoclastogénese Figura 2. Em ambos os sistemas de cultura de células humanas e de ratinho de microscopia de campo brilhante de células de rato isoladas a partir de medula óssea e cultivada na presença de 25 ng / ml de rato M-CSF e 30 ng / ml sRANKL rato mostrando uma diferenciação. Naturalmente o tempo em dias A), B 2) 5, e C) 8. Microscopia de campo claro de células humanas isoladasa partir de sangue periférico e cultivadas na presença de 25 ng / mL de M-CSF humano e 30 ng sRANKL humano ml / exibindo um curso de tempo de diferenciação no dia D), 4 E) de 14, e F) 21. As barras de escala indicam 20 um.
Figura 3. Geração e caracterização de osteoclastos de rato coloração. TRAP (rosa) de células de rato isoladas a partir de medula óssea e cultivadas durante 6 dias na presença de A) 25 ng / ml de rato M-CSF ou B) ratinho 25 ng / ml M -CSF e 30 ng / ml sRANKL mouse. Faloidina (verde) e DAPI (azul) de coloração de células de rato isoladas a partir de medula óssea e cultivadas durante 8 dias na presença de C) 25 ng / ml de rato M-CSF ou D) de 25 ng / ml de rato M-CSF e 30 ng / ml sRANKL rato, mostrando a formação de Factin anel em células multinucleadas. Micrografias de células de rato isoladas a partir de medula óssea e cultivada durante 8 dias na presença de E), 25 ng / ml de rato M-CSF ou M) 25 ng / ml de rato M-CSF e 30 ng / ml de ratinho sRANKL que mostra a formação de áreas de reabsorção no osso, tal como indicado pelas setas. As barras de escala indicam 40 mM em AD, e 30 mM em E, F.
Coloração Figura 4. Geração e caracterização de osteoclastos humanos. TRAP (rosa) de células humanas isoladas a partir de PBMC e cultivadas durante 15 dias na presença de A) 25 ng / mL de M-CSF humano ou B) de 25 ng / ml humano M- CSF e 30 ng sRANKL humano ml /. Faloidina (verde) e DAPI (azul) de coloração de células humanas isoladas a partir de PBMC e cultivadas durante 19 dias na presença de C) D) de 25 ng / mL de M-CSF humano e 30 ng / ml sRANKL humano, mostrando a formação de anéis de F-actina em células multinucleadas. Micrografias de células humanas isoladas a partir de PBMC e cultivadas durante 18 dias na presença de E) de 25 ng / mL de M-CSF humano ou F) 25 ng / mL de M-CSF humano e 30 ng / ml sRANKL humano, mostrando a formação de reabsorção áreas de osso, tal como indicado pelas setas. As barras de escala indicam 10 mM em A, B, 20 mM de C, D 15 mm em E, F.
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Discussion
Condições músculo-esqueléticas são as principais causas de morbidade e incapacidade e são compostas de mais de 150 doenças e síndromes; afetando cerca de 90 milhões de americanos hoje. Inflamação das articulações e destruição óssea são características predominantes de doenças músculo-esqueléticas, incluindo artrite e osteoporose. A osteoporose é uma condição que enfraquece a integridade óssea, muitas vezes levando a fraturas do osso. A artrite é uma doença crônica, debilitante doença caracterizada pela inflamação das articulações que se tornam inchados, concurso e movimento normal dura de restrição e podem levar à invalidez. Embora a patogênese de doenças músculo-esqueléticas é muito diferente um do outro, a destruição óssea é a característica comum abrangente. Destruição óssea em condições músculo-esqueléticas é causada principalmente por um desequilíbrio entre a reabsorção óssea e formação óssea 21,22. Uma abordagem terapêutica é a tentativa de bloquear a capacidade destas células para destruir o osso
O modelo in vivo descrito aqui utiliza minicirculos, que são pequenas vectores epissomais de ADN (~ 4KB) libertados do esqueleto bacteriana, que também servem como transportadores de transgenes 24. Minicírculos expressar transgenes 10-1000 vezes maior, em seguida, plasmídeos bacterianos normais com uma expressão estável por até vários meses. O tamanho molecular menor do minicirculos contribui para a taxa de transfecção mais eficaz e expressão substancial comparar a plasmídeos bacterianos normais 24. Portanto, minicírculos são agora amplamente aplicado em estudos de transferência de genes pré-clínicos 25,26. Entrega hidrodinâmica é um método bem desenvolvido com base na pressão hidrodinâmica nos capilares para entregar o ADN de plasmídeo em todo o corpo de um ratinho. Entrega gene hidrodinâmica para hepatócitos via injeção na veia da cauda em ratos é bem estabelecida tO transgene expresso pelo plasmídeo de ADN 6. Nestes estudos, a superexpressão de rato sRANKL in vivo no modelo do rato é conseguido por sRANKL MC e entrega hidrodinâmica através de injecções na veia da cauda. Rato sRANKL ELISA podem ser utilizados para detectar os níveis séricos de RANKL em ratinhos. Elevação significativa de TRACP5b soro de ratinho, um marcador da reabsorção óssea 27, é observada em ratinhos de transferência de genes sRANKL. Notavelmente, esta técnica não é limitada à superexpressão do sRANKL; ele também pode ser aplicada após a sobre-expressam outras proteínas secretadas 28. A dificuldade técnica principal deste procedimento é a entrega hidrodinâmico através da veia da cauda. Para além da injecção regular de veia da cauda, a entrega hidrodinâmico requer a entrega de minicirculos em grandes volumes de solução fisiológica nos ratinhos dentro de 5-7 segundos. Assim, técnicas de manuseio e injeção constante são essenciais para o sucesso com este procedimento. Gerando camundongos transgênicos sRANKL é uma outra abordagem para in vivo osteoclastogenesis. No entanto, um elevado nível de sRANKL pode levar a letalidade embrionária 4 e gerar ratinhos transgénicos também é dispendiosa e demorada.
No modelo de roedores OVX, citocinas inflamatórias, tais como TNF, IL-1 e IL-6 e as sRANKL não-inflamatórias de citocinas contribuem para a osteoclastogénese vivo e perda óssea. sRANKL modelo de transferência de gene leva à sobre-expressão de apenas a sRANKL não citoquinas inflamatórias. Portanto, o modelo de transferência de gene sRANKL descrita aqui oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para analisar a contribuição do eixo RANKL-RANK na remodelação óssea na ausência de inflamação.
Um método de cultura de osteoclastos in vitro, que envolve as células da medula óssea e osteoblastos co-cultura, foi criada no final de 1980, antes da descoberta de RANKL no final de 1990 de 29,30. M-CSF recombinante e RANKL induzir a diferenciação de osteoclastos eficientemente in vitro umnd o método foi previamente descrito em outros estudos 3,31. M-CSF é conhecido por estimular a expressão RANK em precursores de osteoclastos primeiros 32 e para atuar como um fator de sobrevivência para precursores de osteoclastos e osteoclastos maduros 33. RANKL é essencial para a diferenciação dos osteoclastos e ativação 3. Aqui, o método de ensaio in vitro é descrito osteoclastogénese. Cultura de sucesso e diferenciação de células precursoras de osteoclastos exigem isolamento de células estéreis e técnicas de revestimento adequados, bem como a compreensão cuidadosa de colheita de células cronometrado. Plaqueamento calculada das células é crucial porque a diferenciação de osteoclastos requer a fusão de células precursoras de osteoclastos 34 e um número insuficiente de células precursoras de osteoclastos não irá facilitar a fusão e diferenciação das células precursoras em osteoclastos. Da mesma forma, um número excessivo de células precursoras de osteoclastos, leva a aglutinar-se a formação e eventual morte celular. A remoção do nãocélulas aderentes 2 h após o plaqueamento das células pode ajudar a manter uma óptima o número de células. Por fim, o tempo de colheita de células é crucial como osteoclastos são as células terminais de curta duração diferenciados, com uma vida útil de cerca de 48 horas 35. Assim, as células devem ser colhidas dentro de 48 horas após a primeira observação de células multinucleadas. Estas células podem então ser caracterizados por TRAP e coloração de F-actina por imuno-histoquímica e osso actividade reabsorção pode ser detectado por microscopia electrónica de varrimento (MEV). Essas abordagens experimentais permitir definição clara de osteoclastos em termos de seu fenótipo e função.
A in vivo e in vitro técnicas descritas aqui irá facilitar o desenvolvimento de inibidores de osteoclastos actualmente em estudos pré-clínicos, que conduz para estratégias terapêuticas eficazes para os milhões de osteoporose e artrite pacientes em todo o mundo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
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